健康实验室饲养蜱虫的繁殖对于蜱虫生物学及蜱-病原体相互作用的研究至关重要。本文展示了一种简单、经济且对小鼠应激较小的幼蜱饲喂方案。
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摘要
摘要
Ixodes scapularis 是莱姆病的传播媒介，在美国东部和中西部地区是最为重要的疾病传播媒介之一。该物种为三宿主蜱，每个发育阶段都需要从脊椎动物宿主获取一次血液餐，成年雌蜱还需吸血以完成繁殖。幼蜱附着于宿主身上吸血 3 至 5 天，吸饱血后自行脱离宿主。由于其依赖多种不同宿主，且吸血附着时间较长，这使得在实验室条件下饲养蜱虫变得复杂。然而，为了深入研究蜱虫生物学及其与病原体的相互作用，获得健康且经实验室人工饲养的蜱虫至关重要。本文展示了一种在小鼠身上饲养未成熟蜱虫的简便且经济有效的实验方案。我们对现有方案进行了改进，采用无网底的一次性饲养笼，避免蜱虫接触被小鼠尿液和粪便污染的水分，从而降低小鼠的应激反应，并提高蜱虫的吸血成功率和存活率。
引言
蜱虫是脊椎动物专性吸血的体外寄生虫，广泛分布于全球。在美国，至少有11种蜱虫是具有重要公共卫生意义病原体的传播媒介1。Ixodes scapularis 可传播多种病原体，包括莱姆病（Borrelia burgdorferi）、回归热（B. miyamotoi）、人粒细胞无形体病（Anaplasma phagocytophilum）和巴贝西虫病（Babesia spp.）的致病因子。尽管I. scapularis作为疾病传播媒介具有重要意义，但在野外大量采集这类蛛形纲动物用于实验室研究并不总是可行。因此，健康实验室饲养蜱虫的培育对于蜱虫生物学以及蜱虫与病原体相互作用的研究至关重要。
所有硬蜱（蜱科 Ixodidae），包括I. scapularis，其生命周期均包含卵和三个活动阶段：幼虫、若虫和成虫。每个活动阶段均需取食脊椎动物宿主的血液。蜱与其宿主在附着并吸血数天过程中发生的复杂相互作用，几乎无法通过人工饲喂装置模拟，且使用人工方法也难以获得足够数量的饱血蜱用于大规模饲养2,3,4。因此，通常分别采用活体小鼠和家兔作为宿主，用于饲养未成熟阶段（幼虫和若虫）和成熟阶段（成虫）的蜱。每个发育阶段均需依赖多个宿主进行血液摄取，这使得蜱的饲养过程变得复杂，并且耗时且成本较高5,6,7。大多数蜱的饲养方案要求将小鼠饲养在带有悬空金属丝网底板的笼具中7,8，或置于特定尺寸的圆柱形笼内，使动物无法自由活动和自我梳理6,9,10。
这些圆柱形笼子随后会被转移到带有金属网的鞋盒式笼子中。吸饱血并脱离宿主的蜱虫可从下方的水中收集。然而，该方法会使已吸血的蜱虫暴露于被尿液和粪便污染的水中，从而增加真菌生长和蜱虫死亡的风险9。此外，该方法还增加了蜱虫从水槽中逃逸的可能性，并对小鼠造成应激。为避免这些问题，本文展示了在塑料鞋盒式一次性笼子中进行幼蜱在小鼠身上吸血的方法。该方法可维持小鼠的正常行为，提高吸饱血蜱虫的回收率，并减少因污染导致的蜱虫死亡。
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方案
以下方案（编号-00682）已获得内华达大学雷诺分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循内华达大学雷诺分校动物研究伦理委员会的指导方针。简言之，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过鼻罩维持异氟烷持续吸入20分钟。使用兽医专用眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。通过脚趾夹捏反应评估麻醉深度，并在操作全程监测呼吸频率。小鼠被单独饲养并持续观察，直至意识恢复。每只小鼠仅用于一次蜱虫饲喂实验，在蜱虫回收后实施安乐死。安乐死由实验动物医学实验室工作人员执行，采用CO2吸入结合颈椎脱位法对动物实施安乐死。
注意：操作蜱虫时需使用完整的个人防护装备。在计数未成熟蜱虫时，应穿着白色实验服，佩戴长款腈类手套以覆盖实验服袖口，并用橡皮筋将手套与袖口固定，同时穿包趾鞋。在对小鼠进行蜱虫感染操作时，需佩戴发网、一次性防护服、长袖手套覆盖住防护服袖子，并穿戴鞋套。应使用白色或浅色防护服以便发现逃逸的蜱虫。需定期检查手套和袖子上是否有蜱虫。
1. 动物饲养室的准备
- 指定一个独立的房间用于饲养携带蜱虫的小鼠。在门内外放置粘性垫或双面地毯胶带，以防止蜱虫意外逃逸。
2. 小鼠寄生蜱虫计数
- 在7的顶边周围贴上双面胶带" × 5" ×14" 塑料容器中加水至约 2 cm 处。
- 在容器中央放置另一个小盒子或培养皿，并加水至1 cm高度，形成一个 "护城河" 围绕此容器
- 将含有幼虫或若虫的小瓶存放于培养皿内。
- 使用细毛笔从离心管中移除幼虫或若虫，并在显微镜下计数。将50只幼虫或25只若虫分别放入不同的闪烁计数瓶中。立即用尼龙网或薄纱布覆盖瓶口，并用橡皮筋固定。
3. 用未成熟蜱虫感染小鼠
- 使用白色或浅色工作台，并在工作区域周围贴上双面胶带。
- 用异氟烷麻醉小鼠，通过脚趾夹捏法检查麻醉深度。麻醉成功后，将小鼠转移至铺有纸巾的加热垫上，并连接鼻罩以持续供给异氟烷。
- 涂抹以凡士林为基础的眼膏以防止眼睛干燥。观察小鼠呼吸频率以调节异氟烷浓度（正常呼吸频率为每分钟80–230次；若呼吸频率低于每分钟80次，应降低异氟烷浓度，以避免动物死亡）。
- 取一管含50只幼虫或25只若虫的蜱虫，用画笔将其放置于小鼠耳间头部的毛发下方（图1）。放置后继续保持小鼠处于麻醉状态20分钟，以确保蜱虫有足够时间附着。
- 将小鼠转移至标准的塑料鞋盒式一次性小鼠笼中，笼盖为静态盖，笼内铺白色垫料。按照常规小鼠护理要求，自由提供玩具、水和食物（ad libitum）。
- 将小鼠笼置于较大的大鼠或沙鼠笼内，外层笼子顶部边缘贴有双面胶带。在外层笼底部加入3 cm深的水（图2）。
4. 从小鼠收集蜱虫
- 若虫通常在吸血第3至6天脱离宿主。从第3天起，每天检查饲养笼及水槽中是否有吸饱血的蜱虫。
- 在第4至6天期间，从饲养笼中收集已脱离的蜱虫。使用画笔或软头镊子拾取吸饱血的蜱虫，并将其存放于洁净的闪烁瓶中，瓶口用尼龙网布覆盖，并以橡皮筋固定。
- 在第7天对小鼠进行麻醉，并检查是否仍有附着的蜱虫。
- 在第7天检查垫料、食槽和水瓶中是否有吸饱血的蜱虫。按照前述方法处死小鼠。对一次性饲养笼、垫料、水瓶和食槽进行高压灭菌，以防止未吸血的蜱虫逃逸。
5. 饱血蜱虫的保存
- 将吸饱血的蜱虫置于湿度为90%、温度为20 °C、光周期为12小时光照:12小时黑暗的温湿度可控培养箱中饲养，直至蜕皮发生。此过程可能需要约12至18周。
- 虽然高湿度有利于蜱虫存活，但也容易导致真菌过度生长。需每周至少一次在显微镜下检查已喂食的蜱虫是否有霉菌。若发现霉菌，应将存活的蜱虫用70%乙醇清洗5分钟，再用水冲洗，转移至滤纸上干燥，然后移入新的洁净小瓶中。
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结果
我们改进了现有的蜱虫饲养方案6,10 以提高喂食效率并减少对小鼠宿主的应激。结果表明，标准鞋盒式小鼠笼具非常适合蜱虫饲养。白色垫料为吸血后蜱虫的收集提供了良好的对比背景。大多数蜱在吸血后会爬到容器壁上，便于收集。此外，一次性塑料盒（内华达大学里诺分校UNR常规用于小鼠饲养）的紧密贴合盖子可有效防止蜱虫逃逸。另外，我们未对小鼠进行剃毛处理即进行蜱虫寄生图1这些已发表方案中的修改显著提高了蜱虫的附着、吸血和存活率。
该方案具有成本效益，无需使用任何特殊的小鼠饲养笼，仅需利用现有常规笼具即可。此外，该方法劳动强度较低，因为我们无需每天收集吸血饱食的蜱虫。我们在感染后第4至6天期间收集蜱虫。大多数蜱虫在第4天已自然脱落，剩余少数在第5天脱落。至第7天时，所有小鼠均无蜱虫残留。我们平均回收到67%（范围为52–9...
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讨论
方案中的关键步骤
在饲养蜱虫时，必须采取多级安全措施，以防止蜱虫意外逃逸。使用粘性胶带和水沟隔离是确保安全的关键措施。将麻醉后的小鼠放置在加热垫上以维持其体温恒定，这一点非常重要。我们还发现，剃除小鼠体毛对蜱虫附着并无额外益处。单只小鼠可在指定的"蜱虫饲养室"内同一笼具中饲养一周，这可进一步减少蜱虫与人员的接触机会。
修改与故障排除
高质量实验室饲养蜱虫的生产对于蜱虫生物学及蜱-病原体相互作用的研究至关重要。以往的饲喂方案采用悬挂式金属丝底板8或圆柱形笼具以固定小鼠使其无法移动6,10，这种方法不仅增加成本，还会对动物造成额外应激。此外，悬挂式金属丝笼具允许饱血蜱虫穿过金属丝掉落至含有小鼠尿液和粪便的污染水中，从而增加霉菌生长的风险。
技术的局限性
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢内华达大学里诺分校实验动物医学部门工作人员的帮助。MM 获得了内华达州 INBRE 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 普拉露比兽用软膏 | 亚马逊 | 可从任何宠物商店或在线商店购买 | |
| 一次性小鼠笼具 | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | 包含底盒和顶盖的套装 |
| 白色Alpha dri垫料 | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
参考文献
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重印与许可
