需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种基于快速滤插件的三维培养系统用于原代前列腺细胞分化

8.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55279

⸱

2017年2月13日

 ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, 2Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种快速建立的方法 体外 支持原代前列腺上皮细胞三维培养及其腔面分化的系统。

摘要

条件重编程细胞（CRCs）提供了一种可持续的原代细胞培养方法，并能够大规模扩增细胞 "活体生物样本库" 患者来源细胞系。对于多种类型的上皮细胞，已有多种支持其更好分化状态的三维（3D）培养方法被报道。尽管结直肠癌细胞系（CRCs）在分离后仍保持其来源组织的谱系特性，但在常规二维（2D）培养条件下，它们无法表达许多与原始组织相关的分化标志物。为了增强患者来源的CRCs在前列腺癌研究中的应用，已建立一种三维（3D）培养体系，可在正常及肿瘤来源的前列腺上皮细胞中实现快速（总计2周）的腔面细胞分化。本文中， a 基于滤膜小室的培养方法被用于正常及恶性前列腺CRC细胞的培养与分化。本文提供了细胞收集及处理以进行免疫组织化学和免疫荧光染色的详细操作步骤。综上所述，所描述的三维培养体系结合原代CRC细胞系，为基于生物样本的前列腺研究提供了一个重要的中高通量模型系统。

引言

针对个体化癌症治疗方案的发现与应用是癌症研究的主要目标之一。近年来，一些新方法的开发使得原代细胞培养的建立更加便捷，有望为个体化治疗方案的识别与测试提供新途径。例如，基于R-spondin的前列腺类器官培养方法1可在商用细胞外基质（例如，Matrigel）中实现正常及转移性前列腺癌细胞的三维（3D）培养，而乔治城大学开发的细胞条件重编程（Conditionally Reprogramming of Cells, CRC）方法2,3则采用更为标准的二维（2D）培养条件。具体而言，Rho激酶抑制剂（Y-27632）与经辐照处理的J2小鼠成纤维细胞饲养层细胞联合使用，可实现角质形成细胞CRC的无限期培养2。CRC技术具有极高的稳健性，已成功从前列腺以及多种其他正常和恶性上皮组织中建立并无限期维持原代细胞系3。尤为重要的是，我们利用CRC技术快速确定了一例既往多种药物治疗失败的复发性呼吸道乳头状瘤患者的病因。此外，通过使用正常组织和肿瘤来源的CRC细胞，在组织活检后两周内成功鉴定出一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物——伏立诺他（vorinostat）。患者接受伏立诺他治疗后，疾病得到了有效控制4。

正常的前列腺腺体由腔面细胞、基底细胞以及稀有的神经内分泌细胞组成5腔面细胞构成腺体的柱状上皮层，表达雄激素受体（AR）以及其他腔面标志物，如细胞角蛋白8和18以及前列腺特异性抗原（PSA）。6相反，基底细胞位于腔面层下方，表达细胞角蛋白5和p63，但雄激素受体（AR）水平较低5。我们7,8,9 及其他人10 已成功将前列腺类器官（CRCs）用于临床前药物敏感性机制研究。然而，在标准的二维组织培养条件下，这些细胞无法充分激活雄激素受体（AR）信号通路。10重要的是，当将结直肠癌细胞（CRCs）置于免疫缺陷小鼠的肾包膜下时，这些细胞恢复了正常的前列腺腺体结构和功能，表明在允许性环境中，前列腺来源的CRCs仍保持其谱系定向。本文所述基于滤膜插入式培养系统的建立，使得快速（2周内） 体外 前列腺CRCs的分化，表现为AR及其靶基因表达增加以及p63水平降低。

所使用的滤膜插件含有聚碳酸酯膜（孔径为 0.4 µm），可支持哺乳动物细胞的培养。该系统在开发过程中采用了正常和恶性的前列腺 CRC 细胞、6 孔培养板以及滤膜插件。底部培养室中加入由 J2 细胞条件化处理的细胞培养基11，顶部培养室中则加入前列腺分化培养基。本文所述技术可在两周时间内支持前列腺腔面细胞的分化，符合个体化医学的研究目标。同时，建立能够对培养细胞进行全面的分子、遗传和细胞水平分析的方法也至关重要。已开发并优化了从滤膜表面释放的细胞中提取 DNA、RNA 和蛋白质的技术流程，以确保样本处理的准确性和可重复性。最后，本文还详细描述了移除滤膜以进行包埋、切片，以及苏木精-伊红（H&E）、免疫组织化学和免疫荧光染色所需的方法学步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 建立三维细胞培养插件系统

  1. 将2个聚碳酸酯细胞培养小室以倒置方向（滤膜面朝上）放入6孔板中（图1A）。
  2. 在小室底面均匀涂布一层0.1%明胶水溶液，置于生物安全柜中干燥（10–20分钟），以保持无菌状态。
  3. 重复步骤1.2两次，共在小室上涂布三层0.1%明胶。
    注意：明胶包被有助于限制各腔室之间的扩散。
  4. 为从常规培养条件下收集原代结直肠癌细胞（CRCs），向培养瓶中加入5 mL PBS进行洗涤。
    1. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行消化（T-25培养瓶用1 mL，T-75培养瓶用2 mL），37 °C孵育5分钟。轻轻敲击培养瓶侧面以促进细胞脱落。随后加入5 mL完全DMEM培养基终止消化反应，并收集细胞。
    2. 将细胞收集至15 mL离心管中，在4 °C下以188 × g离心，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
    3. 将600,000个CRCs重悬于250 μL条件培养基（CM）中，加入方向正确（滤膜面朝下）的培养小室（图1B）。此部分称为内腔室。
      注意：CM为经辐照J2细胞条件化处理的F-培养基，其中含有10 μm Y-27632，具体制备方法见先前文献7,8,9,11。
  5. 向6孔板的外腔室中加入2 mL CM，于37 °C孵育过夜（至少18小时）。
  6. 使用1 mL或200 μL移液器小心移除内腔室中的CM，再用1 mL移液器缓慢向内腔室中加入分化培养基（DM）至充满，注意避免扰动细胞层。

3D 培养物的维持

  1. 每天检查培养物。健康的细胞形态如图2所示。
  2. 根据细胞的代谢情况，每天或每隔一天更换外室的培养基（CM）。
  3. 当内室培养基颜色变为黄色时，用1 mL或200 μL移液器小心移除内层滤膜室中的培养基。
  4. 使用吸头将外层6孔板室中的培养基吸除。
  5. 使用1 mL移液器，缓慢将新鲜的DM加入内室直至充满。注意不要刮擦或扰动细胞层。
  6. 用2 mL新鲜CM替换外室中的培养基。
  7. 维持培养2周后，进行后续目标生物分子的分离处理。
    注意：每次实验应处理6孔板中的每一行，共六个插入式培养插件（图1B），以获得足量的细胞用于DNA、RNA或蛋白质分析。
  8. 吸除外室中的培养基，并用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。
  9. 用1 mL或200 μL移液器小心移除内室中的培养基，加入500 μL PBS。避免刮擦或扰动膜上的细胞。
  10. 吸除外室中的PBS，并用1 mL或200 μL移液器小心移除内室中的PBS。一旦PBS被完全移除，应立即进行下述相应的实验操作。切勿让膜干燥。若操作尚未准备就绪，可短暂将培养物保留在PBS中等待。

3. 滤膜处理以实现沉淀富集

  1. 向每个内室加入 100 μL  0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟。
  2. 使用 200 μL 移液枪轻轻吹打或刮擦膜表面的细胞，同时上下吹吸（避免刺穿膜）。于 37 °C 再孵育 1 分钟。
  3. 向第一个内室加入 250 μL CM，并轻柔地上下吹吸以冲洗滤膜。
  4. 将重悬的细胞转移至相邻的滤室中（该滤室含有相同的培养基条件），并重复上下吹吸操作。
  5. 对同一实验条件下所有插入式培养小室重复此操作。收集细胞并转移至 1.5 mL 离心管中。
  6. 用额外的 100–200 μL CM 冲洗每个内室，以收集残留的细胞，并加入第 3.5 步中的 1.5 mL 离心管。
  7. 在 4 °C 条件下，以 423 × g 离心 5 分钟。
  8. 吸除上清液，并用 1000 μL PBS 重悬细胞沉淀，洗涤一次。
  9. 再次在 4 °C 条件下，以 423 × g 离心 5 分钟。
  10. 吸除 PBS，将细胞沉淀于 -80 °C 冻存，以备后续使用。

4. 用于RNA或DNA提取的滤膜处理

  1. 向内室中加入 200 μL 硫氰酸胍-苯酚-氯仿或类似的提取试剂，并通过上下吹打轻轻搅动膜表面的细胞。
  2. 在室温下用干燥的外室孵育提取试剂 5 分钟。
    1. 由于滤膜可能从插入物上脱落，可通过上下吹打提取液来洗涤脱落的滤膜。通过倾斜 6 孔板并吸除残留液体，尽可能收集全部提取试剂。
  3. 按照制造商的说明书进行 DNA、RNA 或蛋白质的纯化与回收。

5. 蛋白质分离用滤膜的处理

  1. 将滤膜插入冰上的6孔板中。向内室加入10 μL蛋白裂解缓冲液，其中添加1 mM氟化钠（NaF）、1 mM钒酸钠（NaV）、100 mM二硫苏糖醇（DTT）和100 μL蛋白酶抑制剂混合物。
  2. 用20 μL移液器在膜表面反复吹打，振荡/刮取细胞。避免在裂解缓冲液中产生气泡。
  3. 将装有滤膜的6孔板置于冰上孵育10分钟。
  4. 重复刮取操作，然后用裂解缓冲液冲洗膜表面。
  5. 收集6个滤膜中的裂解液，并转移至冰上的1.5 mL离心管中。
  6. 用额外的10 μL裂解缓冲液冲洗第一个膜，并将冲洗液转移至下一个滤膜。
  7. 对所有滤膜重复步骤5.6，收集残留的裂解缓冲液并加入1.5 mL离心管（步骤5.5）。
  8. 将样品继续在冰上孵育5分钟。
  9. 在4 °C下以最大速度（台式离心机中16,873 × g）离心15分钟。
  10. 用移液器将裂解液上清转移至新的1.5 mL离心管中。
  11. 进行蛋白浓度分析，或将裂解液在-80 °C下保存。

6. H&E 染色和免疫染色的处理

  1. 向内室和外室分别加入 500 µL 和 1 mL 的 10% NBF（中性缓冲福尔马林），于 4 °C 孵育过夜。
  2. 吸除外室中的 NBF，将 1 mL 羟乙基琼脂糖（HEA）处理凝胶加入 1.5 mL 离心管中。使用低功率微波炉，以 10–20 秒的短时脉冲反复加热，直至琼脂糖完全融化。
  3. 将 HEA 置于 37 °C 水浴中保温，防止凝固，待用。
  4. 去除内室中的 NBF，向内室加入 25 μL 熔融的 HEA，静置 2–5 分钟使琼脂糖凝固。
  5. 将 2 块泡沫组织学垫片浸入 10% NBF 中润湿，并将其中一块放入包埋盒中（见图 3D）。
  6. 使用 #11 刀片手术刀（具有非常锋利的细尖刀刃），从插入室底部划开滤膜，使其部分脱离塑料插入室。
  7. 在培养皿中加入少量（100–200 μL）NBF，将部分松脱的滤膜浸入其中（图 3A）。
  8. 使用 #10 刀片手术刀，从插入室内侧轻轻按压滤膜中央，使滤膜完全脱离插入管壁（图 3B）。若滤膜仍有部分与管壁相连，用手术刀将其切断。
  9. 使用 #10 刀片手术刀将涂有 HEA 的滤膜切成两半（图 3C）。
  10. 将每半片滤膜放置于步骤 6.4 中准备好的组织学包埋盒内的泡沫垫片上（图 3D）。
  11. 将第二块浸有 10% NBF 的海绵放入包埋盒中，使滤膜夹在两块海绵之间。
  12. 盖紧包埋盒，放入 NBF 中，孵育过夜。
  13. 将滤膜按先前所述方法处理成石蜡块，用于切片和染色12。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

基于细胞培养小室的系统是一种相对简单且快速的方法，可用于培养支持腔面细胞分化的前列腺CRC三维（3D）细胞模型。该系统的示意图如（图1A）所示，图中突出显示了将明胶包被于滤膜小室底面的操作过程。小室仅在包被明胶时需翻转；在图1B中，滤膜小室已处于适合培养的正确方向。使用透明细胞培养小室时，可获得健康前列腺CRC三维培养的代表性图像（10倍放大）（图2）。如图所示，健康CRC细胞在建系后通常形成致密的多层结构，可通过标准光学显微镜观察。在初始建系阶段，观察所形成的细胞层至关重要，以确保该方法适用于特定细胞系，并确认细胞已实现适当的贴附与分层。

按照上述方法将HEA涂布于插入物内侧。涂布HEA后，需小心划痕以将滤膜从插入物中取出（图3A、3B）。在所有步骤中（图3A-3D），均需注意尽量减...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

原代细胞系是癌症研究中一个重要的、快速发展的研究平台。基于培养插件的三维培养系统可在两周时间内支持原代前列腺CRC的分化。CRC滤过法代表了一种用于前列腺研究的新型中通量方法。现有的小鼠PDX模型耗时长且成本极高，且许多PDX样本无法在体外培养中生长，限制了研究者自主开展的实验及其应用价值。此外，尽管建立PDX模型的成功率差异很大13，但CRC方法在建立细胞系方面具有较高的成功率3。我们认为本系统可作为R-spondin依赖性前列腺类器官方法的有益补充；然而，已有报道指出，从原发性前列腺癌组织建立类器官的成功率较低14。此外，CRC的培养基、建系方法及维持条件均显著简化，优于R-spondin依赖性前列腺类器官方法。另一个优势在于，CRC可用于建立并测试配对的正常组织与肿瘤组织培养物，从而实现直接的分子水平比较。

在建立该系统时，仍有一些技术问题需要解决。首先，应用于滤膜插件底部的明胶涂层虽有助于减少培养基在膜两侧的扩散，但无法完全消除。频...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了T32(CA 9686-18)和TL1 (TL1TR001431)博士后培训基金（LT）、美国国防部PC140268项目（CA）、W81XWH-13-1-0327项目（CA）、TR000102-04项目（CA），以及U01 PAR-12-095项目（Kumar）和P30 CA051008-21项目（Weiner）的资助。样本的固定、切片和染色工作在Lombardi综合癌症中心组织学与组织共享资源实验室完成。我们感谢Richard Schlegel提供的有益讨论。本内容完全由作者负责，不代表美国国家癌症研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Corning Costar Snapwell 培养小室Corning3801
Millicell 细胞培养小室MilliporePIHP01250
多孔板 6 孔Falcon353046
0.1% 明胶水溶液Stemcell Technologies7903
无菌安全手术刀 10 号刀片Integra Miltex4-510
无菌标准手术刀 11 号刀片Integra Miltex4411
RIPA 裂解与提取缓冲液Thermofisher Scientific89900
氟化钠Fishcer ScientificS299-100
钒酸钠Fishcer Scientific13721-39-6
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich3483123
蛋白酶抑制剂混合物（AEBSF、抑肽酶、Bestatin、E-64、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂 A）Sigma-AldrichP8340
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）Thermofisher Scientific25200-056
DMEMThermofisher Scientific11965-092
FBSSigma-AldrichF2442
谷氨酰胺Thermofisher Scientific25030081 
青霉素-链霉素Thermofisher Scientific15140-122
F-12 营养混合培养基Thermofisher Scientific11765054
Y-27632 二盐酸盐 ROCK 抑制剂EnzoALX-270-333-M025
氢化可的松Sigma-AldrichH0888
EGFThermofisher ScientificPHG0315
胰岛素Thermofisher Scientific12585-014
霍乱毒素Sigma-AldrichC3012
庆大霉素Thermofisher Scientific15710-064
两性霉素 B（Fungizone）Fisher ScientificBP264550
Trizol 试剂Invitrogen15596026
Histogel 标本处理凝胶（羟乙基琼脂糖，HEA）Thermo ScientificHG-4000-012
非粘附性敷料TelfaKDL2132Z
细胞培养皿SigmaSIAL0167
HISTOSETTE II 组织处理/包埋盒CrystalgenCG-M492

参考文献

  1. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  2. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  3. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
  4. Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
  5. Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
  6. Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
  7. Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
  8. Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
  9. Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
  10. Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
  11. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  12. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868(2015).
  13. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  14. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

滤器插入培养三维细胞培养原代前列腺细胞条件重编程细胞细胞收集与处理免疫组织化学染色免疫荧光染色生物分子分离组织学切片
一种基于快速滤插件的三维培养系统用于原代前列腺细胞分化
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。