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利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

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DOI：

10.3791/55284

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2017年2月18日

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1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

本文内容

摘要

肝脏损伤伴随前体细胞的扩增，这些前体细胞构成一个异质性的细胞群体。对该细胞区室进行新的分类，有助于区分多个细胞亚群。本文所述方法展示了通过流式细胞术分析及高纯度分离各类亚群的技术流程，所获细胞可用于后续多种实验分析。

摘要

在慢性肝损伤过程中，前体细胞会通过一种称为导管样反应的过程发生扩增，该过程还伴随炎性细胞浸润和上皮细胞活化。目前对这类炎症反应中前体细胞群体的研究主要依赖单一表面标志物，通过组织学分析或基于流式细胞术的技术进行鉴定。然而，新发现的表面标志物揭示了肝前体/干细胞区室中存在功能各异的多个亚群。本文所述方法介绍了利用新型表面标志物组合对前体细胞亚群进行分离及详细的流式细胞术分析。此外，还展示了如何通过自动化磁珠分选和FACS分选技术实现各前体细胞亚群的高纯度分离。尤为重要的是，采用新型且简化的酶解离肝脏组织方法，能够以高于现有其他方法的活性高效分离这些稀有细胞群体。该方法对于进一步研究前体细胞具有重要意义 关键词：肝前体细胞，导管样反应，流式细胞术，细胞分选，酶解离，炎症，肝损伤，细胞亚群 体外 或用于分离高质量RNA以分析基因表达谱。

引言

肝脏再生主要与肝细胞的自我更新能力相关。然而，在慢性肝损伤过程中，前体细胞会被激活并扩增，这一现象与其分化为肝细胞和胆管细胞的能力有关1,2,3,4。这一点尤为重要，因为在慢性损伤期间，肝细胞的增殖并不有效。尽管已有多种针对前体细胞的遗传谱系示踪研究，但它们在肝脏再生中的作用仍存在争议5,6,7,8。此外，前体细胞的激活已被证实与肝脏纤维化反应增强相关，这引发了关于其在损伤过程中确切作用的疑问9,10。

基因表达研究长期提示祖细胞区室具有异质性，这些研究通过显微解剖或基于细胞分选的方法分离出仅表达单一表面标志物的祖细胞1,11。事实上，最近一项研究利用gp38（podoplanin）这一新型表面标志物组合，明确地将先前已知的祖细胞单一标志物与不同亚群关联起来12。重要的是，这些亚群不仅在表面标志物表达上存在差异，在损伤过程中还表现出功能上的改变12。

已采用多种动物模型来研究前体细胞的活化及肝脏再生过程。不同类型的损伤似乎会促进不同亚群前体细胞的活化12，这或许可以解释在人类中观察到的导管样反应的表型差异4。因此，对前体细胞进行复杂的表型和功能分析，对于理解其在损伤中的作用以及导管样反应在肝病中的真正意义至关重要。

除了表面标志物组合之外，细胞分离方案中的关键差异进一步加剧了基于以往研究得出结论的复杂性2。大量研究探讨了祖细胞的作用，而这些研究中祖细胞的分离方案存在显著差异（例如，肝脏解离（酶的组合及处理时间）、密度介质以及离心速度）2。近期已开发并发表了一种优化的分离技术，该技术可提高稀有细胞群体的存活率，并更真实地反映细胞亚群的组成情况12。本文旨在提供该肝脏细胞分离方法及亚群分析的更详细实验方案，以便准确重复该技术。此外，本方案还包含了与先前分离方法的比较，以展示新旧方案之间的差异。

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方案

所有实验操作均经洪堡大学医学中心伦理与动物护理委员会批准。

1. 材料与缓冲液的准备

  1. 使用无菌组分和超净工作台新鲜配制肝脏消化所需的所有缓冲液，以避免细菌污染。
  2. 通过混合49.5 mL RPMI培养基和0.5 mL胎牛血清（FBS；低内毒素，热灭活）配制收集缓冲液（CB），得到1%（v/v）的溶液。将溶液置于冰上保存，直至后续使用。
    注意：消化一个完整肝脏大约需要25 mL CB。
  3. 使用以下组分配制消化缓冲液（DB）：RPMI培养基、1%（v/v）FBS（低内毒素，热灭活）、胶原酶P（0.2 mg/mL）、DNase-I（0.1 mg/mL）和分散酶（0.8 mg/mL）。
    注意：消化一个完整肝脏大约需要25 mL DB。使用前将DB在37 °C水浴中预热。
  4. 酶到达后，用Hanks平衡盐溶液（HBSS；用于胶原酶P和分散酶）或DNase-I缓冲液（50%（v/v）甘油、1 mM MgCl2、20 mM Tris-HCl；pH 7.5）进行重悬，分装后于-20 °C保存。DNase-I缓冲液储存于4 °C，并在两个月内使用完毕。

2. 肝脏单细胞悬液的制备

  1. 通过颈椎脱位法处死未经处理的野生型小鼠，操作须符合当地伦理委员会和动物护理委员会的规定。
  2. 将小鼠置于解剖板上，用70%乙醇润湿毛发。使用剪刀沿腹中线剪开皮肤，随后向四肢方向做Y形切口。用剪刀切开腹膜至胸骨。为暴露肝脏，用棉签轻轻将肠道推向右侧。
  3. 使用剪刀和镊子切除肝叶，保留胆囊，并避免结缔组织污染。称量肝脏重量后，将其置于含有HBSS的培养皿中，冰上保存。
  4. 将肝叶置于干燥的培养皿中，使用解剖刀将肝组织切成大小均匀的立方体，每边长约2 mm。将组织块转移至15 mL圆锥形离心管中。
  5. 向含有肝组织块的15 mL锥形离心管中加入2.5 mL DB，置于37 °C水浴中以启动消化过程（健康肝脏需60–70 min，肝硬化肝脏需80–90 min）。
    注意：如果消化一整块肝脏，应将肝脏分装至两个15 mL圆锥形离心管中，以确保细胞活性良好。
  6. 准备一个新的15 mL圆锥形离心管用于收集释放的肝细胞。将尼龙100 µm滤网置于离心管顶部，并用800 µL CB润湿滤网。将离心管置于冰上。
  7. 在37 °C水浴中孵育5分钟和10分钟后，轻轻振荡装有肝组织碎片的15 mL锥形离心管，以促进消化过程。
  8. 消化开始15分钟后，使用剪去尖端的1,000-µL移液枪轻轻吹打肝组织块，使组织块易于通过枪头。将离心管重新放回水浴中，静置2分钟使组织块沉降。
  9. 移除含有分散细胞的上清液（通常为2次，每次700 µL），将其加入步骤2.6中准备好的离心管中。用DB缓冲液（2次，每次700 µL）替代已移除的上清液，并将样本重新置于37 °C水浴中。
  10. 重复步骤2.8所述操作（通常在消化开始后30、40、50、55和60分钟进行），直至自消化开始已过去约60–70分钟。从40分钟起，剩余的肝组织碎片应已足够小，能够通过未切割的1,000-µL移液器吸头。
    注意：健康肝脏通常在60–70分钟内完全消化，而纤维化肝脏通常需要80–90分钟。至此时间点，含有肝组织块的15 mL锥形离心管中应不再可见肝组织，所有释放的细胞均应转移至步骤2.6中准备好的离心管中。
  11. 消化过程结束后，收集细胞并在 4 °C 下以 180 x g 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2）。
  12. 将细胞沉淀重悬于1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，室温孵育1分钟以裂解红细胞。加入5 mL CB终止反应，随后在4 °C、180 × g条件下离心8分钟（加速度设为4，减速度设为2）。用4 mL CB重悬细胞，置于冰上保存。按照步骤3所述方法进行细胞计数。
    注意：细胞沉淀较为松散，因此需用移液器吸除上清液，而非倾倒。

3. 使用流式细胞术测定细胞数量

注意：在测定细胞数量时，建议使用自动细胞计数器，或更理想地采用下文所述的基于流式细胞术的细胞定量方法，而非传统的基于血球计数板的方法。步骤2中所述的肝脏单细胞悬液包含实质细胞和非实质细胞（NPC），二者在大小和颗粒度上存在显著差异。在使用流式细胞术时，通过正确排除细胞碎片，并根据非实质细胞在前向散射与侧向散射（FSC-SSC）上的特征进行设门，可确保本方案的成功实施12。

  1. 取一份肝细胞悬液（20 µL），加入 174 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）和 6 µL 碘化丙啶（PI；终浓度为 0.375 µg/mL）。加入可用于细胞定量的计数微球。
  2. 根据 SSC-A 与 FSC-A 设门以排除碎片，并利用 FSC-H 与 FSC-A 排除双联体。
    注意：应遵循图 2所示的设门策略。
  3. 排除 PI 阳性的死细胞，从样品中检测 30 µL 并记录事件数。按照制造商指南计算细胞数量。
    注意：进行流式细胞术检测时，请执行步骤 4；进行基于磁珠的前体细胞分离时，请执行步骤 5 和 6；对前体细胞亚群进行流式分选时，请执行步骤 7。

4. 肝脏单细胞悬液的染色用于祖细胞亚群的流式细胞术分析

抗体克隆号宿主/同种型储存浓度 [mg/mL]稀释比例
CD64X54-5/7.1小鼠 IgG1, κ0.51:100
CD16/3293大鼠 IgG2a, λ0.51:100
CD4530-F11大鼠 IgG2b, κ0.21:200
CD31MEC13.3大鼠 IgG2a, κ0.51:200
ASGPR1多克隆山羊 IgG0.21:100
Podoplanin1/8/2001叙利亚仓鼠 IgG0.21:1,400
Podoplanin1/8/2001叙利亚仓鼠 IgG0.51:1,400
CD133Mb9-3G8大鼠 IgG10.033 µL
CD133315-2C11大鼠 IgG2a, λ0.51:100
CD34RAM34大鼠 IgG2a, κ0.51:100
CD90.253-2,1大鼠 IgG2, κ0.51:800
CD157BP-3小鼠 IgG2b, κ0.21:600
EpCAMG8.8大鼠 IgG2a, κ0.21:100
Sca-1D7大鼠 IgG2a, κ0.0310 µL
小鼠 IgG2b, κMPC-110.2
大鼠 IgG1RTK20710.2
大鼠 IgG2b, κRTK45300.2
大鼠 IgG2a, κRTK27580.5
大鼠 IgG2a, κRTK27580.2
叙利亚仓鼠 IgGSHG-10.2
叙利亚仓鼠 IgGSHG-10.5
正常山羊 IgG 对照多克隆山羊 IgG1
驴抗山羊 IgG驴 IgG21:800
链霉亲和素11:400

表1.

抗体12345
CD45 APC/Cy7大鼠 IgG2b, κ
0.5 µL		++++
CD31 生物素标记+大鼠 IgG2a, κ
0.5 µL		+++
ASGPR1 纯化抗体++正常山羊 IgG 对照
0.2 µL		++
Podoplanin APC+++叙利亚仓鼠 IgG
1 µL（1:14 稀释）		+
CD133 PE++++大鼠 IgG1
0.45 µL
驴抗山羊
Alexa Fluor 488		+++++
链霉亲和素
Alexa Fluor 405		+++++

表2.

  1. 取步骤 2.11 中的细胞悬液一份，加入含有 2.5 × 105 个细胞的反应管（1.5 mL）中，细胞数量按步骤 3 所述方法确定。
  2. 使用微量离心机在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 3 分钟。
    注意：此时可使用真空泵小心吸除上清液。
  3. 将细胞沉淀重悬于 Fc 阻断液中，冰上孵育 5 分钟。每份染色样本配制总体积为 50 µL 的 Fc 阻断液：每份加入 10 µL FcR 阻断试剂、1 µL 纯化的抗 CD64 抗体（1:100；0.5 µg/染色）和 40 µL 染色缓冲液（ST 缓冲液：HBSS，1% (v/v) FBS，0.01% 叠氮化钠）。
    注意：叠氮化钠具有高毒性。请使用适当的个人防护装备，如腈类手套、实验服和口罩。
  4. 向细胞中加入 50 µL 染色混合液（此时细胞总体积为 100 µL），避光冰上孵育 20 分钟，使细胞与抗体混合液充分反应。
  5. 每份染色样本配制总体积为 50 µL 的抗体混合液。在 50 µL ST 缓冲液中加入以下偶联抗体用于基础染色：CD45（0.5 µL；1:200；0.1 µg/染色）、CD31（0.5 µL；1:200；0.25 µg/染色）、ASGPR1（1 µL；1:100；0.2 µg/染色）、podoplanin（1 µL，1:14 稀释液；终稀释度 1:1,400；0.014 µg/染色）和 CD133（3 µL；0.09 µg/染色）。
    注意：表 1 汇总了用于基础染色及各亚群其他表面标志物的抗体克隆及稀释比例。根据 表 2 所示，额外准备含有相应同型对照和/或荧光减一对照（FMO）的抗体混合液的细胞悬液。
  6. 向每个样本中加入 400 µL ST 缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 4 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL 二抗混合液中，该混合液含 100 µL ST 缓冲液、0.125 µL 驴抗山羊 IgG（1:800；0.25 µg/染色）和 0.25 µL 荧光标记的链霉亲和素（1:400；0.25 µg/染色）。
  7. 避光冰上孵育细胞与抗体混合液 20 分钟。向每个样本中加入 400 µL ST 缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 4 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于含 0.25 µg/mL 碘化丙啶（PI）的 300 µL ST 缓冲液中。
    注意：前体细胞的细胞活力随时间下降；因此建议尽快检测新鲜样本。

5. 基于磁性微珠的前体细胞富集

  1. 根据步骤3中测定的细胞计数，取含有1.5–2 × 106个细胞的肝单细胞悬液等分试样，转移至新的15 mL圆锥形离心管中。
  2. 在4 °C条件下以180 × g离心8分钟（使用减速度/4和减速/2）。
    注意：通常，一只健康的C57Bl/6小鼠肝脏（或1 g肝组织）需分装至三个15 mL圆锥形离心管中。
  3. 将细胞重悬于400 µL含0.5% (v/v) 牛血清白蛋白（BSA）的HBSS中，并加入40 µL抗CD31磁珠和30 µL抗CD45磁珠。在4 °C孵育15分钟。
    注意：孵育时间不得超过，否则分离纯度将显著降低。
  4. 向细胞中加入5 mL含0.5% (v/v) BSA的HBSS，于4 °C以180 × g离心8分钟。
  5. 将细胞沉淀重悬于100 µL去死细胞磁珠中，在室温孵育15分钟。同时，准备LS分离柱并用3 mL含0.5% (v/v) BSA的HBSS进行预平衡。
    注意：孵育时间不得超过，否则分离纯度将显著降低。
  6. 向细胞中加入900 µL含0.5% (v/v) BSA的HBSS，使用100 µm聚酰胺滤膜过滤后，加载至LS分离柱上。
    注意：将一整只肝脏样品加至一个LS分离柱上。
  7. 用3 mL含0.5% (v/v) BSA的HBSS洗涤柱子三次，收集穿流液。
  8. 将穿流液于4 °C以180 × g离心8分钟。
  9. 根据后续实验步骤，将细胞沉淀重悬于洗涤缓冲液（RB）（含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS）或ST缓冲液中，两者任选其一。

6. 基于磁性微珠的自动化细胞纯化技术联合多肝脏来源前体细胞亚群的分离

注意：由于前体细胞亚群属于稀有细胞群体，通常需要合并多个肝脏的细胞以获得足够数量的细胞用于后续实验。以下以 CD133+ 和 gp38+ 细胞的分离为例进行说明。

  1. CD133+ 祖细胞的分离
    1. 完成步骤 5.9 后，按照步骤 3 所述方法计数细胞，并将最多 106 个细胞（通常合并 4–6 份健康肝组织样本）重悬于 100 µL RB 中。
    2. 向细胞中加入 1:100 的抗 CD64 抗体和 1:100 的抗 CD16/32 抗体，冰上孵育 5 分钟。随后加入 1:100 的生物素标记抗 CD133 抗体，继续冰上孵育 10 分钟。
    3. 加入 5 mL RB，于 180 × g、4 °C 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2，均使用较低设置）。
    4. 将细胞重悬于 400 µL RB 中，加入 10 µL 抗生物素磁珠。在 4 °C 孵育 15 分钟。孵育时间不得超过，否则会降低样本纯度。
    5. 加入 5 mL RB，于 180 × g、4 °C 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2，均使用较低设置）。将沉淀重悬于 1 mL RB 中。
  2. gp38+ 祖细胞的分离
    1. 完成步骤 5.9 后，按照步骤 3 所述方法计数细胞，并将最多 106 个细胞（通常合并 4–6 份健康肝组织样本）重悬于 100 µL RB 中。
    2. 向细胞中加入 1:100 的抗 CD64 抗体和 1:100 的抗 CD16/32 抗体，冰上孵育 5 分钟。随后加入 1:100 的生物素标记抗 gp38 抗体，继续冰上孵育 10 分钟。
    3. 加入 5 mL RB，于 180 × g、4 °C 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2，均使用较低设置）。
    4. 将细胞重悬于 400 µL RB 中，加入 5 µL 抗生物素磁珠。在 4 °C 孵育 15 分钟。孵育时间不得超过，否则会降低样本纯度。
    5. 加入 5 mL RB，于 180 × g、4 °C 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2，均使用较低设置）。
    6. 将细胞沉淀重悬于 1 mL RB 中。
  3. 完成步骤 6.1 或 6.2 后的共同步骤
    1. 将含有磁标记细胞悬液的 15 mL 圆锥形离心管置于预冷的 5 孔磁力架上，另准备两个空管用于收集阳性组分和阴性组分。将冷却架放置在分离装置的分离平台上。
    2. 使用阳性选择程序（Possel_d2），并在每个样本之间执行充分的洗涤步骤（启用冲洗选项）。
      注意：若使用柱式手动分离方法替代自动分离装置，将降低样本纯度。
    3. 收集阳性组分，并于 180 × g、4 °C 离心 8 分钟（加速度设为 4，减速度设为 2，均使用较低设置）。
    4. 根据后续实验方案，将细胞沉淀重悬于 RB 或 ST 缓冲液中。
    5. 为检测纯度，取部分细胞 aliquot，并按照步骤 4 所述方法进行染色。

7. 流式细胞术分选细胞

注意：使用下述方案可获得高纯度的任何前体细胞亚群。细胞的总体得率远低于步骤6中所述，最适合用于基因表达分析。

参数设置
喷嘴尺寸85 µm
频率46.00 - 46.20
振幅38.30 - 55.20
相位0
液滴延迟28.68 - 28.84
衰减关闭
首个液滴284 - 297
目标间隙9.-14
压力45 psi

表3.

  1. 从基于磁珠富集的细胞中获取细胞（见步骤5所述）；按照步骤3所述方法进行计数；并按照步骤4所述方法对前体细胞标志物（CD133、gp38）、CD31、ASGPR1 和 CD45 进行染色。
  2. 配制分选缓冲液（SM）：含0.5%（v/v）BSA 和 0.01%（v/v）叠氮化钠的无酚红改良杜尔贝科必需培养基（DMEM）。将染色后的细胞重悬于分选缓冲液中，转移至聚丙烯圆底试管中，并置于冰上。
    注意：叠氮化钠具有高毒性。请使用适当的个人防护装备，如腈类手套、实验服和口罩。若分选后的细胞将用于功能实验，则不得使用叠氮化钠。
  3. 根据所用细胞分选仪的型号选择相应的软件。打开软件，并按照制造商说明设置分选参数和仪器规格。
    注意：仪器规格详见表3。尽管不同机构的仪器配置可能有所不同，但需特别注意，为提高前体细胞群体的存活率以及从分选细胞中提取RNA的质量，必须降低分选压力并使用较大口径的喷嘴（45 psi，85-µm 喷嘴）。设置补偿时应使用富集后的肝前体细胞。其他肝细胞或白细胞群体具有不同的自发荧光特性，会导致间质细胞群分辨率不佳，并造成错误的设门策略。
  4. 校准仪器，并在分选收集装置中放置一个含有350 µL 分选缓冲液的5 mL聚丙烯圆底试管。开始样本采集与分选，收集目标亚群1,000个事件后停止进样。
  5. 将试管从分选仪中取出，并使用流式细胞仪检测分选后的细胞。确定在活细胞中分选细胞群体所占的百分比，该数值即为分选细胞的纯度。
  6. 若分选纯度超过95%，则在分选收集装置中放置一个含有350 µL RLT裂解缓冲液的5 mL聚丙烯圆底试管。
  7. 开始分选，每间质亚群收集7,000–10,000个事件。
  8. 将含有分选细胞的RLT裂解缓冲液转移至无DNase和RNase的反应管中，并将样本保存于-80 °C，直至后续分析。

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结果

本实验采用一种新型酶混合液消化肝脏，可获得包含实质和非实质肝脏细胞的单细胞悬液（图1 和 图2a）。在使用ACK裂解红细胞后，可直接对单细胞悬液进行流式细胞术分析（图1 和 图2）。设门策略包括排除双联体细胞和死细胞（图2a）。选择CD45、CD31和ASGPR1阴性的细胞进行设门，该细胞群包含肝脏前体细胞，可根据其gp38和CD133的表达情况进行分群（图2a）。在健康成年小鼠肝脏中，gp38+CD133+ 和 gp38-CD133+ 细胞是CD45-CD31-ASGPR1- 细胞中最丰富的细胞亚群（图2a、2b）。这些亚群在其他已知与前体细胞相关的表...

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讨论

不同原因引起的肝脏炎症和损伤会触发肝脏的再生过程，伴随前体细胞的扩增和活化2,3。这些肝脏前体细胞具有干细胞特性，可能在多种肝脏疾病的发病机制中发挥重要作用。

长期以来，肝前体细胞的异质性一直被广泛认为存在。通过采用CD133和gp38这一新型表面标志物组合对肝前体细胞亚群进行重新评估，可鉴定出携带不同表面标志物并在肝损伤过程中表达特定炎症相关基因集合的亚群12。本文所述方法可实现对稀有细胞的直接流式细胞术分析，并可在多种肝损伤模型中对其进行直接比较。这一点尤为重要，因为不同类型的损伤可激活多种前体细胞亚群，这可能反映了导管反应中所观察到的细胞异质性3,4,11,12

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本工作获得了亚历山大·冯·洪堡基金会索菲娅·科瓦列夫斯卡娅奖对VLK的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMILife Technologies21875-034
酚红-free DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
Collagenase PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies17105041
ACK 溶解缓冲液Life TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002配制 1% 储存液
10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS 冲洗液Miltenyi Biotec130-091-222加入 0.5% (v/v) BSA 并置于冰上保存
酚红-free DMEMSigma-AldrichD1145
计数微球 Count BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR 封闭试剂Miltenyi Biotec130-092-575
抗-CD31 微珠Miltenyi Biotec130-097-418
抗-CD45 微珠Miltenyi Biotec130-052-301
死细胞去除试剂盒Miltenyi Biotec130-090-101
抗-生物素微珠Miltenyi Biotec130-090-485
CD64 纯化抗体BioLegend139302稀释比例：1:100
CD16/32 纯化抗体BioLegend101302稀释比例：1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116稀释比例：1:200，标记造血细胞
CD31 生物素标记BioLegend102504稀释比例：1:200，标记内皮细胞
ASGPR1 纯化抗体Bio-TechneAF2755-SP稀释比例：1:100，标记肝细胞
Podoplanin APCBioLegend127410稀释比例：1:1,400，标记前体细胞
Podoplanin 生物素标记BioLegend127404稀释比例：1:1,400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210使用 3 µL，标记前体细胞
CD133 生物素标记BioLegend141206稀释比例：1:100
CD34 生物素标记eBioScience13-0341-81稀释比例：1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306稀释比例：1:800
CD157 PEBioLegend140203稀释比例：1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225稀释比例：1:100
Sca-1 生物素标记Miltenyi Biotec130-101-885使用 10 µL
小鼠 IgG2b, κ PEBioLegend400311
大鼠 IgG1 PEBioLegend400407
大鼠 IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
大鼠 IgG2a, κ 生物素标记BioLegend400504
大鼠 IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
叙利亚仓鼠 IgG APCBioLegend402012
叙利亚仓鼠 IgG 生物素标记BioLegend402004
正常山羊 IgG 对照纯化抗体Bio-TechneAB-108-C
驴抗山羊 IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055稀释比例：1:800
链霉亲和素 Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351稀释比例：1:400
100 µm 滤网A. HartensteinPAS3
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro 分离器Miltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva 软件BD Biosciences
聚丙烯圆底管Falcon352063
RNeasy Plus Mini 试剂盒Qiagen74134包含 RLT 裂解缓冲液

参考文献

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