一种基于快速滤插件的三维培养系统用于原代前列腺细胞分化

摘要

在此，我们介绍一种快速建立的方法 体外 支持原代前列腺上皮细胞三维培养及其腔面分化的系统。

摘要

条件重编程细胞（CRCs）提供了一种可持续的原代细胞培养方法，并能够大规模扩增细胞 "活体生物样本库" 患者来源细胞系。对于多种类型的上皮细胞，已有多种支持其更好分化状态的三维（3D）培养方法被报道。尽管结直肠癌细胞系（CRCs）在分离后仍保持其来源组织的谱系特性，但在常规二维（2D）培养条件下，它们无法表达许多与原始组织相关的分化标志物。为了增强患者来源的CRCs在前列腺癌研究中的应用，已建立一种三维（3D）培养体系，可在正常及肿瘤来源的前列腺上皮细胞中实现快速（总计2周）的腔面细胞分化。本文中， a 基于滤膜小室的培养方法被用于正常及恶性前列腺CRC细胞的培养与分化。本文提供了细胞收集及处理以进行免疫组织化学和免疫荧光染色的详细操作步骤。综上所述，所描述的三维培养体系结合原代CRC细胞系，为基于生物样本的前列腺研究提供了一个重要的中高通量模型系统。

引言

针对个体化癌症治疗方案的发现与应用是癌症研究的主要目标之一。近年来，一些新方法的开发使得原代细胞培养的建立更加便捷，有望为个体化治疗方案的识别与测试提供新途径。例如，基于R-spondin的前列腺类器官培养方法¹可在商用细胞外基质（例如，Matrigel）中实现正常及转移性前列腺癌细胞的三维（3D）培养，而乔治城大学开发的细胞条件重编程（Conditionally Reprogramming of Cells, CRC）方法^2,3则采用更为标准的二维（2D）培养条件。具体而言，Rho激酶抑制剂（Y-27632）与经辐照处理的J2小鼠成纤维细胞饲养层细胞联合使用，可实现角质形成细胞CRC的无限期培养²。CRC技术具有极高的稳健性，已成功从前列腺以及多种其他正常和恶性上皮组织中建立并无限期维持原代细胞系³。尤为重要的是，我们利用CRC技术快速确定了一例既往多种药物治疗失败的复发性呼吸道乳头状瘤患者的病因。此外，通过使用正常组织和肿瘤来源的CRC细胞，在组织活检后两周内成功鉴定出一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物——伏立诺他（vorinostat）。患者接受伏立诺他治疗后，疾病得到了有效控制⁴。

方案

1. 建立三维细胞培养插件系统

1. 将2个聚碳酸酯细胞培养小室以倒置方向（滤膜面朝上）放入6孔板中（图1A）。
2. 在小室底面均匀涂布一层0.1%明胶水溶液，置于生物安全柜中干燥（10–20分钟），以保持无菌状态。
3. 重复步骤1.2两次，共在小室上涂布三层0.1%明胶。
   注意：明胶包被有助于限制各腔室之间的扩散。
4. 为从常规培养条件下收集原代结直肠癌细胞（CRCs），向培养瓶中加入5 mL PBS进行洗涤。
   1. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行消化（T-25培养瓶用1 mL，T-75培养瓶用2 mL），37 °C孵育5分钟。轻轻敲击培养瓶侧面以促进细胞脱落。随后加入5 mL完全DMEM培养基终止消化反应，并收集细胞。
   2. 将细胞收集至15 mL离心管中，在4 °C下以188 × g离心，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
   3. 将600,000个CRCs重悬于250 μL条件培养基（CM）中，加入方向正确（滤膜面朝下）的培养小室（图1B）。此部分称为内腔室。
      注意：CM为经辐照J2细胞条件化处理的F-培养基，其中含有10 μm Y-27632，具体制备方法见先前文献^7,8

结果

基于细胞培养小室的系统是一种相对简单且快速的方法，可用于培养支持腔面细胞分化的前列腺癌类器官（CRC）三维（3D）模型。该系统的示意图如（图1A）所示，图中突出显示了将明胶包被于滤膜小室底面的操作过程。小室仅在包被明胶时需翻转。在图1B中，滤膜小室已处于适合培养的正确方向。使用透明细胞培养小室时，可获得健康前列腺癌类器官三维培养的代表性图像（10倍放大）（图2）。如图所示的健康类器官致密分层结构，在培养建立后较为典型，可通过标准光学显微镜观察。在初始建系阶段，观察所形成的细胞层至关重要，以确保该方法适用于特定细胞系，并确认细胞已实现适当的贴附与分层。

按照上述方法将HEA涂布于插入物内侧。涂布HEA后，需小心划痕以将滤膜从插入物中取出（图3A、3B）。在所有步骤中（图3A-3D），均需.......

讨论

原代细胞系是癌症研究中一个重要的、快速发展的研究平台。基于培养插件的三维培养系统可在两周时间内支持原代前列腺CRC的分化。CRC滤过法代表了一种用于前列腺研究的新型中通量方法。现有的小鼠PDX模型耗时长且成本极高，且许多PDX样本无法在体外培养中生长，限制了研究者自主开展的实验及其应用价值。此外，尽管建立PDX模型的成功率差异很大¹³，但CRC方法在建立细胞系方面具有较高的成功率³。我们认为本系统可作为R-spondin依赖性前列腺类器官方法的有益补充；然而，已有报道指出，从原发性前列腺癌组织建立类器官的成功率较低¹⁴。此外，CRC的培养基、建系方法及维持条件均显著简化，优于R-spondin依赖性前列腺类器官方法。另一个优势在于，CRC可用于建立并测试配对的正常组织与肿瘤组织培养物，从而实现直接的分子水平比较。

在建立该系统时，仍有一些技术问题需要解决。首先，应用于滤膜插件底部的明胶涂层虽有助于减少培养基在膜两侧的扩散，但无法完全消除。频.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning Costar Snapwell 培养小室	Corning	3801
Millicell 细胞培养小室	Millipore	PIHP01250
多孔板 6 孔	Falcon	353046
0.1% 明胶水溶液	Stemcell Technologies	7903
无菌安全手术刀 10 号刀片	Integra Miltex	4-510
无菌标准手术刀 11 号刀片	Integra Miltex	4411
RIPA 裂解与提取缓冲液	Thermofisher Scientific	89900
氟化钠	Fishcer Scientific	S299-100
钒酸钠	Fishcer Scientific	13721-39-6
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	3483123
蛋白酶抑制剂混合物（AEBSF、抑肽酶、Bestatin、E-64、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂 A）	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
谷氨酰胺	Thermofisher Scientific	25030081
青霉素-链霉素	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 营养混合培养基	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 二盐酸盐 ROCK 抑制剂	Enzo	ALX-270-333-M025
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
胰岛素	Thermofisher Scientific	12585-014
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C3012
庆大霉素	Thermofisher Scientific	15710-064
两性霉素 B（Fungizone）	Fisher Scientific	BP264550
Trizol 试剂	Invitrogen	15596026
Histogel 标本处理凝胶（羟乙基琼脂糖，HEA）	Thermo Scientific	HG-4000-012
非粘附性敷料	Telfa	KDL2132Z
细胞培养皿	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II 组织处理/包埋盒	Crystalgen	CG-M492