传统的啮齿类动物部分膀胱出口梗阻建模方法常伴随较高的动物死亡率。此外，由于在近端尿道和膀胱颈部周围进行解剖所导致的去神经损伤也是一个主要问题。我们建立并评估了一种安全可靠的中段尿道梗阻模型，避免了传统模型的上述缺陷。
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摘要
摘要
部分膀胱出口梗阻（pBOO）具有高发病率，给患者带来显著负担，并导致巨大的医疗成本。研究pBOO中膀胱重塑最常用的动物模型是雌性啮齿类动物，在其近端尿道处建立部分梗阻。近端梗阻的主要问题在于梗阻程度的变异性以及动物死亡率较高。此外，在近端尿道和膀胱颈周围进行解剖可能损害膀胱的神经支配。
我们开发了一种避免传统模型缺点的保留神经的中段尿道梗阻（NeMO）模型，用于部分膀胱出口梗阻（pBOO）研究。我们从耻骨联合下方入路接近尿道，从而无需进行剖腹手术，也无需在此区域进行解剖；此外，横纹尿道括约肌得以完整保留。我们在雌性Sprague-Dawley大鼠（12只梗阻模型，6只假手术动物）以及雌性C57/bl6小鼠（20只梗阻模型，18只假手术动物）中实施了NeMO手术。术后两周，我们评估了膀胱功能、膀胱质量和体质量。
在梗阻组和假手术组的雌性大鼠中均未出现死亡病例；按照传统的近端膀胱出口梗阻（pBOO）方法，我们在近端尿道及临时放置的0.9 mm金属杆周围结扎缝线。NeMO模型在两周后导致膀胱质量增加85%，部分梗阻大鼠的平均残余尿量为0.4 mL，而假手术动物仅为0.03 mL。在小鼠实验中，我们测试了三种不同规格的导管，在结扎缝线时将其沿尿道放置。我们发现，使用27号导管导致超过50%的动物死亡率；使用25号导管未能引起膀胱质量的预期增加；而采用26号导管则获得了理想结果，动物死亡率极低（1/8），且膀胱质量显著增加至原来的2倍。
引言
部分膀胱出口梗阻（pBOO）具有较高的发病率，可导致严重的膀胱功能障碍1；其病因谱包括先天性畸形（如后尿道瓣膜或尿道下裂）、获得性尿道狭窄以及良性前列腺增生。其中，良性前列腺增生影响超过60岁男性的30%2。由于pBOO给患者带来沉重负担并造成巨大的医疗成本，因此针对膀胱在流出阻力增加情况下的重塑过程开展了大量研究3。2006年至2015年间，PubMed收录的关于pBOO对膀胱影响的研究文章已超过220篇。
尽管已在多种物种中建立了部分膀胱出口梗阻（pBOO）的动物模型4，例如大鼠5、兔6、猪7和小鼠8,9，但目前应用最广泛的动物模型仍是通过部分结扎雌性大鼠近端尿道来建立；然而，这种传统的近端尿道梗阻技术不可避免地需要开腹、暴露膀胱，并对膀胱颈周围组织进行解剖分离。梗阻程度的不一致以及动物死亡率高等问题，仅仅是该操作方法所面临的问题之一10,11；我们先前的研究表明，在假手术动物中，对近端尿道周围的解剖操作会引起生理变化，且这些变化与膀胱颈处神经纤维的丢失相关12。这一发现提示，目前最常用的pBOO动物模型——即在雌性啮齿类动物中对近端尿道进行手术干预——会导致去神经损伤，从而引起膀胱结构和功能的改变，影响假手术组和梗阻组动物。因此，亟需一种可避免去神经损伤的替代方法。我们实验室开发并评估了一种保留神经的中段尿道梗阻（NeMO）技术，该方法能有效诱导膀胱出现预期的梗阻相关改变，如器官质量增加和残余尿量升高，而假手术动物则与未手术对照动物无明显差异。此外，由于横纹尿道括约肌位于解剖平面的近端，因此在该术式中得以完整保留。更重要的是，与传统近端尿道梗阻模型相比，NeMO模型中梗阻所致的膀胱质量增加变异性显著更低，且动物死亡率为零。
我们还成功地将NeMO应用于雌性小鼠，梗阻动物的死亡率低于10%，而迄今为止报道的所有小鼠pBOO模型的死亡率均约为50%。在小鼠pBOO背景下研究膀胱重塑将受益于全套转基因修饰技术的可应用性。
在雌性啮齿类动物中，围绕尿道中段进行分离不会引起传统近端梗阻模型中所观察到的膀胱结构或功能上的不良和混杂性改变。然而，在尿道中段水平诱导部分梗阻仍会如预期般导致膀胱肥厚和残余尿量增加，符合部分膀胱出口梗阻（pBOO）动物模型的特征。重要的是，在小鼠中实施NeMO手术使得利用转基因方法研究pBOO中的膀胱重塑成为可能，而此类方法在较大的啮齿类动物中几乎无法实现。
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方案
以下实验方案已获得本机构动物护理委员会的批准。
1. 雌性大鼠中的 NeMO
- 准备
- 将一只体重约200 g的雌性Sprague-Dawley大鼠置于3%异氟烷麻醉下，称量动物体重，并使用碘伏外科擦洗液对耻骨上区域进行3次剃毛和消毒。
- 将大鼠置于加热垫上，用胶带固定后肢和尾巴，使用20号套管针进行膀胱插管，并轻轻用胶带固定套管针以防止滑动。
- 解剖
- 使用手术刀从可触及的耻骨联合处向尿道外口做一条8 mm的纵向皮肤切口。将切口两侧皮肤掀开，以便后续伤口闭合。
- 使用精细剪刀纵向钝性分离，以识别带支架的尿道。放置精细的自持式皮肤牵开钩，以更好地暴露尿道。
- 在尿道背侧使用弯剪进行轻柔的纵向分离，以建立尿道与阴道之间的解剖间隙。然后，将4-0丝线钝性穿过尿道后方，并准备外科结的双结扣。
- 部分尿道梗阻
- 移除套管针，将一根0.9 mm的金属棒平行置于尿道旁，然后收紧结扎线，使结扎线环绕尿道和金属棒，确保金属棒之后仍可轻松抽出。
- 在抽出金属棒前，以轻柔张力再打3个结加固结扎线。将缝线末端剪至约3 mm长；若实验设计中包含后续解除梗阻，则剪至4 mm长。
- 伤口闭合
- 使用4-0可吸收编织缝线做一针埋藏缝合，对合尿道旁腺体。
- 使用相同的可吸收缝线做埋藏水平褥式缝合关闭皮肤。注意： 尽管使用可吸收缝线进行穿透皮肤的缝合看似非常规，但我们未观察到伤口感染等并发症，且可避免拆线操作。
- 术后护理
- 在将大鼠放入恢复笼之前，皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。
- 术后最初24小时内为单独饲养的大鼠提供软质恢复饮食。此后，若动物状态良好且属于同一处理组，则可恢复术前的配对饲养方式。
- 每日检查大鼠膀胱大小及整体健康状况；至少每周记录一次体重。
2. 雌性小鼠中的 NeMO
- 准备
- 取一只体重约为18 g的雌性C57bl/6小鼠，并按照步骤1.1.1所述进行操作。
- 按照步骤1.1.2所述进行操作，但使用24号套管针。
- 解剖
- 使用手术刀从可触及的耻骨联合处向尿道外口做一条长约6 mm的纵向皮肤切口。
- 用精细剪刀纵向钝性分离，以识别带支架的尿道；通过类似的钝性解剖方法，将沿尿道腹侧走行的神经血管束分离并抬起。
- 在尿道背侧使用弯剪进行轻柔的纵向分离，以建立尿道与阴道之间的解剖间隙。随后，将一根5-0不可吸收编织缝线钝性穿过尿道后方，并准备外科结的双圈结扎。
- 部分尿道梗阻
- 将套管针连接1 mL注射器，向膀胱内注入0.1 mL生理盐水。
- 将26号套管平行置于尿道旁，一边缓慢撤出套管针，一边轻轻收紧围绕尿道和套管的结扎线。
- 在移除套管前，再以轻柔张力打三个结加固结扎。
- 轻压小鼠膀胱，观察尿道外口是否有尿液流出；若无法排出尿液，则说明结扎过紧，需适当松解。否则，将缝线末端剪至约3 mm长。
- 伤口闭合
- 使用5-0编织可吸收缝线，采用皮下水平褥式缝合法关闭皮肤。
- 术后护理
- 在将小鼠放入恢复笼之前，皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。
- 术后前48小时内为单独饲养的小鼠提供软质恢复饮食。此后，若小鼠状态良好且属于同一处理组，则可重新按术前方式群养。
注意：术后24小时后触诊发现膀胱明显膨胀且在操作时无法排尿的小鼠，提示梗阻过度，如不立即在麻醉下拆除结扎线，将在接下来的1–2天内死亡。 - 每日检查小鼠膀胱大小及整体健康状况；至少每周记录一次体重。
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结果
雌性大鼠保留神经的中段尿道梗阻模型（NeMO）
死亡率
迄今为止，我们对40多只雌性大鼠进行了中段尿道梗阻手术，未出现任何死亡病例。
膀胱肿块
假手术组动物在术后两周的平均相对膀胱质量（膀胱质量与体重之比）为0.33%，而梗阻组大鼠的平均相对膀胱质量为0.60%，相当于增加了85%（p = 0.004；图1）。
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讨论
动物死亡率是传统近端尿道部分膀胱出口梗阻（pBOO）模型的主要问题之一，在许多研究报告中死亡率高达15%或更高10,11,13。NeMO在雌性大鼠中应用时表现出极低的死亡率。小鼠的近端尿道梗阻在技术上比大鼠更具挑战性，因此更易出现并发症。采用26号套管作为中段尿道操作的占位器时，动物死亡率极低。在一项正在进行的研究中，我们仅使用26号套管对雌性小鼠实施NeMO，18只小鼠中仅有2只因过度梗阻而死亡（数据未显示）。若使用更小的占位器（如27号套管），则超过一半的梗阻小鼠会因过度梗阻导致尿潴留或膀胱破裂而死亡。因此，我们认为对于体重约18 g的雌性小鼠，26号套管是较为合适的占位器规格。
膀胱质量增加是人类下尿路梗阻（pBOO）疾病的标志性特征之一。我们发现，NeMO 在大鼠和小鼠中仅用 2 周即可有效诱导膀胱质量显著增加。在近端尿道...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由 CHIR 运行拨款（DJB）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雌性大鼠 | Charles-River Canada | Sprague Dawley 大鼠 (Crl:SD)；品系编号：400 | 约 200 g |
| 异氟烷蒸发器 | Benson Medical Industries Inc. | TEC III 异氟烷；产品编号：53-T3ISO | |
| 异氟烷 | Fresenius Kabi 动物健康公司 | 异氟烷；产品编号 CP0406V2 | 250 mL 瓶装 |
| 一次性手术刀 | Ted Pella, Inc. | #15 无菌不锈钢手术刀；目录编号 549-9-15S | |
| 显微镊 | Ted Pella, Inc. | Aesculap 显微镊，精细尖端，115 mm；产品编号 5443 | |
| Adson 镊子 | Ted Pella, Inc. | Aesculap Adson 解剖镊，弯曲型，120 mm；产品编号 5002-9 | |
| 弯曲手术剪 | Ted Pella, Inc. | 手术剪，弯曲型，不锈钢，105 mm；目录编号 1376 | |
| 0.9 mm 不锈钢金属杆 | goodfellow.com | 不锈钢 - AISI 316L，线径：0.9 mm；订单编号 911-684-65 | |
| 皮肤牵开钩 - 自制，由不锈钢制成 | goodfellow.com | 不锈钢 - AISI 316L，线径：0.9 mm；订单编号 911-684-65 | |
| 4-0 丝线缝合线 | esutures.com | 4-0 Sofsilk 黑色 98" 单股；产品编号 LS640 | |
| 5-0 Vicryl 缝合线 | esutures.com | 5-0 Vicryl 未染色 27" RB-1 锥形针；产品编号 J213H | |
| 持针器 | Medsupplier.com | Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner 持针器 - 5 1/2"；产品编号 SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC | |
| Temgesic（布托啡诺） | First Veterinary Supply | Buprenex 0.3 mg/mL 注射剂安瓿；货号 #075701 | |
| 带 27 G 针头的 1 mL 注射器 | Fisher Scientific | BD 结核菌素注射器，BD 309623 | |
| 20 G 安全留置针（Angiocath） | Fisher Scientific | Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA；目录编号 NC9561906 | |
| 恢复期饮食 | clearh2o | DietGel 31M；72-08-5022 | |
| C57Bl/6 雌性小鼠 | Charles-River Canada | C57BL/6 小鼠 (C57BL/6NCrI)；品系编号：027 | 约 18 g |
| 24 G 安全留置针（Angiocath） | Fisher Scientific | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24G×3/4IN；目录编号 NC9814340 | |
| 5-0 Ethibond 缝合线 | esutures.com | 5-0 Ethibond 绿色 30" RB-1 锥形针；产品编号 X550H | |
| 26 G 注射器针头 | Sigma-Aldrich | BD PrecisionGlide 注射器针头，规格 26；z192392 | |
| 生理盐水 | Baxter | 0.9% 氯化钠注射液，USP，100 mL MINI-BAG；产品编号 2B0043 |
参考文献
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