小鼠微创横主动脉缩窄术

摘要

微创横主动脉缩窄术（MTAC）保留了常规横主动脉缩窄术（TAC）的核心要素，同时避免了气管插管和呼吸机的使用。该方法在左心室超负荷的高通量研究中表现出显著优势，尤其适用于转化医学研究。

摘要

微创横主动脉缩窄术（MTAC）是一种比标准开胸横主动脉缩窄术（TAC）更理想的用于小鼠横主动脉缩窄的方法。尽管横主动脉缩窄是诱导左心室高压的一种高效方法，但由于需要使用气管插管进行人工通气，该手术操作更为复杂且耗时较长。TAC的存活率通常也较低，而较新的MTAC方法则无需切断肋骨和肋间肌，也无需进行气管插管及建立通气装置。在MTAC中，不同于通过开胸手术进入胸腔，主动脉弓是通过前颈部正中切口到达的。将甲状腺向后牵拉以暴露胸骨切迹，随后沿胸骨纵行切开至第二肋水平，通过分离结缔组织和胸腺即可暴露主动脉弓。在此位置，可将缝线环绕主动脉弓并与间隔物结扎，然后关闭胸骨切口和皮肤。MTAC是一种更快捷、创伤更小的诱导左心室高血压的方法，有助于实现高通量研究。缩窄的成功可通过高频经胸超声心动图进行验证，特别是利用彩色多普勒和脉冲波多普勒技术，评估主动脉弓及左、右颈动脉的血流速度、血管直径，以及左心室功能与形态。成功的缩窄还会引发显著的组织病理学改变，例如心肌细胞肥大以及间质性和血管周围纤维化。本文描述了MTAC的操作步骤，并展示了如何通过超声心动图、大体形态学及心脏组织病理学变化来检测颈动脉血流的改变。

引言

本文的主要目的是展示如何改进小鼠横主动脉缩窄术（TAC），以实现更简单、更快速的手术操作。TAC 最初于1991年被提出¹，使分子生物学家能够研究导致左心室肥厚及心力衰竭的细胞和分子通路，尤其适用于基因组经过修饰的小型动物模型^2,3,4,5,6。尽管该技术在诱导所需压力超负荷方面具有显著效果，但其应用仍受限于手术操作难度较大以及术后存活率较低的问题。实施TAC手术的外科医生必须掌握经气管插管、开胸术，并能够使用人工通气，以防止肺塌陷¹。

通常需要一种更简单且侵入性更小的方法。因此，人们设计出了微创横主动脉缩窄术（minimally invasive transverse aortic constriction, MTAC）³。尽管其结果（特别是左心室肥厚）相同，但该手术所需的设备显著减少，且对动物造成的损伤更小。MTAC被证明是一种理想的方法，其术后存活率超过90%，手术时间仅需15至25分钟。手术成功后偶发的死亡病例，通常是由于主动脉弓缩窄过紧，导致左心室负荷过大，并引起向肾脏等重要器官的血液供应严重减少，进而造成致命后果。

手术完成后，可采用超声心动图评估缩窄效果以及心脏形态和功能。可使用高频超声系统测量左右颈动脉的直径和血流变化，观察主动脉弓缩窄处的峰值血流速度，并测定左心室壁厚度及功能参数^7,8。安乐死后，还可取器官进行组织病理学研究，包括苏木精-伊红染色和天狼星红胶原染色，后者特别适用于观察纤维化。

方案

本方案遵循香港大学教学与科研使用活体动物委员会（CULATR）的指导原则。

1. 手术部位准备

1. 用75%异丙醇对操作部位进行消毒。将加热垫温度调节至37 °C，以避免实验动物心率和呼吸频率发生变化。
2. 使用在121 °C下通过重力置换灭菌器灭菌30分钟或其他适当方法灭菌的外科器械。
3. 取2–4根30号针头，用持针器将其弯曲，如图1所示，制成用于结扎和组织分离的工具，并可作为牵开器使用。将弯曲后的针头固定在棉签上，供手术中使用。
4. 将一根27号针头钝化，并用持针器将其弯曲90º。通过在硬质表面摩擦使针尖平滑，以制成结扎步骤中使用的0.4 mm间距器。

2. 动物准备

1. 根据体重，使用适量的氯胺酮和赛拉嗪混合物对一只2月龄、雄性、22–25 g的C57BL/6N小鼠进行腹腔注射麻醉：100 mg/kg + 10 mg/kg。通过无尾夹反射确认麻醉效果。
2. 将脱毛膏涂抹于小鼠颈部前侧和胸部，持续2至3分钟以去除毛发。随后用温水和棉签擦除脱毛膏。
3. 在动物眼睛上涂抹眼用软膏或凝胶，以防止角膜干燥。
4. 将动物仰卧位放置于加热垫上，并进行术中监测，确保每15分钟记录一次相关数据。
5. 使用外科纸胶带将四肢固定在加热垫上，以确保手术过程中动物保持正确体位。
6. 交替使用酒精和聚维酮碘溶液对皮肤进行三次消毒。
7. 使用带有暴露手术区域的无菌铺巾以防止污染。每只小鼠均需佩戴新的无菌手套，并根据需要及时更换。

3. 连接步骤

1. 用手术刀在小鼠颈部和胸部中线位置切开皮肤。
2. 用钝头剪刀轻轻分离结缔组织，将甲状腺向头部方向牵拉。
3. 用弯针从中线处将气管上的肌肉层向两侧分离。
4. 使用钝头剪刀将胸骨剪至第二肋骨（约5 mm），用牵开器或弯头镊子撑开切口。
5. 用弯针分离胸腺叶之间及其与下胸部胸壁之间的结缔组织，此时横位主动脉弓和两条颈总动脉将清晰可见。
6. 将弯针置于主动脉弓下方，推动针头从对侧穿出，穿透血管壁与结缔组织之间的间隙。
7. 用弯针将6-0单丝缝线从主动脉弓下方穿过。
8. 将垫片置于缝线环中，打双结固定缝线，然后轻柔移除垫片。
9. 通过观察结扎位置确认缩窄成功，并剪去缝线末端。
10. 使用6/0丝线以间断缝合方式关闭胸壁，再用6-0单丝缝线以连续缝合方式关闭皮肤。

4. 术后护理

1. 将聚维酮碘溶液涂抹于缝合部位，并将动物置于预热的笼子中进行恢复和术后监测。
2. 动物意识恢复后，皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg，每12小时一次）以缓解疼痛，并为小鼠提供适宜的软质食物。
3. 待动物完全恢复后，将其放回12小时光照/12小时黑暗循环的房间。

5. 超声心动图：结扎成功的确认及测量

1. 一周后，使用 3 - 5% 异氟烷（诱导麻醉）和 1 - 1.5% 异氟烷（维持麻醉），以 1 L/min 的氧气流速，对先前结扎的小鼠进行麻醉。
2. 使用脱毛膏去除胸部毛发，并用温水和棉签彻底清除脱毛膏。
3. 将小鼠仰卧位固定在保持在 37 °C 的动物操作平台上。在四肢涂抹导电凝胶，并用胶带将其固定在带有电极的垫子上。
4. 在小鼠胸部涂抹超声耦合剂。使用 40-MHz MS550D 探头和高频超声系统，对左侧和右侧颈总动脉以及主动脉弓进行彩色多普勒和脉冲波多普勒扫描。
5. 使用 B 模式定位左心室。使用 M 模式测量收缩期和舒张期的心室壁厚度。根据需要使用动态存储（Cine Store）和帧存储（Frame Store）功能保存数据和图像。
6. 使用 B 模式定位左侧颈总动脉分支前段。使用脉冲波多普勒和彩色多普勒评估血流情况。在右侧颈总动脉相似位置重复上述操作。以动态存储和帧存储模式保存图像，以便后续分析。
7. 将动物操作平台向最左侧倾斜，使小鼠处于左侧卧位。将探头置于小鼠胸壁旁正中位置，与头部平行方向偏转 30°，调节 X 和 Y 方向以定位主动脉弓。
8. 定位狭窄部位。使用彩色多普勒模式使狭窄部位更清晰可见，因为血流将通过主动脉弓分出左右颈总动脉之间的狭窄通道。
9. 使用脉冲波多普勒和彩色多普勒测量峰值血流速度。根据需要使用动态存储和帧存储功能保存数据和图像。
10. 让动物俯卧于加热垫上恢复。待其完全从麻醉中恢复后，将其放回原饲养笼，置于 12 小时光照/12 小时黑暗循环的环境中。

结果

MTAC 能够及时诱导左心室产生显著的高血压。

如图1所示，该手术主要工具的制备过程简单且所需材料极少，仅需将2至4根30号针头弯曲，并用聚氨酯管固定即可。与TAC相比，手术操作本身也较为简便，易于实施。在牵开甲状腺后，剪开胸骨并移动胸腺以获得清晰视野。此时可清楚定位主动脉弓，便于进行结扎操作（图2）。

MTAC 能够在结扎小鼠中稳定地诱导左心室压力超负荷。图 3 清晰地展示了这一点，在图 3C 中可以明显观察到缩窄的横行主动脉，以及在图 3D 中缩窄部位的峰值血流速度增加。相比之下，假手术小鼠（见图 3A 和图 3...

讨论

Rockman 及其同事设计了首个主动脉缩窄方法，用于研究心脏的压力超负荷。这使得研究人员能够开始揭示高血压和心力衰竭的细胞与分子机制¹。一种改进的方法——微创横主动脉缩窄术（MTAC）——提供了一种易于操作、时间可控的左心室压力超负荷和心力衰竭诱导方法，克服了传统横主动脉缩窄术的诸多缺点⁹。与TAC相比，该手术操作显著更简便，且动物存活率更高。该方法的主要优势在于，能够在使用更少设备、更低手术技巧要求和更短手术时间的情况下，实现相同甚至更优的主动脉缩窄实验效果。

TAC 手术中的开胸方法能够更充分地暴露并清晰观察整个心脏及血管结构。其潜在优势在于可轻松与其他手术操作联合进行，例如在实施主动脉弓缩窄的同时，还可进行肺动脉缩窄以造成右心室压力超负荷，或进行冠状动脉结扎以建立缺血模型。相比之下，微创方法仅适用于升主动脉或横位主动脉弓的缩窄，无法用于其他类型的手术操作。

值得注意的是，该方法已被以多种方式进行了调整和改进。在某些情况下，使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 英寸 30 号针头	BD，美国新泽西州富兰克林湖 07417。	305128	按操作步骤弯曲，如图 1所示
27 号针头	BD，美国新泽西州富兰克林湖 07417。	301629	磨钝并抛光，用作间隔器
6/0 Dafilon	B. Braun，德国黑森州梅尔松根 34212。	C0933066
6/0 Silkam	B. Braun，德国黑森州梅尔松根 34212。	C0762067
无菌手套	A.R. Medicom, Inc (Asia)，中国香港。
棉签	Mannings，中国香港鲗鱼涌。		本地购物中心
脱毛膏	Veet（中国香港），中国香港九龙观塘。		本地购物中心
Lexer-婴儿剪刀	FST，加拿大不列颠哥伦比亚省 V7H 0A6。	14078-10
弯头虹膜镊	FST，加拿大不列颠哥伦比亚省 V7H 0A6。	11065-07
微型 Olsen-Hegar 持针器	WPI，美国佛罗里达州萨拉索塔 34240。	501989
体视显微镜	WPI，美国佛罗里达州萨拉索塔 34240。	PZMIII-BS
GenTeal 眼用凝胶	诺华（Novartis），美国新泽西州东汉诺威 07936。		本地药房
加热垫	Kent Scientific Corporation，美国康涅狄格州托灵顿 06790。	DCT-20
手术胶带	实验动物中心
氯胺酮和赛拉嗪	实验动物中心
聚维酮碘	实验动物中心
丁丙诺啡	实验动物中心