评估环境化学品对蜜蜂从个体到群体水平发育的影响

摘要

在此我们展示 一种向单只蜜蜂及蜂群饲喂含农药食物的方法。该方法通过评估农药对单只蜜蜂的影响来研究其效应。 体内 基础幼虫饲料的饲喂以及蜂巢群体的自然状态

摘要

养蜂环境中农药的存在是影响蜜蜂生存最严重的问题之一。蜜蜂在喷洒过农药的花朵上觅食后，可能将农药带回蜂巢。受农药污染的食物会在工蜂之间传递，进而被用来饲喂幼虫，因此可能影响蜜蜂的发育。因此，环境中的残留农药可能成为对蜜蜂种群造成长期损害的因素，并逐渐导致蜂群崩溃。本方案中描述并应用了蜜蜂饲喂方法，可用于单只蜜蜂或整个蜂群。此处使用了一种广泛用于控制害虫、但对蜜蜂幼虫和蛹的发育有害的昆虫生长调节剂（IGR）——吡丙醚（PPN）作为示例农药。该方法也可应用于其他潜在有害化学物质或蜜蜂病原体的进一步研究。

引言

环境中农药的存在是影响蜜蜂生存的最严重问题之一^1,2,3。多项研究已证实，蜜蜂蜂群及蜂产品中普遍存在农药残留。在中国台湾，每年每公顷平均施用农药量为11-12 kg（2005年至2013年数据）。中国台湾的农药使用量高于欧盟国家和拉丁美洲国家^4,5。换言之，养蜂环境正面临严重的农药胁迫，尤其在中国台湾，其他一些国家也可能存在类似情况。

蜜蜂Apis mellifera 是农业系统中主要的传粉昆虫之一⁶，同时还能生产蜂蜜等有价值的产品。然而，蜜蜂会接触到多种农药，这些农药可能在蜜蜂采集喷洒过农药的花朵中的花蜜和花粉时被带回蜂巢^7,8。此外，养蜂人为了控制蜂巢内部的病虫害问题，也可能直接使用农药，从而使蜜蜂暴露于农药之中^9,10,11。由于蜜蜂幼虫的发育依赖于工蜂饲喂，因此幼虫、雄蜂甚至蜂王都可能接触到被农药污染的花蜜和花粉¹²。因此，有必要评估各种农药对蜜蜂的毒性作用¹³。

人们已做出诸多努力来评估环境中的农药残留问题。Yang et al. 研究了神经毒性杀虫剂吡虫啉对蜂巢中蜜蜂幼虫发育的影响，报道指出亚致死剂量的吡虫啉会导致成年蜜蜂出现嗅觉关联行为异常¹⁴。此外，Urlacher et al. 在实验室条件下考察了有机磷杀虫剂毒死蜱对工蜂学习能力的亚致死效应¹⁵。在我们之前的研究中，评估了昆虫生长调节剂（IGR）吡丙醚（PPN）对蜜蜂幼虫的影响¹⁶。

本文介绍了评估化学物质对蜜蜂发育影响的方法。描述并应用了蜜蜂饲喂方法，可用于个体蜜蜂或整个蜂群。首先，我们在蜂群中测试了不同浓度的农药污染基础幼虫饲料（BLD）对幼虫的影响，以评估农药对个体蜜蜂的体内（in vivo）作用。随后，我们通过在蜂箱中使用含有农药污染的糖浆来模拟农药在自然环境中的实际暴露条件。在本方法中，PPN作为一种广泛用于防治害虫昆虫的农药¹⁷，已被证实对蜜蜂幼虫和蛹的发育具有危害性^16,18,19，将作为指示剂代表农药在田间产生的负面效应。

方案

1. 准备工作

1. 配制 1 L 的 50% 糖浆。将 1 kg 蔗糖溶解于 1 L 去离子水（ddH₂O）中。
2. 在基础幼虫饲料（BLD）中配制吡丙醚（PPN）溶液。配制 1.1 L 浓度为 10,000 ppm 的 PPN 原液，并取 100 mL PPN 溶液加入 1 L 灭菌去离子水（ddH₂O）中稀释。4 °C 保存。
3. 将 PPN 原液用 BLD 稀释至终浓度分别为 0.1、1、10 和 100 mg/kg（ppm），用于后续实验。
4. 配制含 PPN 的糖浆（用于蜂群水平实验）。将 PPN 原液加入 50% 糖浆中，稀释至终浓度为 10 和 100 ppm，用于后续实验。
5. 蜜蜂饲养。
   注：本实验地点为中国台湾宜兰市的国立宜兰大学（NIU）养蜂场；（GPS 坐标：N24.747278，E121.746200）。
   1. 每周检查蜜蜂（Apis mellifera L.）蜂群的食物存量，必要时补充 1 升 50% 糖浆（当蜂蜜储存区为空时）。将健康蜂群定义为每个蜂群具有 9 个巢脾的蜜蜂巢房，且蜂王正常产卵。
6. 配制 100 mL 基础幼虫饲料（BLD）。将 6% D-葡萄糖、6% 果糖和 1% 酵母提取物溶解于灭菌去离子水（ddH₂O）中，并添加 50% 蜂王浆。4 °C 保存，但不超过 3 天。
   注：实验前预热至 35 °C，并在 3 天内使用完毕。

2. 体内 喂养方法

注意： 体内 取食方法已根据汉利氏方法进行了修改 等²⁰

1. 蜜蜂幼虫的选择与标记
   1. 插入蜂王隔离板，将一个健康蜂群的9个巢脾分为4个巢脾和5个巢脾两部分，限制蜂王在4个巢脾的区域内活动。在4个巢脾的区域内至少保留一个空巢脾，供蜂王产卵。
   2. 蜂王产卵1天后，检查巢框上卵的出现情况，并将卵保留在蜂箱内72小时（第4^th 天）直至1日龄幼虫孵化。从试验蜂箱中手动取出一个含有1日龄工蜂幼虫（24小时内孵化）的巢框，并用蜂刷将工蜂从巢框上清除。
   3. 用透明载玻片（尺寸 = 长 × 宽 × 厚 = 29.7 mm × 21 mm × 0.1 mm）覆盖框架，并用图钉将透明载玻片固定在框架边缘图1A).
   4. 每种处理随机选取50只一日龄幼虫（4龄）^th 天）并在透明载玻片上用永久性记号笔标记每个子代细胞图1A 和 1B).
      注意：使用永久性记号笔在框架和透明载玻片上标注每种处理的信息，以避免不同处理之间的混淆。取出已标记的载玻片并妥善保存以备后续使用 体内 喂养与观察。
2. 体内 喂养。
   1. 在第1、2、3天，根据幼虫日龄的摄食量，分别用移液器向每个标记的育雏细胞中加入不同浓度的PPN-BLD（0.1、1、10和100 ppm），加样体积分别为10 μL、10 μL和20 μL。对照组加入等量的BLD（不含PPN）。由此，每个标记育雏细胞中PPN-BLD的总剂量累积为4、40、400和4,000 pg。
      注意：通过标记的透明滑片识别已标记的育雏巢房，并在饲喂后移除这些透明滑片。使用新鲜的BLD进行饲喂，以防止工蜂清理育雏巢房。
   2. 将经PPN处理的载玻片放回原始菌落，以进行进一步观察。
      注意：每种处理在四个菌落中设置四个生物学重复。
3. 第7天观察经处理的幼虫。
   1. 为观察经PPN处理的幼虫，将标记好的透明载玻片放回框架中，记录标记的蛹室内的死亡率和封盖率。
4. 第13天观察处理后的蛹及羽化率
   1. 去除封盖子房中的蜂蜡。
   2. 将软头镊子插入蜂房中，轻轻夹住蛹，然后缓缓取出。
   3. 将蛹转移至24孔细胞培养板中，每孔底部垫有双层实验室用纸巾。记录蛹在转移过程中的损伤和死亡情况。
   4. 将24孔组织培养板置于34 °C、70%相对湿度的培养箱中孵育，直至出芽约 8天。
   5. 观察并记录蛹及羽化的蜜蜂。
5. 统计学
   1. 计算记录的数据，并以均值 ± 标准差表示。
   2. 使用SAS软件进行方差分析（ANOVA），并采用最小显著差异（LSD）检验方法分析不同处理间均值的差异。将统计学显著性定义为 P-值 <0.05。表格中同一列内不同的字母表示经统计分析存在显著性差异。

3. 蜂群水平上PPN的毒性

1. 建立蜜蜂群体。
   1. 插入一个蜂王隔离栅，垂直分隔健康蜂群中的9个巢脾，分为4个巢脾（A部分）和5个巢脾（B部分），同时限制蜂王仅在4个巢脾的区域内活动。在4个巢脾区域中至少保留一个空巢脾，供蜂王产卵。
      注意：在蜂王所在区域上方再放置另一个蜂王隔离栅，防止蜂王在两部分之间移动。
   2. 蜂王产卵1天后，检查巢脾上是否有卵出现。用手从A部分取出含有卵的合适巢脾，并用蜂刷清除巢脾上的工蜂。
   3. 用透明载玻片覆盖巢脾，并用图钉将透明载玻片固定在巢脾边缘。
   4. 随机选择100个含有卵的幼虫巢房，使用永久性记号笔在透明载玻片上标记每个巢房。将这100个巢房指定为第1组。使用永久性记号笔在巢脾和透明载玻片上写明各处理组的信息，以避免不同处理组之间的混淆。
   5. 将标记好的巢脾放回A部分饲养3天，然后将蜂王转移到B部分进行产卵。
   6. 1天后，检查B部分的巢脾，选择一个合适的巢脾，并按照步骤3.1.4的方法标记100个含有卵的幼虫巢房。将这100个巢房指定为第2组。
   7. 将标记好的巢脾放回B部分饲养3天，然后将蜂王转移回A部分进行产卵。
   8. 在A部分和B部分之间再重复进行6次蜂王交换，并依次按数字编号分组（图2）。总共应有9个组。
2. 在第13天用含PPN的糖浆处理蜜蜂蜂群（图2）。
   1. 在塑料蜂饲喂盒（宽 × 长 × 高 = 20 cm × 30 cm × 3.5 cm）中加入1 L含10或100 ppm PPN的50%糖浆，并将饲喂盒放置在实验蜂群巢脾上方。
      注意：第1组在第13天不接受PPN处理，因为其幼虫巢房已经封盖。
   2. 对照组使用1 L不含PPN的50%糖浆进行饲喂，方法同步骤2.2。
3. 在第5天统计1日龄幼虫数量，并记录每组100个标记巢房的卵孵化率（图2）。蜜蜂卵通常需要3天孵化为0日龄幼虫；因此，在第1天检查并标记100个含卵的巢房，并在第5天统计每组1日龄幼虫的数量，以计算孵化率百分比。
4. 在第11天统计封盖的幼虫巢房数量，并记录每组100个标记巢房的幼虫封盖率（图2）。6至7日龄的幼虫巢房会被工蜂用蜂蜡封盖，以供幼虫化蛹。
5. 观察蛹的发育情况，并在第17天记录每组100个标记巢房的羽化率（图2）。
   1. 去除封盖幼虫巢房的蜂蜡，用尖端柔软的镊子轻轻取出蛹。将蛹转移至24孔细胞培养板中，每个孔下方垫有双层实验室纸巾。
   2. 将24孔细胞培养板置于34 °C、70%相对湿度的培养箱中，直至成蜂羽化。
   3. 持续观察并记录每组蛹的发育及成蜂羽化情况，直至第9组（共49个实验日）。
      注意：每种处理设置四个生物学重复。
6. 统计分析
   1. 计算记录的数据，并以均值 ± 标准差（SD）表示。
   2. 采用Student双尾t检验分析每组中不同处理对之间的显著差异（例如 0 ppm/10 ppm、10 ppm/100 ppm 和 0 ppm/100 ppm）。若P值 < 0.05，则定义为具有统计学显著性。

结果

在蜜蜂田间试验中，将蜂王限制在4框区域内产卵。此步骤可提高单个巢脾中的幼虫密度，便于后续观察。每个处理组均进行标记，并通过透明观察窗清晰记录蜜蜂的发育过程。in vivo 喂食法将PPN-BLD喂给蜂巢中的蜜蜂幼虫，以精确评估PPN对蜂群中蜜蜂发育的影响。采用in vivo 喂食方法有助于观察化学处理对蜂巢的影响。

对于每一种PPN-BLD剂量，共标记并处理了五十个育雏巢房。添加PPN-BLD后，将处理过的巢脾放回原始蜂群中，在自然条件下进行观察。PPN-BLD对蜜蜂幼虫阶段的负面影响易于观察，呈现出剂量依赖性效应。表1列出了在较高两个剂量（10和100 ppm）下于幼虫阶段死亡的蜜蜂数量。如表1所示，在0.1和1 ppm两个剂量下，封盖率、出房天数和羽化率与0 ppm组（添加BLD食物）或未饲喂对照组相比无显著差异，仅在1 ppm剂量下出现翅膀畸形...

讨论

蜂王限制产卵法和蜂王交换法是本方案中建立用于田间试验的蜜蜂群体的关键步骤。蜂王限制产卵法可实现蜜蜂生命周期的同步化，从而使研究人员能够选取同日龄的1日龄幼虫，用于不同剂量农药的处理。在蜂王交换法中，将蜂王在A部分（4个巢框）和B部分（5个巢框）之间进行交换，以获得不同发育阶段的蜜蜂个体，用于田间试验，评估农药及其残留物的影响。此外，在田间试验中使用透明载玻片标记并记录大量选定的蛹室。然而，蜂王过度产卵时有发生，可能导致可供产卵的空蛹室不足。因此，采用蜂王交换法时需提前准备空巢框。 alternatively，也可采用蜂王限制产卵法在蜂箱中制备不同组别的蜜蜂用于试验。将巢框分为A部分2个框和B部分7个框，并将蜂王置于A部分（2个框）内，可限制蜂王仅在这2个框内产卵。

对于 体内 饲喂方法，将PPN-BLD加入每个育虫室中。蜜蜂对BLD的接受度高于糖浆。^16,20蜜蜂幼虫可以在由蜂王浆、糖类、酵母提取物和蒸馏水组成的人工饲料上存活并生长

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蜜蜂箱	SAN-YI Honey Factory	W1266	蜜蜂饲养
蜂王隔离板（置于巢框之间）	SAN-YI Honey Factory	I1575	限制蜂王活动范围
蜂王隔离板（置于顶部）	SAN-YI Honey Factory	I1566	顶部蜂王限制
蜂刷	SAN-YI Honey Factory, 中国台湾	W1414	轻柔清理巢框上的蜜蜂
饲喂器	SAN-YI Honey Factory, 中国台湾	P0219	向蜂群饲喂糖浆
透明胶片	Wan-Shih-Chei, 中国台湾 (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)	1139	在巢框上标记幼虫区域（材料：聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET）（尺寸 = 长 × 宽 × 厚 = 29.7 mm × 21 mm × 0.1 mm）
24孔组织培养板	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	TCP011024	饲养从蜂巢中取出的蛹
高压灭菌器	Tomin medical equipmenco., LTD.	TM-321	制备灭菌去离子蒸馏水 (ddH2O)
P20 移液器	Gilson	F123600	将PPN加入蜜蜂幼虫食物池中
培养箱	Yihder Co., Ltd.	LE-550RD	饲养从蜂巢中取出的蛹
吸水纸（Kimwipes）	COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD	KCS34155	饲养从蜂巢中取出的蛹
蜂王浆	国立宜兰大学 (NIU)	NIU	制备基础幼虫饲料（BLD）
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G8270	制备基础幼虫饲料（BLD）
D-(-)-果糖	Sigma	F0127	制备基础幼虫饲料（BLD）
酵母提取物	CONDA, pronadisa	1702	制备基础幼虫饲料（BLD）
蔗糖	台湾糖业公司	E01071010	制备蜜蜂饲料用糖浆
烯虫醚（11%）	利农化学股份有限公司	登记证号 1937	实验中使用的昆虫生长调节剂（IGR）