在此我们展示 一种向单只蜜蜂及蜂群饲喂含农药食物的方法。该方法通过评估农药对单只蜜蜂的影响来研究其效应。 体内 基础幼虫饲料的饲喂以及蜂巢群体的自然状态
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摘要
摘要
养蜂环境中农药的存在是影响蜜蜂生存最严重的问题之一。蜜蜂在喷洒过农药的花朵上觅食后，可能将农药带回蜂巢。受农药污染的食物会在工蜂之间传递，进而被用来饲喂幼虫，因此可能影响蜜蜂的发育。因此，环境中的残留农药可能成为对蜜蜂种群造成长期损害的因素，并逐渐导致蜂群崩溃。本方案中描述并应用了蜜蜂饲喂方法，可用于单只蜜蜂或整个蜂群。此处使用了一种广泛用于控制害虫、但对蜜蜂幼虫和蛹的发育有害的昆虫生长调节剂（IGR）——吡丙醚（PPN）作为示例农药。该方法也可应用于其他潜在有害化学物质或蜜蜂病原体的进一步研究。
引言
环境中农药的存在是影响蜜蜂生存的最严重问题之一1,2,3。多项研究已证实，蜜蜂蜂群及蜂产品中普遍存在农药残留。在中国台湾，每年每公顷平均施用农药量为11-12 kg（2005年至2013年数据）。中国台湾的农药使用量高于欧盟国家和拉丁美洲国家4,5。换言之，养蜂环境正面临严重的农药胁迫，尤其在中国台湾，其他一些国家也可能存在类似情况。
蜜蜂Apis mellifera 是农业系统中主要的传粉昆虫之一6，同时还能生产蜂蜜等有价值的产品。然而，蜜蜂会接触到多种农药，这些农药可能在蜜蜂采集喷洒过农药的花朵中的花蜜和花粉时被带回蜂巢7,8。此外，养蜂人为了控制蜂巢内部的病虫害问题，也可能直接使用农药，从而使蜜蜂暴露于农药之中9,10,
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方案
1. 准备工作
- 配制 1 L 的 50% 糖浆。将 1 kg 蔗糖溶解于 1 L 去离子水（ddH2O）中。
- 在基础幼虫饲料（BLD）中配制吡丙醚（PPN）溶液。配制 1.1 L 浓度为 10,000 ppm 的 PPN 原液，并取 100 mL PPN 溶液加入 1 L 灭菌去离子水（ddH2O）中稀释。4 °C 保存。
- 将 PPN 原液用 BLD 稀释至终浓度分别为 0.1、1、10 和 100 mg/kg（ppm），用于后续实验。
- 配制含 PPN 的糖浆（用于蜂群水平实验）。将 PPN 原液加入 50% 糖浆中，稀释至终浓度为 10 和 100 ppm，用于后续实验。
- 蜜蜂饲养。
注：本实验地点为中国台湾宜兰市的国立宜兰大学（NIU）养蜂场；（GPS 坐标：N24.747278，E121.746200）。- 每周检查蜜蜂（Apis mellifera L.）蜂群的食物存量，必要时补充 1 升 50% 糖浆（当蜂蜜储存区为空时）。将健康蜂群定义为每个蜂群具有 9 个巢脾的蜜蜂巢房，且蜂王正常产卵。
- 配制 100 mL 基础幼虫饲料（BLD）。将 6% D-葡萄糖、6% 果糖和 1% 酵母提取物溶解于灭菌去离子水（ddH2O）中，并添加 50%....
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结果
在蜜蜂田间试验中，将蜂王限制在4框区域中产卵。此步骤可提高单框内的子脾密度，便于后续观察。每个处理均进行标记，并通过透明观察板清晰记录蜜蜂的发育过程。 在体 在蜂巢中对蜜蜂幼虫饲喂PPN-BLD，以精确评估PPN对蜂群中蜜蜂发育的影响。利用 体内 饲喂方法有助于观察化学处理对蜂巢的影响。
对于每种PPN-BLD剂量，共标记并处理了五十个育雏巢房。添加PPN-BLD后，将处理过的巢脾放回原始蜂群中，在自然条件下进行观察。PPN-BLD对蜜蜂幼虫阶段的负面影响易于观察，且呈现出剂量依赖性效应。表1列出了在较高剂量（10和100 ppm）下于幼虫阶段死亡的蜜蜂数量。如表1所示，在0.1和1 ppm两个剂量下，封盖率、出房时间和羽化率与对照组（添加BLD食物）或未饲喂对照组相比无显著差异，仅在1 ppm剂量下出现翅膀畸形的蜜蜂比例显著升高。在较低浓度的PPN.......
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讨论
蜂王限制产卵法和蜂王交换法是本方案中建立用于田间试验的蜜蜂群体的关键步骤。蜂王限制产卵法可实现蜜蜂生命周期的同步化，从而使研究人员能够选取同日龄的1日龄幼虫，用于不同剂量农药的处理。在蜂王交换法中，将蜂王在A部分（4个巢框）和B部分（5个巢框）之间进行交换，以获得不同发育阶段的蜜蜂个体，用于田间试验，评估农药及其残留物的影响。此外，在田间试验中使用透明载玻片标记并记录大量选定的蛹室。然而，蜂王过度产卵时有发生，可能导致可供产卵的空蛹室不足。因此，采用蜂王交换法时需提前准备空巢框。 alternatively，也可采用蜂王限制产卵法在蜂箱中制备不同组别的蜜蜂用于试验。将巢框分为A部分2个框和B部分7个框，并将蜂王置于A部分（2个框）内，可限制蜂王仅在这2个框内产卵。
对于 体内 饲喂方法，将PPN-BLD加入每个育虫室中。蜜蜂对BLD的接受度高于糖浆。16,20蜜蜂幼虫可以在由蜂王浆、糖类、酵母提取物和蒸馏水组成的人工饲料上存活并生长
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由行政院农业委员会动植物防疫检疫局资助，项目编号为105AS-13.2.3-BQ-B1；并由科技部（MOST）资助，项目编号为103-2313-B-197-002-MY3。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蜜蜂箱 | SAN-YI Honey Factory | W1266 | 蜜蜂饲养 |
| 蜂王隔离板（置于巢框之间） | SAN-YI Honey Factory | I1575 | 限制蜂王活动范围 |
| 蜂王隔离板（置于顶部） | SAN-YI Honey Factory | I1566 | 顶部蜂王限制 |
| 蜂刷 | SAN-YI Honey Factory, 中国台湾 | W1414 | 轻柔清理巢框上的蜜蜂 |
| 饲喂器 | SAN-YI Honey Factory, 中国台湾 | P0219 | 向蜂群饲喂糖浆 |
| 透明胶片 | Wan-Shih-Chei, 中国台湾 (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | 在巢框上标记幼虫区域（材料：聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET）（尺寸 = 长 × 宽 × 厚 = 29.7 mm × 21 mm × 0.1 mm） |
| 24孔组织培养板 | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | 饲养从蜂巢中取出的蛹 |
| 高压灭菌器 | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | 制备灭菌去离子蒸馏水 (ddH2O) |
| P20 移液器 | Gilson | F123600 | 将PPN加入蜜蜂幼虫食物池中 |
| 培养箱 | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | 饲养从蜂巢中取出的蛹 |
| 吸水纸（Kimwipes） | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | 饲养从蜂巢中取出的蛹 |
| 蜂王浆 | 国立宜兰大学 (NIU) | NIU | 制备基础幼虫饲料（BLD） |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G8270 | 制备基础幼虫饲料（BLD） |
| D-(-)-果糖 | Sigma | F0127 | 制备基础幼虫饲料（BLD） |
| 酵母提取物 | CONDA, pronadisa | 1702 | 制备基础幼虫饲料（BLD） |
| 蔗糖 | 台湾糖业公司 | E01071010 | 制备蜜蜂饲料用糖浆 |
| 烯虫醚（11%） | 利农化学股份有限公司 | 登记证号 1937 | 实验中使用的昆虫生长调节剂（IGR） |
参考文献
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemica....
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