肝脏损伤伴随前体细胞的扩增，这些前体细胞构成一个异质性的细胞群体。对该细胞区室进行新的分类，有助于区分多个细胞亚群。本文所述方法展示了通过流式细胞术分析及高纯度分离各类亚群的技术流程，所获细胞可用于后续多种实验分析。
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本文内容
摘要
摘要
在慢性肝损伤过程中，前体细胞会通过一种称为导管样反应的过程发生扩增，该过程还伴随炎性细胞浸润和上皮细胞活化。目前对这类炎症反应中前体细胞群体的研究主要依赖单一表面标志物，通过组织学分析或基于流式细胞术的技术进行鉴定。然而，新发现的表面标志物揭示了肝前体/干细胞区室中存在功能各异的多个亚群。本文所述方法介绍了利用新型表面标志物组合对前体细胞亚群进行分离及详细的流式细胞术分析。此外，还展示了如何通过自动化磁珠分选和FACS分选技术实现各前体细胞亚群的高纯度分离。尤为重要的是，采用新型且简化的酶解离肝脏组织方法，能够以高于现有其他方法的活性高效分离这些稀有细胞群体。该方法对于进一步研究前体细胞具有重要意义 关键词：肝前体细胞，导管样反应，流式细胞术，细胞分选，酶解离，炎症，肝损伤，细胞亚群 体外 或用于分离高质量RNA以分析基因表达谱。
引言
肝脏再生主要与肝细胞的自我更新能力相关。然而，在慢性肝损伤过程中，前体细胞会被激活并扩增，这一现象与其分化为肝细胞和胆管细胞的能力有关1,2,3,4。这一点尤为重要，因为在慢性损伤期间，肝细胞的增殖并不有效。尽管已有多种针对前体细胞的遗传谱系示踪研究，但它们在肝脏再生中的作用仍存在争议5,6,7,8。此外，前体细胞的激活已被证实与肝脏纤维化反应增强相关，这引发了关于其在损伤过程中确切作用的疑问9,10。
基因表达研究长期提示祖细胞区室具有异质性，这些研究通过显微解剖或基于细胞分选的方法分离出仅表达单一表面标志物的祖细胞1,11。事实上，最....
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方案
所有实验操作均经洪堡大学医学中心伦理与动物护理委员会批准。
1. 材料与缓冲液的准备
- 使用无菌组分和超净工作台新鲜配制肝脏消化所需的所有缓冲液，以避免细菌污染。
- 通过混合49.5 mL RPMI培养基和0.5 mL胎牛血清（FBS；低内毒素，热灭活）配制收集缓冲液（CB），得到1%（v/v）的溶液。将溶液置于冰上保存，直至后续使用。
注意：消化一个完整肝脏大约需要25 mL CB。 - 使用以下组分配制消化缓冲液（DB）：RPMI培养基、1%（v/v）FBS（低内毒素，热灭活）、胶原酶P（0.2 mg/mL）、DNase-I（0.1 mg/mL）和分散酶（0.8 mg/mL）。
注意：消化一个完整肝脏大约需要25 mL DB。使用前将DB在37 °C水浴中预热。 - 酶到达后，用Hanks平衡盐溶液（HBSS；用于胶原酶P和分散酶）或DNase-I缓冲液（50%（v/v）甘油、1 mM MgCl2、20 mM Tris-HCl；pH 7.5）进行重悬，分装后于-20 °C保存。DNase-I缓冲液储存于4 °C，并在两个月内使用完毕。
2. 肝脏单细胞悬液的制备
- 通过颈椎脱位法处死未经处理的野生型小鼠，操作须符合当地伦理委员会和动物护理委员会的规定。 ....
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结果
本实验采用一种新型酶混合物消化肝脏，可获得包含实质和非实质肝脏细胞的单细胞悬液（图1 和 图2a）。在使用ACK缓冲液裂解红细胞后，可直接对单细胞悬液进行流式细胞术分析（图1 和 图2）。设门策略包括排除双联体细胞和死细胞（图2a）。选择CD45、CD31和ASGPR1阴性的细胞进行设门。该细胞群包含肝脏前体细胞，可根据其gp38和CD133的表达情况进行分群（图2a）。在健康成年小鼠肝脏中，gp38+CD133+ 和 gp38-CD133+ 细胞是CD45-CD31-ASGPR1- 细胞中最丰富的细胞亚群（图2a、2b）。这些亚群在其他已知与前体细胞相.......
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讨论
不同原因引起的肝脏炎症和损伤会触发肝脏的再生过程，伴随前体细胞的扩增和活化2,3。这些肝脏前体细胞具有干细胞特性，可能在多种肝脏疾病的发病机制中发挥重要作用。
长期以来，肝前体细胞的异质性一直被广泛认为存在。通过采用CD133和gp38这一新型表面标志物组合对肝前体细胞亚群进行重新评估，可鉴定出携带不同表面标志物并在肝损伤过程中表达特定炎症相关基因集合的亚群12。本文所述方法可实现对稀有细胞的直接流式细胞术分析，并可在多种肝损伤模型中对其进行直接比较。这一点尤为重要，因为不同类型的损伤可激活多种前体细胞亚群，这可能反映了导管反应中所观察到的细胞异质性3,4,11,12
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了亚历山大·冯·洪堡基金会索菲娅·科瓦列夫斯卡娅奖对VLK的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| 酚红-free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK 溶解缓冲液 | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | 配制 1% 储存液 |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS 冲洗液 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | 加入 0.5% (v/v) BSA 并置于冰上保存 |
| 酚红-free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| 计数微球 Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR 封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| 抗-CD31 微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| 抗-CD45 微珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 抗-生物素微珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 纯化抗体 | BioLegend | 139302 | 稀释比例：1:100 |
| CD16/32 纯化抗体 | BioLegend | 101302 | 稀释比例：1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | 稀释比例：1:200，标记造血细胞 |
| CD31 生物素标记 | BioLegend | 102504 | 稀释比例：1:200，标记内皮细胞 |
| ASGPR1 纯化抗体 | Bio-Techne | AF2755-SP | 稀释比例：1:100，标记肝细胞 |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | 稀释比例：1:1,400，标记前体细胞 |
| Podoplanin 生物素标记 | BioLegend | 127404 | 稀释比例：1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | 使用 3 µL，标记前体细胞 |
| CD133 生物素标记 | BioLegend | 141206 | 稀释比例：1:100 |
| CD34 生物素标记 | eBioScience | 13-0341-81 | 稀释比例：1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | 稀释比例：1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | 稀释比例：1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | 稀释比例：1:100 |
| Sca-1 生物素标记 | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | 使用 10 µL |
| 小鼠 IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| 大鼠 IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| 大鼠 IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| 大鼠 IgG2a, κ 生物素标记 | BioLegend | 400504 | |
| 大鼠 IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| 叙利亚仓鼠 IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| 叙利亚仓鼠 IgG 生物素标记 | BioLegend | 402004 | |
| 正常山羊 IgG 对照纯化抗体 | Bio-Techne | AB-108-C | |
| 驴抗山羊 IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | 稀释比例：1:800 |
| 链霉亲和素 Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | 稀释比例：1:400 |
| 100 µm 滤网 | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva 软件 | BD Biosciences | ||
| 聚丙烯圆底管 | Falcon | 352063 | |
| RNeasy Plus Mini 试剂盒 | Qiagen | 74134 | 包含 RLT 裂解缓冲液 |
参考文献
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....
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重印与许可
