使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

摘要

本视频和论文描述了一种基于乳液的方法，用于将哺乳动物细胞包裹在0.5%至10%的海藻酸盐微珠中，该微珠可通过简单的搅拌装置大规模制备。包裹后的细胞可用于培养 体外 或用于细胞治疗应用的移植。

摘要

海藻酸盐微珠包封细胞已被用于固定化细胞培养 体外 以及用于免疫隔离 体内胰岛封装已被广泛研究，作为提高同种异体或异种移植中胰岛存活率的一种手段。海藻酸盐封装通常通过喷嘴挤出和外部胶凝实现。采用该方法时，含有细胞的海藻酸盐液滴在喷嘴尖端形成后落入含二价阳离子的溶液中，阳离子扩散进入液滴引发离子交联型海藻酸盐胶凝。由于液滴必须在喷嘴尖端形成，限制了可达到的体积通量和海藻酸盐浓度。本视频介绍一种可放大的乳化方法，用于将哺乳动物细胞封装于0.5%至10%的海藻酸盐中，细胞存活率达70%至90%。在此替代方法中，含有细胞和碳酸钙的海藻酸盐液滴在矿物油中乳化，随后降低pH值，促使内部钙离子释放并引发离子交联型海藻酸盐胶凝。该方法可在乳化后20分钟内完成海藻酸盐微球的制备。封装步骤所需设备仅为大多数实验室常见的搅拌容器。

引言

哺乳动物细胞封装已被广泛研究，作为一种保护移植细胞免受免疫排斥的方法¹ 或为固定化细胞培养提供三维支撑^2,3,4胰岛在海藻酸盐微珠中的包封已被用于逆转同种异体移植中的糖尿病^5,6 或异种的^{7,8,9,10,11,12} 啮齿类动物。针对1型糖尿病的包封胰岛移植的临床前和临床试验正在进行中^13,14,15用于移植应用或大规模生产 体外 固定化细胞生产通常使用基于喷嘴的微珠发生装置。一般将海藻酸盐与细胞的混合物通过喷嘴泵出，形成液滴后落入含二价阳离子的搅拌溶液中，从而实现液滴的外部凝胶化。同轴气体流动^16,17，喷嘴振动¹⁸，静电排斥¹⁹ 或旋转导丝²⁰ 促进液滴在喷嘴尖端的形成。

传统微珠生成器的主要缺点是通量有限，以及能够形成良好微珠的溶液黏度范围较窄²¹。在高流速下，从喷嘴流出的液体分裂成小于喷嘴直径的液滴，导致尺寸控制能力下降。虽然可采用多喷嘴微珠生成器来提高通量，但各喷嘴间流体的均匀分配以及使用黏度高于>0.2 Pas的溶液仍存在困难²²。最后，所有基于喷嘴的装置都可能对胰岛造成一定程度的损伤，因为所用喷嘴的直径在100 µm至500 µm之间，而约15%的人类胰岛直径可超过200 µm²³。

在本视频中，我们介绍一种通过单步乳化法形成液滴来封装哺乳动物细胞的替代方法，而非逐滴生成。由于微珠的制备是在一个简单的搅拌容器中完成的，该方法适用于小规模（约 1 mL）至大规模（10³ L 量级）的微珠生产，且设备成本较低²⁴。该方法可在较短时间（例如 20 分钟）内，使用多种不同黏度的海藻酸盐溶液，制备出球形度高的微珠。该方法最初由 Poncelet et al.^25,26 开发，曾用于固定 DNA²⁷、蛋白质²⁸（包括胰岛素²⁹）以及细菌³⁰。我们近期已将这些方法改进，用于胰腺 β 细胞系^31,32 和原代胰腺组织³² 的哺乳动物细胞封装。

该方法的原理是生成一种水包油型乳液，其中包含矿物油中的海藻酸盐液滴，随后实现海藻酸盐液滴的内部凝胶化（图1）。首先，将包封物（例如细胞）分散于含有细颗粒钙盐的海藻酸盐溶液中，该钙盐在初始工艺pH条件下溶解度较低。然后将海藻酸盐混合物加入到搅拌的有机相中以形成乳液，通常需加入表面活性剂。在哺乳动物细胞包封的情况下，血清中存在的组分可起到表面活性剂的作用。接下来，通过添加一种可溶于油且能分配进入水相的酸来降低pH值，从而使钙盐溶解。乙酸在矿物油/水中的分配系数<0.005³³，应预先溶解于油中，然后加入乳液，在油相中混合后迅速分配进入水相³⁴。图2展示了酸化和内部凝胶化过程中发生的化学反应及扩散过程。最后，通过相转化、离心加速相分离、多次洗涤步骤以及过滤来回收包封的细胞。随后可进行微珠和细胞取样，用于质量控制分析、体外细胞培养和/或包封细胞的移植。

图1：基于乳化法的哺乳动物细胞封装过程示意图 首先通过乳化海藻酸钠、细胞和CaCO₃制备微珠₃ 矿物油中的混合物（示意图中的步骤1和步骤2），通过加入乙酸引发内部凝胶化（步骤3）。然后通过加入水相缓冲液促使相转变，将凝胶珠从油相中分离出来（步骤4），随后进行离心和吸除油相（步骤5），再进行过滤（步骤6）。最后，将滤膜上收集的凝胶珠转移至细胞培养基中用于后续实验 体外 培养或用于移植。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：内源凝胶化过程中发生的反应与扩散步骤。 （1）将乙酸加入有机相，并通过对流传递至海藻酸盐液滴。（2）乙酸分配进入水相。（3）在水存在下，酸解离并扩散，到达图中深蓝色所示的CaCO₃颗粒。（4）H⁺离子与CaCO₃中的Ca²⁺离子发生交换，释放出Ca²⁺离子。（5）钙离子扩散直至遇到未反应的海藻酸盐，从而引发海藻酸盐链的离子交联。请点击此处查看该图的放大版本。

与传统的基于喷嘴的细胞包封装置不同，由于搅拌乳化过程中液滴形成的机制，该方法预期会产生较宽的微珠粒径分布。对于某些应用而言，这种微珠粒径分布可能存在问题。例如，在较小的微珠中，更大比例的细胞可能暴露于微珠表面。如果营养物质（例如 氧气）限制是一个需要关注的问题，这些限制在较大的微珠中可能会加剧。搅拌乳化法的一个优点是，可通过改变乳化步骤中的搅拌速率，轻松调节微珠的平均粒径。此外，可利用较宽的微珠粒径分布来研究微珠尺寸对包封细胞性能的影响。

对于未配备微珠发生器的实验室而言，通过乳化和内部胶凝实现哺乳动物细胞包封是一种颇具吸引力的替代方法。此外，该方法还允许用户缩短处理时间，或在极低或极高海藻酸钠浓度下生成微珠。

以下方案描述了如何将细胞包封于10.5 mL含5%海藻酸钠的溶液中，该溶液使用10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液配制。该海藻酸钠由移植级LVM（低黏度、高甘露糖醛酸含量）与MVG（中等黏度、高古洛糖醛酸含量）按50:50比例混合而成。以终浓度24 mM的碳酸钙作为物理交联剂。轻质矿物油构成有机相，乙酸用于酸化乳液并引发内部凝胶化。然而，海藻酸钠的类型与组成以及所选工艺缓冲液取决于具体应用需求³²。已有多种类型的海藻酸钠（见材料表）通过本方案成功制备成微球。

方案

1. 准备海藻酸钠溶液、CaCO₃ 悬液和酸化油

1. 配制工艺缓冲液和培养基。
   1. 使用 10 mM HEPES 和 170 mM NaCl 配制常规工艺缓冲液，用于制备高浓度海藻酸盐微球，调节 pH 至 7.4。
   2. 使用含 10% 胎牛血清（FBS）、6 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）配制常规培养基。
2. 配制海藻酸盐储备液，其浓度为微球中目标终浓度的 1.17 倍。
   1. 首先称取适量海藻酸盐粉末。例如，若目标终浓度为 5% 海藻酸盐（LVM 与 MVG 比例为 50:50），则将 0.583 g LVM 海藻酸盐粉末与 0.583 g MVG 海藻酸盐粉末混合，共称取 1.17 g 海藻酸钠。
   2. 将 20 mL 工艺缓冲液加入置于磁力搅拌器上的可高压灭菌玻璃瓶中，以约 200 rpm 的速度搅拌，并逐步将海藻酸钠粉末加入溶液中。
   3. 低速持续搅拌过夜。如有必要，将瓶子固定在搅拌器上。
   4. 若溶液未完全溶解，将瓶子固定于旋转混合器上，在 37 °C 继续混合 24 小时。
   5. 将海藻酸盐溶液置于装液量不超过容器一半的容器中，高压灭菌 30 分钟以灭菌；取出前需等待温度降至 60 °C 以下。
   6. 如有必要，在高压灭菌后、溶液尚未冷却至室温且黏度仍足够低时，立即过滤以去除颗粒物。
3. 配制碳酸钙悬浮液，其浓度为内部胶凝所需终浓度的 21 倍。
   1. 称取 CaCO₃ 粉末。例如，将 1 g CaCO₃ 加入 20 mL 工艺缓冲液中，以获得终浓度为 24 mM 的凝胶剂 CaCO₃。
   2. 将 CaCO₃ 悬浮液高压灭菌 30 分钟。
      注意：由于碳酸氢盐–CO₂ 平衡的存在，CaCO₃ 浓度会随时间变化。同一份 CaCO₃ 储备悬浮液使用次数不应超过 10 次包封操作。
4. 对用于乳化过程的搅拌容器进行高压灭菌。使用前，清除旋转烧瓶中残留的冷凝水。
5. 在乳化过程开始前立即配制酸化油。在 50 mL 锥形管中，每 11 mL 矿物油加入 44 µL 冰醋酸。
   注意：常见错误是冰醋酸未完全溶解。应避免移取微量冰醋酸，并通过反复涡旋确保其在油相中完全溶解。
   警告：冰醋酸为有毒且易挥发的酸。应在通风橱中操作，且在乳化步骤前始终保持冰醋酸/油溶液处于密闭容器中。有关该试剂的更多信息，请参阅其材料安全数据表（MSDS）。
6. 在进行细胞包封前，确保所有溶液均达到室温。

2. 通过乳化和内部凝胶化生成海藻酸盐微珠

1. 在旋转烧瓶中加入10 mL轻质矿物油，并以低转速开始搅拌（例如 250 rpm（本视频中使用的旋转瓶所用转速）。
2. 若用于该过程的细胞来自贴壁培养物，需使用胰蛋白酶处理以使细胞悬浮。通过添加含胎牛血清（FBS）的培养基或胰蛋白酶抑制剂终止反应，并收集样品进行细胞计数。
   1. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪，按照先前所述方法，通过台盼蓝染色测定细胞浓度和活力³².
3. 以300 × g离心细胞7分钟，并用细胞固定所需的培养基洗涤一次。确保该培养基中含有如FBS或牛血清白蛋白（BSA）等乳化剂。例如，可使用含10% FBS的DMEM。
4. 将细胞沉淀重悬于相同培养基中，使其浓度为磁珠中目标终浓度的10.5倍。
5. 将1.1 mL的10.5倍浓缩细胞悬液加入9.9 mL海藻酸钠溶液中。然后加入550 µL CaCO₃₃ 悬浮并用无菌刮勺搅拌混合，以确保碳酸钙均匀分布₃.
6. 立即转移10.5 mL的海藻酸钠、细胞和CaCO₃混合物₃ 使用注射器将混合物注入搅拌中的油相。
   注意：对于高黏性溶液，应极缓慢地吸取和排出混合物，以避免产生气泡。在某些情况下，向烧瓶中加入混合物时宜停止搅拌，以防止海藻酸盐缠绕在搅拌桨轴上。
7. 加入海藻酸钠后立即进行细胞和CaCO₃的处理₃ 将混合物加入油中，提高搅拌速率。
   注意：对于此处使用的5% LVM:MVG海藻酸盐，采用1025 rpm的旋转速度，可生成直径约900 µm、适合于 体外 培养³⁵较高的转速和较低的海藻酸钠浓度将导致平均珠粒直径减小，这与先前发表的研究结果一致。^25,32搅拌桨和容器几何形状的微小变化，以及海藻酸盐性质的差异，均可显著影响微珠的平均直径。每次改变容器构型或海藻酸盐批次时，均应建立一条标准曲线，以反映微珠表面积矩平均直径与转速之间的关系。³².
8. 启动计时器，将海藻酸盐乳化12分钟。
9. 加入10 mL油和乙酸溶液以酸化乳液，溶解CaCO₃₃ 从而将海藻酸盐物理交联形成凝胶珠。此酸化步骤需静置8分钟。

3. 磁珠回收

1. 将振荡速率降低至400 rpm。加入40 mL工艺缓冲液与10%培养基的混合液，以提高pH值并引发相转变。
2. 1 分钟后停止搅拌，将混合物转移至 50 mL 离心管中。用额外的 20 mL 培养基冲洗旋转烧瓶，并将冲洗液加入离心管中。在吸除油相之前，先尽可能吸尽旋转烧瓶中的水相，以尽量减少微珠与油相的接触。
   注意：使用宽口移液管（例如 此步骤及后续操作中，请使用25 mL移液管以避免损伤磁珠。对于较小体积，也可使用剪切过的移液枪头操作磁珠悬液。制备此类枪头时，需佩戴护目镜，用剪刀剪去移液枪头末端。
3. 将离心管在630 × g下离心3分钟，以加速磁珠沉降和相分离。
4. 用巴斯德吸管抽吸去除油相和过量的水溶液。
5. 用培养基至少洗涤磁珠一次。将磁珠悬液通过40 µm尼龙细胞滤网过滤，并从滤网下方抽吸去除与磁珠相关的过量液体。使用无菌刮铲将磁珠转移至已知体积的培养基中。
   注意：此步骤可根据目标微珠的最小直径选用较小或较大孔径的滤膜。然而，建议采用重力过滤，而非通过亚微米孔径滤膜的压力驱动过滤，以避免损伤微珠。
6. 通过排液法测量珠子体积（加入珠子后的体积减去加入前的体积），并补充培养基至目标珠子体积与总体积之比，通常为1:5，即1 mL珠子加入4 mL培养基中。此后操作均应使用宽口移液枪，以避免损伤珠子。
7. 将包封的细胞转移至T形瓶中 体外 培养或移植实验。

4. 质量控制与应用

注意：为了确保包封细胞和微珠的质量，应量化微珠的尺寸分布以及该过程后的细胞存活率。通常通过逆转凝胶以从微珠中回收细胞，用于进一步分析。

1. 为评估微珠的粒径分布，使用甲苯胺蓝-O对微珠进行染色。
   1. 将0.5 mL微珠加入含10%完全培养基的4 mL处理缓冲液中。
   2. 加入500 µL用处理缓冲液配制的1 g/L甲苯胺蓝溶液。
   3. 在锥形管中于50 rpm的旋转摇床上孵育60分钟。
   4. 加入5 mL含10%完全培养基的处理缓冲液，并立即将微珠及溶液转移至培养皿中，使用低倍显微镜或手持式数码相机获取图像。如需增强对比度并避免阴影，可在使用手持相机拍摄前将培养皿置于光源箱上。
   5. 进行图像分析以定量微珠粒径分布，方法如前所述³²，例如使用图像分析免费软件³⁶。
2. 为定性评估细胞存活情况，使用碘化丙啶同型二聚体（ethidium homodimer）染色以识别死细胞，使用钙黄绿素AM（calcein AM）染色以识别活细胞。
   1. 将1体积的微珠加入4体积含10%完全培养基的处理缓冲液中。
   2. 加入适量的钙黄绿素AM和碘化丙啶同型二聚体储备液，使其终浓度分别为4 µM和2 µM。通过仅向部分微珠样品中加入其中一种试剂，制备单染对照组。
   3. 将微珠置于冰上孵育20分钟。
   4. 使用垫片（如O型圈）将溶液置于载玻片与盖玻片之间，以避免压碎微珠。
   5. 进行荧光显微镜观察。使用单染对照组评估荧光串色。根据钙黄绿素AM（激发/发射波长494/517 nm）和与DNA结合的碘化丙啶同型二聚体（528/617 nm）的激发/发射波长选择合适的荧光滤光片。
3. 为从微珠中回收细胞以进行后续分析，使用柠檬酸盐或其他螯合溶液对海藻酸盐进行解胶处理。
   1. 配制含有55 mM柠檬酸盐、10 mM HEPES和95 mM NaCl、pH为7.4的解胶溶液。
   2. 将该溶液与10%培养基混合，然后将1 mL海藻酸盐微珠加入9 mL混合液中。
   3. 在冰上以75 rpm振荡20分钟进行解胶。
      注意：此时细胞可用于分析，或通过离心从解胶后的海藻酸盐溶液中分离。例如，可通过台盼蓝染色定量解胶后细胞的活力。或者，可将细胞离心并洗涤，随后进行mRNA、DNA和/或蛋白质的取样与分析。

结果

在乳化和内部胶凝过程结束时，应回收到与初始海藻酸盐和细胞混合物体积相近的微珠体积。微珠应高度呈球形，缺陷极少（图3）。微珠应具有足够的强度，能够耐受通过宽口移液管进行移液操作。在高浓度海藻酸盐条件下，微珠中可能出现包埋的油滴或气泡。这可能是由于在乳化步骤（油/水/油双重乳液）中，油相被截留在海藻酸盐液滴中所致。据我们观察，这类微珠仅占总体积的一小部分（<5%），并且由于其密度较低，在微珠回收过程中吸除油相时大部分已被去除。

图 ...

讨论

在内源性胶凝反应过程中（如图2所示），多个步骤可能限制整体反应动力学。对于粒径大于约2.5 µm的碳酸钙颗粒，已有研究表明碳酸盐溶解速率是限速步骤^26,44。导致钙离子内部释放的酸化步骤也被证实是影响细胞存活的关键工艺变量³²。因此，引发内源性胶凝的条件对于微珠质量和细胞存活均至关重要。根据微珠的最终应用需求，可选择不同的最优工艺条件。例如，在移植应用中，若微珠的长期稳定性至关重要，则可能需要更大的pH下降幅度（例如，使用10 mM HEPES缓冲海藻酸盐溶液）；而在体外应用中，较小的pH下降幅度（例如，使用60 mM MOPS缓冲海藻酸盐溶液）可能更为合适。

除了调节酸化的程度和持续时间外，还可以设想其他工艺改进。例如，可采用其他搅拌容器构型、海藻酸钠浓度、工艺缓冲液、有机相和酸化试剂。如前所述，通过改变乳化步骤中的搅拌速率，可轻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与耗材
LVM 藻酸盐（移植级）	Novamatrix	不适用	在结果中称为 "藻酸盐 #1"。
MVG 藻酸盐（移植级）	Novamatrix	不适用	在结果中称为 "藻酸盐 #2"。
藻酸盐（细胞培养级）	Sigma	A0682（低粘度）或 A2033（中等粘度）	A2033 在结果中称为 "藻酸盐 #3"。
DMEM	Life Technologies	11995-065
胎牛血清，经鉴定，源自加拿大	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
谷氨酰胺	Life Technologies	25030
青霉素和链霉素	Sigma	P4333-100ML
HEPES，经细胞培养测试	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
细颗粒 CaCO3	Avantor Materials	1301-01	配制 CaCO3 悬浮液后，需进行超声处理，并在一个月内使用。
轻质矿物油	Thermo Fisher Scientific	O121-4	使用前需通过孔径为 0.22 μm 的膜进行无菌过滤。
冰醋酸	Thermo Fisher Scientific	A38-500	操作时需谨慎：请参阅材料安全数据表（MSDS）。
无菌刮勺	Sigma	CLS3004-100EA
无菌尼龙细胞筛，40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
血清移液管（2 mL、5 mL、10 mL、25 mL）	Sarstedt	86.1252.001、86.1253.001、86.1254.001 和 86.1685.001
巴斯德吸管	VWR	14673-043
甲苯胺蓝-O	Sigma	T3260
设备
100 mL 微载体搅拌瓶	Bellco	1965-00100	近期型号的搅拌桨构型可能不适合充分乳化。可使用聚四氟乙烯（Teflon）板定制一种能够将油相搅拌至距离瓶底仅 0.5 cm 的叶片。
带可调转速的磁力搅拌板	Bellco	7760-06005	使用前应校准转速（例如使用转速计）。
细胞计数仪	Innovatis	Cedex AS20	该系统现由 Roche 销售。此自动细胞计数仪也可用台盼蓝染色后在血细胞计数板上进行手动细胞计数替代。
LED 光源箱	Artograph	LightPad® PRO	该设备可用其他类型的照明装置替代。
手持相机	Canon	PowerShot A590 IS	可使用多种手持相机拍摄甲苯胺蓝-O 染色微珠图像。拍摄前应在盛有微珠的培养皿旁放置一把尺子。
配备相差功能和合适荧光滤光片的荧光显微镜	Olympus	IX81	实验中使用了多种显微系统对微珠成像。此处展示的结果是使用配备 GFP 和 TRITC 荧光滤光片的 IX81 显微镜获得的。为完整捕获微珠图像，根据搅拌速率选用 4X 至 20X 物镜。活/死染色图像通常使用 20X 至 40X 物镜拍摄。
图像采集软件	Molecular Devices	Metamorph	可使用多种图像采集软件获取相差和荧光图像。
图像分析免费软件	CellProfiler	不适用	可使用多种图像分析软件将微珠识别为对象并分析其大小（例如 ImageJ）。