使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

摘要

本视频和论文描述了一种基于乳液的方法，用于将哺乳动物细胞包裹在0.5%至10%的海藻酸盐微珠中，该微珠可通过简单的搅拌装置大规模制备。包裹后的细胞可用于培养 体外 或用于细胞治疗应用的移植。

摘要

海藻酸盐微珠包封细胞已被用于固定化细胞培养 体外 以及用于免疫隔离 体内胰岛封装已被广泛研究，作为提高同种异体或异种移植中胰岛存活率的一种手段。海藻酸盐封装通常通过喷嘴挤出和外部胶凝实现。采用该方法时，含有细胞的海藻酸盐液滴在喷嘴尖端形成后落入含二价阳离子的溶液中，阳离子扩散进入液滴引发离子交联型海藻酸盐胶凝。由于液滴必须在喷嘴尖端形成，限制了可达到的体积通量和海藻酸盐浓度。本视频介绍一种可放大的乳化方法，用于将哺乳动物细胞封装于0.5%至10%的海藻酸盐中，细胞存活率达70%至90%。在此替代方法中，含有细胞和碳酸钙的海藻酸盐液滴在矿物油中乳化，随后降低pH值，促使内部钙离子释放并引发离子交联型海藻酸盐胶凝。该方法可在乳化后20分钟内完成海藻酸盐微球的制备。封装步骤所需设备仅为大多数实验室常见的搅拌容器。

引言

哺乳动物细胞封装已被广泛研究，作为一种保护移植细胞免受免疫排斥的方法¹ 或为固定化细胞培养提供三维支撑^2,3,4胰岛在海藻酸盐微珠中的包封已被用于逆转同种异体移植中的糖尿病^5,6 或异种的^{7,8,9,10,11,12} 啮齿类动物。用于治疗1型糖尿病的包封胰岛移植的临床前和临床试验正在进行中^13,14,15用于移植应用或大规模生产 体外 固定化细胞制备通常采用基于喷嘴的微珠发生装置。一般将海藻....

方案

1. 准备海藻酸钠溶液、CaCO₃ 悬液和酸化油

1. 配制工艺缓冲液和培养基。
   1. 使用 10 mM HEPES 和 170 mM NaCl 配制常规工艺缓冲液，用于制备高浓度海藻酸盐微球，调节 pH 至 7.4。
   2. 使用含 10% 胎牛血清（FBS）、6 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）配制常规培养基。
2. 配制海藻酸盐储备液，其浓度为微球中目标终浓度的 1.17 倍。
   1. 首先称取适量海藻酸盐粉末。例如，若目标终浓度为 5% 海藻酸盐（LVM 与 MVG 比例为 50:50），则将 0.583 g LVM 海藻酸盐粉末与 0.583 g MVG 海藻酸盐粉末混合，共称取 1.17 g 海藻酸钠。
   2. 将 20 mL 工艺缓冲液加入置于磁力搅拌器上的可高压灭菌玻璃瓶中，以约 200 rpm 的速度搅拌，并逐步将海藻酸钠粉末加入溶液中。
   3. 低速持续搅拌过夜。如有必要，将瓶子固定在搅拌器上。
   4. 若溶液未完全溶解，将瓶子固定于旋转混合器上，在 37 °C 继续混合 24 小时。
   5. 将海藻酸盐溶液置于装液量不超过容器一半的容器中，高压灭菌 30 分钟以灭菌；取出前需等待温度降至 ....

结果

在乳化和内部胶凝过程结束时，应回收到与初始海藻酸盐和细胞混合物体积相近的微珠体积。微珠应高度呈球形，缺陷极少（图3）。微珠应具有足够的强度，能够耐受通过宽口移液管进行移液操作。在高海藻酸盐浓度下，微珠中可能出现包埋的油滴或气泡。这可能是由于在乳化步骤（油/水/油双重乳液）中油被截留在海藻酸盐液滴中所致。据我们观察，这类微珠仅占微珠总体积的一小部分（<5%），并且由于其密度较低，在回收微珠时通过吸除油相即可去除大部分此类微珠。

图 .......

讨论

各个步骤（如图所示） 图2) 在内凝胶反应过程中可能会限制整体反应动力学。对于粒径大于约 ~2.5 µm，碳酸盐溶解速率已被证明是限速步骤^26,44导致细胞内钙释放的酸化步骤也已被证明是影响细胞存活的关键工艺变量³²因此，导致内部凝胶化的条件对于微珠质量和细胞存活均至关重要。根据微珠的最终应用，可选择不同的最佳工艺条件。例如，较大的pH下降值（例如 使用10 mM HEPES缓冲海藻酸盐溶液）可能适用于对微球长期稳定性要求较高的移植应用。另一方面，较低的pH下降（例如 使用60 mM MOPS缓冲海藻酸盐溶液可能更为合适 体外 应用。

除了调节酸化的程度和持续时间外，还可以设想其他工艺改进。例如，可采用其他搅拌容器构型、海藻酸钠浓度、工艺缓冲液、有机相和酸化试剂。如前所述，通过改变乳化步骤中的搅拌速率，可轻松调节微珠的平均粒径。此外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与耗材
LVM 藻酸盐（移植级）	Novamatrix	不适用	在结果中称为 "藻酸盐 #1"。
MVG 藻酸盐（移植级）	Novamatrix	不适用	在结果中称为 "藻酸盐 #2"。
藻酸盐（细胞培养级）	Sigma	A0682（低粘度）或 A2033（中等粘度）	A2033 在结果中称为 "藻酸盐 #3"。
DMEM	Life Technologies	11995-065
胎牛血清，经鉴定，源自加拿大	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
谷氨酰胺	Life Technologies	25030
青霉素和链霉素	Sigma	P4333-100ML
HEPES，经细胞培养测试	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
细颗粒 CaCO3	Avantor Materials	1301-01	配制 CaCO3 悬浮液后，需进行超声处理，并在一个月内使用。
轻质矿物油	Thermo Fisher Scientific	O121-4	使用前需通过孔径为 0.22 μm 的膜进行无菌过滤。
冰醋酸	Thermo Fisher Scientific	A38-500	操作时需谨慎：请参阅材料安全数据表（MSDS）。
无菌刮勺	Sigma	CLS3004-100EA
无菌尼龙细胞筛，40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
血清移液管（2 mL、5 mL、10 mL、25 mL）	Sarstedt	86.1252.001、86.1253.001、86.1254.001 和 86.1685.001
巴斯德吸管	VWR	14673-043
甲苯胺蓝-O	Sigma	T3260
设备
100 mL 微载体搅拌瓶	Bellco	1965-00100	近期型号的搅拌桨构型可能不适合充分乳化。可使用聚四氟乙烯（Teflon）板定制一种能够将油相搅拌至距离瓶底仅 0.5 cm 的叶片。
带可调转速的磁力搅拌板	Bellco	7760-06005	使用前应校准转速（例如使用转速计）。
细胞计数仪	Innovatis	Cedex AS20	该系统现由 Roche 销售。此自动细胞计数仪也可用台盼蓝染色后在血细胞计数板上进行手动细胞计数替代。
LED 光源箱	Artograph	LightPad® PRO	该设备可用其他类型的照明装置替代。
手持相机	Canon	PowerShot A590 IS	可使用多种手持相机拍摄甲苯胺蓝-O 染色微珠图像。拍摄前应在盛有微珠的培养皿旁放置一把尺子。
配备相差功能和合适荧光滤光片的荧光显微镜	Olympus	IX81	实验中使用了多种显微系统对微珠成像。此处展示的结果是使用配备 GFP 和 TRITC 荧光滤光片的 IX81 显微镜获得的。为完整捕获微珠图像，根据搅拌速率选用 4X 至 20X 物镜。活/死染色图像通常使用 20X 至 40X 物镜拍摄。
图像采集软件	Molecular Devices	Metamorph	可使用多种图像采集软件获取相差和荧光图像。
图像分析免费软件	CellProfiler	不适用	可使用多种图像分析软件将微珠识别为对象并分析其大小（例如 ImageJ）。