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方法文章

利用合成生物学构建可与可编程材料相互作用的活细胞

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DOI：

10.3791/55300

⸱

2017年3月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Engineering Science and Mechanics Program, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一系列用于开发工程化细胞和功能化表面的实验方案，这些方案能够使合成工程化的大肠杆菌（E. coli）控制和操控可编程材料表面。

摘要

我们开发了一种非生物-生物界面，可使工程化细胞调控功能化表面的材料特性。该系统由两个模块构成：一种经合成改造的大肠杆菌（E. coli）菌株和一种功能化材料界面。本文详细描述了利用分子克隆策略对大肠杆菌（E. coli）菌株进行基因工程改造以实现特定行为的实验方案。该菌株构建完成后，在接触化学诱导剂时可产生较高水平的生物素。此外，我们还详细阐述了构建两种不同功能化表面的实验方案，这两种表面均能响应细胞合成的生物素。综上所述，我们提出了一种构建耦合型非生物-生物系统的方法，该系统可使工程化细胞调控非生命基底上的材料组成与组装过程。

引言

本文报道了一种可编程底物的制备方法，该底物能够响应基因工程细胞系释放的化学信号。1 我们通过构建一种生物素-链霉亲和素界面来实现这一目标，该界面可响应由合成改造的Escherichia coli (E. coli)细胞所产生的生物素。此前，可编程表面已被广泛应用于多种领域，包括毒素检测2、即时诊断3以及国防与安全4。尽管可编程表面可作为传感器和驱动器发挥重要作用，但若赋予其适应不同环境挑战的能力，则可使其变得更加"智能"。相比之下，即使是大肠杆菌（E. coli）等结构简单的微生物也具有内在的适应性，能够以复杂且常出人意料的方式应对环境挑战。这种适应性使得受其复杂基因网络调控的E. coli群体能够高效地寻找资源5、生成高附加值产物6，甚至驱动微尺度机器人系统7。通过将活细胞的适应性优势与可编程表面相结合，我们能够构建出一种可响应不同环境条件的智能底物。

合成生物学赋予了研究人员编程生物行为的新能力。通过构建含有新型基因调控网络的工程化细胞，研究人员能够设计出表现出多种编程行为的细胞。8,9 除了基础研究之外，这些行为还可用于控制材料组装和生物合成高附加值产品等应用。10 在此，我们详细阐述了如何利用合成生物学工具对 E. coli 能够通过诱导合成生物素的菌株。该菌株通过限制性内切酶克隆方法构建质粒pKE1-lacI-bioB而获得。将该质粒转化至 E. coli 菌株K-12 MG1655赋予细胞高表达bioB的能力，bioB是生物素合成所必需的酶。当转化后的细胞用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导并提供生物素前体去硫生物素（DTB）时，可产生较高水平的生物素。

生物素与链霉亲和素之间的结合相互作用是自然界中最强的非共价键之一。因此，生物素-链霉亲和素相互作用已被充分表征，并在生物技术领域得到广泛应用。11 在本文中，我们提出了两种利用生物素-链霉亲和素相互作用来感应和检测细胞产生生物素的功能化表面策略。我们将这些性质不同的表面称为 "间接的" 和 "直接" 对照方案。在间接对照方案中，细胞产生的生物素与已共价连接并固定在聚苯乙烯表面的生物素竞争结合链霉亲和素的结合位点。此外，链霉亲和素与辣根过氧化物酶（HRP）共轭。HRP修饰3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺（TMB），产生光学信号。12 可通过定量光谱吸光度来监测即，450 nm 处的光密度（OD）450因此，这种间接控制方案使得研究人员能够通过监测OD的衰减来测量细胞产生的生物素450 信号

直接控制方案利用链霉亲和素-生物素反应，将链霉亲和素直接固定在材料表面，使细胞产生的生物素与生物素化的辣根过氧化物酶（HRP）竞争结合链霉亲和素的结合位点。同样，通过检测OD450信号来监测细胞产生生物素的相对水平。

综上所述，通过在活细胞中诱导形成网络，工程化细胞与功能化表面使我们能够调控可编程表面的特性。换句话说，我们构建了一个系统，通过将这两个系统连接在一起，充分利用了生物体的适应性以及工程材料界面的可靠性与可设计性。

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方案

1. 培养基与培养体系准备

  1. 通过将 25 g LB 粉末培养基与 1 L 去离子水（DI 水）混合，并在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟，制备 LB（Lysogeny broth）培养基。
    1. 制备 LB 平板时，在灭菌前向 LB 培养基中加入 15 g 琼脂（1.5%）
    2. 用去离子水配制 1,000 倍浓度的羧苄青霉素（Cb）储备液（50 mg/mL）。
    3. 若制备含有抗生素的 LB 培养基以筛选抗性转化子，需等待灭菌后的 LB 培养基温度降至 60 °C 以下，然后每 1 mL LB 培养基中加入 1 µL 抗生素储备液。
  2. 对于 M9 最小培养基（表 1），分别配制以下储备液：5X M9 盐溶液（56.4 g/L）、1 M MgSO4、1 M CaCl2、20% 葡萄糖和 2% 无生物素酪蛋白氨基酸。
    1. 在可高压灭菌的瓶中，加入 20 mL 5X M9 盐溶液、200 µL 1 M MgSO4、10 µL 1 M CaCl2、2 mL 20% 葡萄糖、1 mL 2% 无生物素酪蛋白氨基酸以及 76.8 mL 去离子水。
    2. 将步骤 1.2.1 中配制的溶液在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
  3. 所有培养物均在 37 °C、400 rpm 振荡条件下培养。培养时间根据实验和菌株不同而有所变化，通常为 8 至 12 小时。

2. 生物素生产菌株的构建 E. coli （质粒 pKE1-lacI-bioB）

注意：该基因回路由两部分组成：一部分是由 PL,tetO-1 启动子驱动的 lacI 阻遏蛋白，由于缺乏 tetR 阻遏蛋白，因此会实现组成型表达；另一部分是包含 Ptrc-2 启动子的生物素表达系统，其后接一个强核糖体结合位点（rbs），驱动 bioB 的表达。所有克隆操作均在一种商业化的快速分裂的 E. coli 菌株中进行。最终构建的质粒被转化至 E. coli MG1655WT 中用于测试。引物（表 2）为商业化采购。

  1. 分离 bioB 基因来自 E. coli 通过全细胞聚合酶链式反应（PCR）扩增基因组：
    1. 培养 E. coli MG 1655WT 细胞过夜培养于 37 °C.
    2. 在0.2 mL PCR管中，混合 1 µL 步骤 2.1.1 中制备的过夜培养物 9 µL 无菌去离子水。
    3. 将试管在指定条件下孵育 95 °C 在PCR仪中孵育5分钟，然后立即将离心管转移至-80 °C -80°C 冻存 10 分钟以裂解细胞。这一步骤可使基因组 DNA 作为 PCR 模板使用。
    4. 解冻溶液并加入 (i) 2.5 µL 引物nBioB2-f1和nBioB2-r中的每一个，(ii) 5 µL 5× DNA聚合酶缓冲液，(iii) 0.25 µL DNA聚合酶，(iv) 0.5 µL dNTP混合物，以及(v) 6.75 µL 去离子水，总体积为 25 µL (表4).
    5. 敲击（即轻轻弹击离心管以混匀内容物。随后立即快速离心管体约 2 秒，确保样品完全沉降至管底。
    6. 将试管放入PCR仪中，并使用下述程序 表3 3分钟的额外步骤 95 °C 在方案开始时
    7. 使用含溴化乙锭的1.0–1.2%琼脂糖凝胶（溶剂为去离子水，缓冲液为Tris-乙酸-EDTA缓冲液[TAE]）进行凝胶电泳，验证PCR是否成功。PCR产物长度应为1,070 bp。
    8. 根据制造商说明书，使用商业试剂盒从步骤 2.1.7 的凝胶中提取 DNA 片段。
  2. 分离 Ptrc-2 启动子和 lacI 来自质粒pKDL071的操纵子13 （由麻省理工学院 James Collins 实验室提供）：
    1. 培养 E. coli 含 pKDL071 质粒的细胞在 LB + Cb 培养基中过夜培养 37 °C.
    2. 使用商业质粒小提试剂盒，按照制造商说明书从细胞中提取质粒DNA。该质粒将作为PCR模板。
    3. 按照以下修改后的步骤，遵循 PCR 方案中的 2.1.4 至 2.1.8 步骤：
    4. 在步骤 2.2.2 中，用质粒提取物替换已裂解的细胞。
    5. 使用 2.5 µL 引物1-f和1-r各 lacI 胶带提取。或者，使用 2.5 µL nBioB1-f 和 nBioB1-r 引物各一个用于 Ptrc-2 提取
    6. 进行凝胶电泳（步骤 2.1.7）以确认 PCR 产物是否为预期大小 lacI 盒式结构与Ptrc-2 启动子位点。它们的长度应分别为1213 bp和109 bp。
  3. 使用重叠延伸拼接（SOE）PCR 构建包含 P 的 bioB 盒式结构trc-2，引物 nBioB2-f2 中的人工核糖体结合位点 (RBS)，以及 bioB 基因。热循环仪的PCR程序见于 表3.
  4. 插入载体（PL,tetO-1 + lacI 和 Ptrc-2 + bioB ) 连接到 pKE1-MCS 质粒载体中13 骨架（由麻省理工学院 James Collins 实验室惠赠），通过使用限制性内切酶对载体和插入片段进行消化：
    1. 使用限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳提取基因。每个反应体系包含（i） 5 µL 10x 反应缓冲液 1 µL 限制性内切酶1，(iii) 1 µL 限制性内切酶2的，(iv) 至少 1 µg DNA，以及（v）去离子水补足至终体积 50 µL (表5）。用 AatII 和 EcoRI 酶进行消化 lacI cassette 以及限制性内切酶 HindIII 和 SacII bioB 盒式结构
    2. 反应体系构建完成后，立即涡旋混匀，并短暂离心（约 2 秒），随后在 37 °C 下孵育 1 小时 37 °C.
    3. 消化过程中，根据标准方案制备用于电泳的凝胶。
    4. 将消化后的DNA与6x凝胶电泳上样缓冲液混合。
    5. 使用2-log梯度DNA标记物确认目标条带位置，从凝胶中切下目的DNA片段，并根据生产商说明书使用商业化的凝胶回收试剂盒回收DNA片段。
  5. 使用分光光度法测定DNA浓度，并利用公式1计算插入片段与载体摩尔比为0:1、1:1和3:1时所需的体积。
    化学平衡方程，偏摩尔量公式。 公式 1
    在公式1中，M 是插入片段与载体的比率（0、1 或 3），Xi 是插入DNA的数量，bpi 是插入片段的长度，单位为碱基对（bp）v 是该向量的长度，单位为碱基对，Xv 是载体的量（50 ng）。
  6. 通过混合以下组分来配制连接反应：(i) 1 µL 10X 连接酶缓冲液，(ii) 1 µL T4连接酶，(iii) 50 ng载体DNA，(iv) 针对每个反应特异的插入DNA质量，以及(v) 去离子水至 10 µL 总反应体积（表6).
  7. 室温（RT）孵育1小时。
  8. 在步骤2.7的连接反应孵育期间，制备感受态细胞。
    1. 将1 mL过夜培养物分装至1.5 mL离心管中。
    2. 在16,200 × g下离心1分钟。
    3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 冰冷（置于冰上）的 100 mM CaCl2轻轻吹打重悬沉淀。 不要涡旋震荡。
    4. 将微量离心管置于冰上 10 分钟。
    5. 离心，弃上清，将沉淀重悬于 100 µL 冰冷的 100 mM CaCl2，再次将试管置于冰上。
    6. 离心管子最后一次，并将沉淀重悬于 50 µL 冰冷的 100 mM CaCl2.
    7. 将试管置于冰上，并立即使用化学感受态细胞。
  9. 添加 5 µL 将步骤 2.6 和 2.7 制备的连接 DNA 分别加入步骤 2.8 制备的感受态细胞各管中。
  10. 轻轻敲击试管侧壁以短暂振荡，然后将试管置于冰上静置30分钟。
  11. 将试管在 45 秒内进行热激处理 42 °C 将离心管放回冰上静置2分钟。
  12. 用移液器将细胞接种至含抗生素的LB选择性琼脂平板上，使用玻璃涂布珠涂布细胞。
  13. 37 °C，过夜孵育培养板 37 °C.
  14. 次日早晨，从插入阳性平板中挑取菌落（即，1:1 和 3:1 平板）。如果 0:1 阴性对照平板无菌落生长，则挑取 3 个菌落；如果 0:1 平板有菌落生长，则挑取 5–8 个菌落。用挑取的菌落接种 5 mL LB + 抗生素培养基，于 37°C 培养 8 小时 37 °C 振荡。
  15. 使用质粒小提试剂盒，按照制造商说明书从细胞中提取质粒DNA。使用限制性内切酶进行酶切验证（操作步骤同2.4.1节所述）。
  16. 通过将消化后的DNA片段长度与预期正确构建体的结果进行比较，鉴定含有成功构建体的细胞。含有成功质粒构建体的菌液可通过与等体积的经无菌滤膜过滤的40%甘油（溶于去离子水中）混合，并将混合物于-80 °C冻存以进行保存。80 °C.
    注意：将质粒转化至其他 E. coli 菌株（即，MG1655WT）可通过上述制备化学感受态细胞的步骤完成。

3. 细胞表征：生长曲线与剂量反应

  1. 在含有适当抗生素的 LB 培养基中过夜培养工程菌株。
  2. 进行生长曲线实验时，按如下方法制备 50 mL 含或不含 IPTG（来自 0.5 M 储液）和/或 DTB（来自 500 µg/mL 储液）的最低限度 M9 培养基：
    1. 制备含 0 ng/mL DTB（0 µL 储液）/ 0 mM IPTG（0 µL 储液）的培养基。
    2. 制备含 200 ng/mL DTB（200 µL 储液）/ 0 mM IPTG（0 µL 储液）的培养基。
    3. 制备含 0 ng/mL DTB（0 µL 储液）/ 0.5 mM IPTG（50 µL 储液）的培养基。
    4. 制备含 200 ng/mL DTB（200 µL 储液）/ 0.5 mM IPTG（50 µL 储液）的培养基。
    5. 以上述指定培养基按 1:100 的比例接种过夜培养物。
    6. 在 96 孔板中，每孔加入 200 µL 培养物，每个样本设三个重复孔。
    7. 在酶标仪中于 37 °C 持续振荡培养，每 5 分钟测量一次 OD600 ，持续 24 小时。
  3. 进行剂量反应研究时，将 pKE1-lacI-bioB 质粒中的 bioB 基因替换为 mCherry（一种红色荧光蛋白），以实现实时光学定量。
  4. 在 LB 培养基中添加浓度范围为 0.1 mM 至 5 mM 的不同量 IPTG 以诱导表达。
  5. 按 1:100 的稀释比例接种过夜培养物。
  6. 每 30 分钟测量一次荧光强度，持续 15 小时。

4. 诱导工程细胞产生生物素及上清液制备

  1. 在 LB 培养基中过夜培养携带 pKE1-lacI-bioB 质粒的 E. coli MG1655 菌株。
  2. 在 M9 培养基中添加 30 至 200 ng/mL 浓度范围的 DTB。
  3. 加入 0.5 mM IPTG 以诱导生物素合成。
  4. 将过夜培养物按 1:100 的比例接种至补充了 DTB且不含生物素的最小M9培养基中。
  5. 培养 24 小时后，离心收集细胞，获得富含生物素的上清液。
  6. 分别使用间接对照和直接对照功能化表面检测富含生物素的上清液。在步骤 5.23 和 6.12 中，以上清液替代生物素样品进行操作。

5. 间接控制方案功能化表面的制备

  1. 配制以下溶液。
    1. 配制 SMCC 溶液，其中包含 20 mg/mL 的琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）溶于二甲基亚砜（DMSO）中。
    2. 配制 SPDP 溶液，其中含 20 mg/mL 琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯（SPDP）的 DMSO 溶液。
    3. 将LC-LC-biotin溶于DMSO，配制成20 mg/mL的溶液。
    4. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制10 mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）。
    5. 在 PBS 中配制 10 mg/mL 的链霉亲和素（SA）。
    6. 在 PBS 中配制 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液。
    7. 在去离子水中配制 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
    8. 在 PBS 中配制 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。
    9. 在 PBS 中配制 0.5% 的酪蛋白溶液。
    10. 在去离子水中配制20%吐温80储备液。
    11. 在 PBS 中配制 0.05% Tween 80（来自 20% 储存液）。
    12. 用去离子水配制 50 mM 的醋酸钠溶液。
    13. 将TMB配制成1%的DMSO溶液。
    14. 制备3% H2O2 在去离子水中。
    15. 制备 2 M H2SO4 在去离子水中.
  2. 添加 1.4 µL SPDP 溶液的 20 µL SA 溶液。
  3. 将5.2步骤所得溶液于室温避光孵育1.5小时，用铝箔包裹以避免光照。此步骤使SPDP交联剂通过氨基与SA结合，形成吡啶二硫键活化的SA。
  4. 添加 2.4 µL 将 DDT 溶液加入步骤 5.3 所得溶液中，室温孵育 1 小时。此过程可使吡啶-2-硫酮发生裂解，从而生成巯基活化的 SA。
  5. 添加 7.5 µL SMCC 溶液至 72 µL HRP溶液，室温孵育1.5小时，用铝箔包裹以避光。此过程可得到由氨基连接的马来酰亚胺活化HRP。
  6. 混合 17 µL LC-LC-生物素溶液 200 µL BSA溶液中避光孵育1.5小时，室温下进行，用铝箔包裹以避免光照。此步骤可使生物素通过酰胺键与BSA结合。
  7. 将步骤5.4、5.5和5.6中的溶液分别转移至装有离心浓缩装置的离心管中。
  8. 对于含有 SA-SPDP 的离心管，从步骤 5.4 开始，以 10,000 x g 离心，直至管内液体体积达到 100 µL 或16分钟。将离心管加满至 500 µL 用 PBS-EDTA。
    1. 重复步骤 5.8 五次。将原液储存于 4 °C.
  9. 对于含有 HRP-SMCC 的离心管，从步骤 5.5 开始，以 10,000 x g 离心，直至体积达到 25 µL 或16分钟。将离心管加满至 500 µL 用 PBS 冲洗。
    1. 重复步骤 5.9 五次。将储备液保存于 4 °C.
  10. 对于含有 BSA-生物素的离心管，从步骤 5.6 开始，以 10,000 x g 离心，直至体积达到 100 µL 或12分钟。将离心管装至满 500 µL 用 PBS 冲洗。
    1. 重复步骤 5.10 四次。
    2. 在 10,000 x g 条件下离心，直至体积减少至 100 µL 或 12 分钟。加入 100 µL 加入 PBS 至离心管中。将储备液保存于 4 °C.
  11. 添加 25 µL 10 mg/mL HRP 溶液的 25 µL 10 mg/mL SA 溶液，于 4 °C 过夜。这会导致SA通过硫醚键与HRP共价结合。
    1. 将过夜溶液配制成1:4的工作液，并储存于 4 °C 冰箱。将剩余溶液储存于 -20 °C.
  12. 配制两种含有BSA-Biotin（或BSA）的PBS溶液，通过加入 10 µL BSA-biotin 储液（或 10 µL BSA 储存液）至 490 µL PBS。
  13. 添加 100 µL 将步骤5.12中的溶液加入至96孔聚苯乙烯板的每个孔中。
  14. 在培养板中孵育 37 °C 孵育1小时，用铝箔包裹。
  15. 用 0.05% Tween 80 洗涤平板的孔。
    1. 添加 200 µL 加入 0.05% PBS-Tween 80 至各孔中，室温孵育 2 分钟，弃去液体。
    2. 重复步骤 5.15.1 三次。
  16. 添加 200 µL 向96孔板的每个孔中加入0.5%酪蛋白溶液。
  17. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 1小时。
  18. 重复步骤 5.15，洗涤各孔三次。
  19. 将12 mL的0.5%酪蛋白溶液与 7.5 µL 0.05% 吐温 80
  20. 使用步骤 5.19 中配制的溶液将 SA-HRP 储存液按 1:10,000 比例稀释。
  21. 添加 80 µL 将步骤5.20中配制的溶液加入96孔板的每孔中。
  22. 添加 20 µL 将制备的生物素样品加入聚苯乙烯板的每个孔中。步骤4.6中制备的上清液可作为本步骤的生物素样品使用。
  23. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 孵育1小时。此步骤可使游离生物素与固定的BSA-生物素竞争结合SA-HRP的结合位点。
  24. 重复步骤 5.15，洗涤各孔三次。
  25. 混合50 mM醋酸钠溶液、1% TMB溶液和3% H2O2 以1,000:10:1的比例配制溶液（总体积20 mL）。
  26. 添加 200 µL 将步骤5.25中的溶液加入每孔，室温下避光孵育15分钟。
  27. 添加 50 µL 2 M H的2SO4 向每孔加入以终止反应。测定OD值450 使用酶标仪。

6. 直接控制方案功能化表面的制备

  1. 配制以下溶液。
    1. 在DMSO中配制20 mg/mL的LC-LC-biotin溶液。
    2. 在 PBS 中配制 10 mg/mL 的 HRP。
    3. 准备 0.17 µg/mL PBS 中的 SA。
    4. 在 PBS 中配制 0.5% 的酪蛋白溶液。
    5. 在去离子水中配制20%吐温80储备液。
    6. 在 PBS 中配制 0.05% Tween 80（来自 20% 储存液）。
    7. 用去离子水配制 50 mM 的醋酸钠溶液。
    8. 将TMB配制成1%的DMSO溶液。
    9. 制备3% H2O2 在去离子水中。
    10. 制备 2 M H2SO4 在去离子水中.
  2. 添加 7.5 µL LC-LC-生物素至 72 µL HRP，室温避光孵育1.5小时，用铝箔包裹以避免光照。此步骤使生物素通过酰胺键与HRP偶联。
  3. 将第6.2步的溶液转移至离心浓缩管中的离心管内
    1. 在 10,000 x g 条件下离心溶液，直至体积减少至 100 µL 或12分钟。将离心管加满至 500 µL 用 PBS 洗涤，并重复离心和添加 PBS 四次。将原液储存于 4 °C.
  4. 加入 100 µL 将6.1.3中的SA溶液加入至96孔聚苯乙烯板的每个孔中。
  5. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 1 小时，用铝箔包裹。
  6. 用 0.05% Tween 80 洗涤板孔。
    1. 添加 200 µL 加入0.05% Tween 80至各孔中，室温孵育2分钟，倾去液体。
    2. 重复 6.6.1 三次。
  7. 添加 200 µL 向96孔板的每个孔中加入0.5%酪蛋白溶液。
  8. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 1小时。
  9. 重复步骤 6.6 三次以洗涤各孔。
  10. 使用6.3步骤中配制的溶液将生物素-HRP储备液稀释1:10,000。
  11. 添加 80 µL 将步骤6.10中配制的溶液加入96孔板的每个孔中。
  12. 添加 20 µL 将制备的生物素样品加入聚苯乙烯板的每个孔中。步骤4.6中制备的上清液可作为此步骤中的生物素样品使用。
  13. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 孵育1小时。此步骤可使游离生物素与生物素标记的辣根过氧化物酶（biotin-HRP）竞争结合固定化的链霉亲和素（SA）位点。
  14. 重复步骤6.6，洗涤各孔三次。
  15. 混合50 mM醋酸钠溶液、1% TMB溶液和3% H2O2 以1,000:10:1的比例配制溶液（总体积20 mL）。
  16. 添加 200 µL 将步骤6.15中的溶液加入每孔，室温避光孵育15分钟。
  17. 添加 50 µL 2 M H的2SO4 向每孔加入终止液以终止反应。测定OD值450 使用酶标仪。

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结果

代表性结果如随附的五幅图所示。首先，我们以图形方式展示了克隆过程（图1），以便读者能够直观地了解构建合成改造的大肠杆菌（E. coli）菌株的关键步骤。为了表征细胞的群体动态，我们提供了一条通过测量菌群在600 nm处的光密度（OD600）所生成的生长曲线（图2）。接着，我们展示了如何通过使用mCherry作为bioB的替代指标来验证调控基因网络（图3），从而能够通过光学方法测量细胞在IPTG诱导后所产生的bioB的相对含量。然后，我们展示了间接控制和直接控制功能化表面的响应数据。这些数据图（图4）是通过使用已知浓度的游离生物素溶液来表征功能化表面的响应特性而获得的。最后，我们展示了特征性数据，显示工程化细胞如何被诱导产生生物素（图5），从而对功能化表面进行修饰。

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讨论

我们提出了一种将工程化活细胞与功能化材料表面相连接的新策略。该策略通过构建一种能够在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下合成高水平生物素的细胞系来实现。所产生的高水平生物素可用于修饰功能化表面。文中详细描述了如何构建大肠杆菌（E. coli）细胞系，以及如何制备两种不同的功能化表面。

在构建工程细胞系的整个过程中，存在多个关键步骤。为避免后续问题，建议对工程细胞株进行生长曲线（图2）和荧光响应（图3）的表征。若实验过程中出现问题，可在适当步骤中采用其他分子克隆策略，例如PCR扩增和Gibson组装14作为替代。为优化工程细胞系的生物素产量，必须确保向细胞提供足量的DTB。在我们的研究中发现，当细胞经IPTG诱导时，添加200 ng/mL DTB可显著且统计学上显著地提高生物素的产量。此外，BSA-Biotin、SA-HRP和Biotin-HRP的成功偶联对于有效实施和监测间接与直接对照方案至关重要。操作时应注意避免不必要的光照，并将偶联物在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢美国空军科学研究办公室授予的 FA9550-13-1-0108 项目资助。作者还感谢美国海军研究办公室授予的 N00014-15-1-2502 项目资助、弗吉尼亚理工学院与州立大学关键技术和应用科学研究所的资助，以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（资助编号 1607310）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB肉汤，Miller 费舍尔科技12-795-027
琼脂费舍尔科技BP9744500
羧苄青霉素 费舍尔科技BP26481
M9最小盐溶液，5倍浓度西格玛-奥德里奇M6030
酪蛋白氨基酸 费舍尔科技BP1424-100
无水硫酸镁费舍尔科技M65-500
二水合氯化钙费舍尔科技C79-500
无水右旋糖（D-葡萄糖）费舍尔科技D16-1
NEB Turbo细胞系新英格兰生物实验室C2984l
寡核苷酸引物赛默飞世尔科技N/A25N合成，DSL纯化
Q5高保真聚合酶新英格兰生物实验室M0491S
Q5反应缓冲液新英格兰生物实验室B9027S
dNTP溶液混合物新英格兰生物实验室N0447S
琼脂糖BioexpressE-3120-125
溴化乙锭，1%费舍尔科技BP1302-10
凝胶回收试剂盒Epoch Biolabs2260250
GenCatch质粒DNA小量提取试剂盒Epoch Biolabs2160250
AatII新英格兰生物实验室R0117S
SacII新英格兰生物实验室R0157S
HindIII-HF新英格兰生物实验室R3104S
EcoRI-HF新英格兰生物实验室R3101S
Cutsmart缓冲液新英格兰生物实验室B7204S
T4 DNA连接酶新英格兰生物实验室M0202S
T4 DNA连接酶反应缓冲液新英格兰生物实验室B0202S
ColiRolle玻璃涂布珠 默克密理博7101-3
甘油费舍尔科技BP229-1
异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）费舍尔科技BP1755-10
NHS-脱硫生物素（DTB）赛默飞世尔科技16129
琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC） 赛默飞世尔科技S1534
二甲基亚砜（DMSO） 费舍尔科技BP231-100
琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯（SPDP） 赛默飞世尔科技S1531
NHS-LC-LC-生物素赛默飞世尔科技21343
辣根过氧化物酶（HRP） 赛默飞世尔科技31490
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍溶液费舍尔科技BP399500
链霉亲和素（SA） 赛默飞世尔科技21145
牛血清白蛋白（BSA）费舍尔科技BP1600-100
二硫苏糖醇（DTT）费舍尔科技BP172-5
乙二胺四乙酸（EDTA） 费舍尔科技S311-500
吐温80 费舍尔科技T164-500
过氧化氢费舍尔科技H325-4
3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）费舍尔科技AC229280050
Vivaspin 500离心浓缩器 Viva ProductsVS0192
无水乙酸钠费舍尔科技BP333-500
96孔聚苯乙烯板赛默飞世尔科技266120

参考文献

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