方法来研究上皮转运蛋白功能和表达在纯肠和Caco-2细胞生长在3D

Summary

我们描述了简单的方法来研究肠血清素转运蛋白（SERT）的功能和表达的使用体外细胞培养的Caco-2细胞在三维生长模型和小鼠肠的离体模型的调节。这些方法适用于其他上皮转运的研究。

Abstract

肠上皮具有重要的运输和屏障功能，在身体的正常生理功能中起关键作用，同时提供一个障碍异物。受损的上皮细胞的转运（离子，营养物，或药物）已经与许多疾病相关联，并且可以具有通过影响上皮完整性和肠道微生物以外的转运，如正常生理功能延伸的后果。了解功能和转运蛋白的调控是改进治疗干预的发展至关重要。在上皮运输研究的最大挑战是开发概括了原生肠上皮细胞的重要特征一个合适的模型系统。几个体外细胞培养模型，如的Caco-2，T-84，和HT-29-Cl.19A细胞在上皮转运研究通常使用。这些细胞系代表了还原的方法来电子建模pithelium并已在许多机理研究，包括其上皮 - 微生物相互作用的检查中使用。然而，细胞单层没有准确地反映细胞-细胞相互作用和体内微环境。在三维生长的细胞都显示出有希望用于药物渗透性的研究模型。我们表明，Caco-2细胞在3D可用于研究上皮转运。同样重要的是，在Caco-2细胞的研究与其它型号的补充，以排除细胞特异性的影响，并考虑到天然肠的复杂性。几种方法先前已被用来评估转运，例如在分离的上皮细胞或分离的质膜囊泡外翻囊和吸收的功能。考虑到相对于模型和转运功能的测量在该领域的挑战，我们在这里展示一个协议到生长在3D Caco-2细胞并描述了使用Ussing室中的作为一个有效的方法来测量血清素转运，如在完整偏振光肠上皮。

Introduction

肠上皮配有各种转运蛋白执行许多功能，从营养物质，电解质的吸收（频道，ATP酶，共转运和交换器），和药物的流体分泌和离子在管腔。转运蛋白产生电化学梯度允许在矢量方式的离子或分子的运动。这是通过在极化上皮细胞的顶和底外侧膜的运输系统的非对称分布来实现的。此外，紧密连接，该系绳相邻上皮细胞，通过作为一个屏障心尖和基底外侧膜结构域之间的组件的膜内扩散在这一过程中起重要作用。模拟天然肠的这些特征合适的模型系统（ 即极性，分化和紧密连接的完整性）都为函数的的研究临界上皮运输系统nality。

对于模型，在肠上皮运输研究目前使用的典型细胞系的Caco-2，完全分化的模式，吸收小肠上皮细胞;和T84细胞或HT-29亚克隆，隐窝衍生大肠上皮细胞¹的模型。传统上，这些细胞系生长在塑料表面的单层或在涂覆的transwell插入物。反孔细胞培养插入到一定程度，允许偏振细胞基底外侧喂类似于体内环境。然而，在传统的二维培养系统中的限制在于将细胞被迫适应的人工，平坦，刚性表面。因此，天然上皮的生理复杂不准确地反映在二维系统。这一限制已经克服的方法在一个特定的微环境生长的细胞在3D，如胶状蛋白质mixtur即，含有多种细胞外基质成分^2,3。尽管如此， 在体外培养物不能模拟的肠上皮细胞，其具有多种细胞类型和在肠道内的特定区域的体系结构的复杂性。因此，使用细胞培养模型的研究需要在本机肠道进一步验证。使用体外三维细胞培养和小鼠肠道黏膜，我们在这里描述的简单方法来研究肠道羟色胺转运（SLC6A4，SERT）的监管。

的SERT转运调节的重要激素和神经递质5-羟色胺（5-HT）的胞外情况，通过经由^的 Na ⁺ /氯迅速运送它^-依赖性过程。 SERT是抗抑郁的已知靶，并在最近成为胃肠道疾病，如腹泻和肠道炎症的一种新的治疗靶标。方法来调查在肠上皮细胞的5-HT摄取之前已经描述了。例如，生长在塑料支撑物或可渗透插入Caco-2细胞已经显示在两个顶端和基底外侧结构域⁴呈现氟西汀敏感^的3 H-5-HT的摄取。 SERT功能的分离的刷状缘膜囊（BBMVs）从人体器官捐献者小肠中制得的测量也得到了我们⁵描述。 ³人BBVMs H-5-HT的摄取显示出是氟西汀敏感和Na ⁺ / Cl ^-的依赖性，并且呈现出饱和动力学具有300 K _m值纳米^5。利用类似的方法，我们也预先测定SERT功能如在小鼠肠BBMVs ^{6 的3} H-5-HT的摄取。然而，纯质膜囊泡的制备需要大量的组织黏膜。其它方法，如radiog的³ H-5-HT的摄取部位raphic可视化，也已预先在豚鼠和大鼠小肠⁷所示。

在尤斯灌流室提供了一个更生理系统来测量离子，营养物，和在各种上皮组织的药物的输送。在尤斯灌流室技术的主要优点是，它使完整的，偏振肠上皮的电气和运输参数的精确测量。另外，为了尽量减少固有神经肌肉系统的影响，可以进行肠粘膜浆肌剥离调查转运的调节中的上皮^8。

我们表明，在三维上生长凝胶状蛋白Caco-2细胞形成中空内腔表达不同心尖和基底外侧标记。这些细胞显示的SERT比2D Caco-2细胞的高表达。方法来种植3D细胞和PErform免疫染色或RNA和蛋白质的提取进行说明。此外，我们描述的方法由TGF-β1，一种多效性细胞因子，利用Ussing室中的技术，研究SERT功能和调节小肠粘膜。

Protocol

1.的Caco-2的三维培养系统肠道转运的研究:成长3D的Caco-2细胞上一种胶状蛋白质混合物

1. 解冻生长因子减少胶状蛋白质混合物在冰上8小时（或O / N）在4℃下。一旦解冻，使1毫升或500微升等分试样在-20℃，供以后使用使用或存储。
2. 在培养当天，预冷在冰上培养板（用于RNA和蛋白质的提取）或室载玻片（用于免疫染色）。添加胶状蛋白质混合物的30μL到八孔腔-载玻片（或每一个6孔板的孔120微升）的每个孔中，并均匀地分布。请注意，不要在此过程中产生的气泡。
3. 放置细胞培养孵化器内的载玻片/板在37℃，15 - 30分钟，并允许胶状蛋白质混合物固化。
4. 而胶状蛋白质的混合物固化，trypsinize Caco-2细胞的汇合烧瓶中。
5. 数数细胞和自旋它们在500 XG在台式离心机5分钟。根据需要重悬在三维的Caco-2培养基的细胞团块。
6. 种子，每孔4,000个细胞的玻璃玻片（中厚板20,000每孔）。使细胞在5％CO ₂的加湿培养箱中在37℃下生长。更改每中等3 - 4天。

2.免疫荧光染色上皮转运体在3D Caco-2细胞:1天

1. 吸出培养基并用400μL的2％多聚甲醛（PFA）（在PBS中以调节到8.5，用NaOH将pH值），用于在室温30分钟固定细胞。
   注:PFA溶液不应在4℃存放1周以上，并且可以使用新鲜制备的溶液。 注意:PFA有剧毒，一个潜在的致癌物质。总是与化学罩谨慎使用个人防护装备处理。
2. 用1×PBS漂洗孔两次，载玻片在4℃下储存于PBS（400微升/好）。一旦固定，在4℃将它们存储长达一周。
3. 预热室幻灯片RT（这会变硬的胶状蛋白质混合物床，可以很容易地吸在洗涤步骤）。
4. 透用PBS中0.5％的Triton细胞为不超过15分钟。
5. 制备的PBS-甘氨酸缓冲液（130毫摩尔NaCl，7毫摩尔_的 Na ₂ HPO _4，3.5毫的NaH ₂ PO _4，和100mM甘氨酸）。冲洗3次用1×PBS甘氨酸在RT每次10分钟。
6. 制备免疫缓冲液（IF）:130毫摩尔NaCl，7毫摩尔_的 Na ₂ HPO _4，3.5毫的NaH ₂ PO _4，100mM的甘氨酸，7.7毫NaN ₃的，0.1％的BSA，0.2％的TritonX-100，和0.05％Tween-20的。
7. 洗3次中的IF缓冲液在RT每次10分钟。在5％阻止正常山羊血清（NGS）的中频缓冲器。用200微升在IF + 1％山羊血清稀释一抗，孵育/孔，1 - 在室温2小时。与中频缓冲器3×洗涤，每次10分钟。
8. 继发抗孵育体（1:200）稀释在IF + 1％NGS，200微升/孔，在RT下1小时。
9. 带有IF缓冲液洗三次，每次10分钟。保持在黑暗中的幻灯片从上这一步。通过将腔室滑动黑色保持器及滑动白色挺杆穿过保持器，直到其边缘的接触孔的边缘抬起从载玻片的塑料腔室。轻轻拉起室（持有者和推杆应该与文化幻灯片）。
10. 慢防褪色中安装并允许它干在室温下10分钟。
11. 一旦完全干燥，密封指甲油和共聚焦显微镜图像他们的幻灯片。储存在4℃下将载玻片两周或在-20℃下几个月。

3.从三维的Caco-2细胞RNA和蛋白提取

1. 治疗上胶状蛋白质混合物培养12细胞 - 14天与测试作用剂，如TGF-β1（10毫微克/毫升，1小时）。
2. 处理后，冲洗细胞1点¯xPBS。保持在冰上的细胞30分钟，以液化胶状蛋白质混合物。
3. 用冷PBS洗井和收集各个离心管中的细胞。使用低速离心，在500 xg离心4℃10分钟收集细胞。使用标准程序提取RNA，并使用实时定量RT-PCR。
4. 该蛋白质的提取，溶解用补充有1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒1×细胞裂解缓冲液的细胞。加入细胞裂解缓冲液，以沉淀后，通过超声处理裂解细胞，并通过离心7500 xg离心4℃10分钟除去细胞碎片。

4，5-HT摄取鼠标回肠利用Ussing室中的测量:肠道准备和浆肌层剥离

1. 继安乐死，解剖小鼠，取出小肠（胃后盲肠之前）。划分小肠分成三部分。丢弃中间的三分之一，使用近三分之一如空肠，并使用远侧三分之一回肠。避免其肠系膜附着拉肠道以防止上皮损伤。通过用冰冷的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KBR）缓冲液覆盖它保持所述组织部分冷。
2. 打开纵向用剪刀肠道。孵育新鲜切除肠切片在冰冷，放气含1μM的吲哚美辛10分钟的浆肌汽提之前KBR。
3. 针肠节（约1厘米长）粘膜面朝下含7％琼脂糖或固化有机硅弹性体（0.5厘米厚）板。
4. 胶条底部照明解剖立体显微镜下的浆肌层层。切用羽毛手术刀片的浆肌层。用细镊子沿着取得肠道的纵轴层的边缘。
   注:在剥离过程中，体视显微镜的底部照明有助于淋巴集结识别和避免地区上课。
5. 所述浆肌剥离完成之后，小心地安装在一个尤斯灌流半腔的销的粘膜。在整个过程中，照顾的边缘以保持剥离粘膜组织，以免撕破。

5.平衡和组织治疗

1. 制备的Kreb氏溶液:115 mM氯化钠，的25mM的NaHCO _3，2.4毫K ₂ HPO _4，1.2毫_氯化钙 ，1.2mM的MgCl ₂的，和0.4毫摩尔KH ₂ PO ₄在pH 7.4，用95％ _的 O _2/5％充气_的 CO ₂在37℃。添加10mM葡萄糖到浆膜浴以用作能量基板和10mM甘露糖醇对粘膜浴以保持渗透平衡。
   注:的Kreb氏溶液补充有L-抗坏血酸（100μM）和帕吉林（100μM，单胺氧化酶抑制剂），以防止细胞内的5-HT的降解。
2. 插入滑块进入腔室以暴露既心尖（管腔）SI德和组织到的Kreb氏溶液的基底外侧（浆膜）侧。
3. 10分钟的平衡期后，预处理氟西汀（10μM），用于在顶面上面向J _毫秒 （粘膜到浆膜磁通）30分钟的回肠组织。
4. 治疗与TGF-β1（10毫微克/毫升）的组织为上基底外侧面1小时，然后用³ [H] -5-HT（20 nm）的孵育它为在顶面上30分钟。

6.粘膜量化到浆膜通量（J _毫秒 ）和³ [H]在组织-5-HT积累

1. 收集从浆膜贮存器（总5毫升）0.75毫升等分试样以测量放射活性在液体闪烁计数器以及计算粘膜到浆膜（J _毫秒 ）通量率;氟西汀敏感磁通表示SERT介导的³ [H] -5-HT摄取。
2. 为了避免在焊剂期跨粘膜静水压力差，采取样品从浆膜侧和再把他们带浴缸中的相同卷。
   注:通量计算校正结束样品（4.25毫升/ 5毫升= 0.85）稀释。
3. 为³ [H] -5-HT中的组织中积累的定量，从滑块卸除粘膜，用冰冷的KRB缓冲液洗一次它，并将其放置在玻璃培养管中。
4. 孵育在0.5毫升10％的KOH的黏膜，在37℃过夜。测量用液体闪烁计数器在裂解物（一式三份）的150微升等分试样的放射性。
5. 用等分 - 裂解液（3 5μL）用Bradford法测定蛋白浓度。
   注:10毫升含放射性血清素孵育培养基中被用作标准。 5-HT的保留在组织中被表达为皮摩尔/毫克蛋白质/分钟。

Results

免疫染色在三维的Caco-2囊肿示于图1。的XY平面内的表示与鬼笔环肽的肌动蛋白染色的三维囊肿以及各别管腔的代表性图像中的图1A中描绘。面向内腔侧表示顶侧。上皮细胞在3D环境中的结果在一个坚固的上皮表型进行培养。在第12天，当肌动蛋白和SERT共染色不同的Caco-2囊肿，示于图1B。在XY平面（从图1A中所示的平面不同）的这种表示，SERT染色是可见的，主要是在管腔膜，用亚根尖染色沿。 图2显示了SERT蛋白水平是较高的三维囊肿相比生长为在^第 12天postplating单层Caco-2细胞。这些数据表明，Caco-2细胞的三维培养可以触发模仿呐信号事件略去上皮细胞和导致增加的SERT表达。 图3A描绘Ussing室中的系统的一般概述和操作，并显示在孔的销安装小肠。这种技术允许在天然肠上皮转运的活性的评估。在尤斯室方法的优点是评估管腔（黏膜）或基底...

Discussion

作为极化上皮单层以研究肠运输^{10，11，12，13，14，15}的完全分化的Caco-2细胞单层已被广泛使用。然而，以模仿肠上皮细胞的生理组织，出现了在3D一个的Caco-2文化的发展相当大的兴趣。若干三维细胞培养模型为肠上皮细胞的近来已经开发出模拟天然细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）配比2D系统¹⁶较大的生理相关性的相互作用。因此，被广泛地用于三维细胞培养物¹的生成含有共同的部件（如层粘连蛋白，胶原蛋白IV和硫酸肝素蛋白聚糖）基于ECM的天然水凝胶6。

这里描述的方案展示了在胶状蛋白质混合物...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC ATCC	注册HTB­37&贸易;	细胞
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope 共聚焦成像
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	显微镜用细胞
5-HT	Gibco	70013-032	非有害物质
95% O2- 5% CO2 钢瓶	KPL	71-00-27	非有害物质
琼脂（用于琼脂平板）	Fischer	BP151-100	急性毒性，Ora
琼脂（用于电极）	Sigma	G7126-1KG	非有害物质
Alexa Fluor 鬼笔环肽	Sigma	C3867-1VL	非有害物质
血清白蛋白 （BSA）	Sigma	P6148-500G	吞咽或吸入有害
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	非有害物质
Caco-2 细胞	Sigma	A8806-5G	非有害物质
细胞裂解缓冲液	Fischer	BP337-100	非有害物质
破损载玻片	Sigma	S5886-1KG	非有害物质
胶原蛋白 1 型溶液	Sigma	S8045-500G
电极	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
胎牛血清 （FBS）	康宁	356234	用作细胞外基质
氟西汀	Qiagen	74104
庆大霉素	ATCC	30-2003	细胞培养基
甘氨酸	细胞信号传导，丹佛斯，马萨诸塞州
Hepes	Roche	11836145001
吲哚美辛	Gibco	15070-063
K2HPO4	Gibco Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco Life Technologies	15630-080
L-抗坏血酸	Life Technologies 的 Gibco	10082147
液体闪烁计数器	Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments，圣地亚哥，CA	EM-CSYS-8
甘露醇	生理仪器，加利福尼亚州圣地亚哥	P2304
Matrigel	生理仪器，加利福尼亚州圣地亚哥	VCC MC8
MgCl2	生理仪器，加利福尼亚州圣地亚哥	DM MC6
多通道电压/电流钳	生理仪器，加利福尼亚州圣地亚哥	P2300
NaCl	生理仪器，加利福尼亚州圣地亚哥	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific，新罕	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	S5886
正常山羊血清（NGS，10%）	Fisher Scientific，新罕布什尔州汉普顿	S233
多聚甲醛 （PFA）	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	C3881
蛋白质检测试剂	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	10420
蛋白酶抑制剂混合物	MEDOX，伊利诺伊州芝加哥	样式 G- 12300
RNA easy 迷你试剂盒	Sigma-Aldrich， St Louis， MO	M4125
单通道电极输入模块	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	A92902
用于卡普韦尔室的滑块	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	H9523
磷酸钠 （Na2HPO4）	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	F132
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	T7039
TGF-β;1	Perkin-Elmer，Waltham， MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments， Downers Grove， IL	B1600
胰蛋白酶 EDTA	Sigma-Aldrich， 圣路易斯， MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories， Hercules， CA	5000006
Ussing Chamber（仅腔室）	Sigma-Aldrich， St Louis， MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich， 圣路易斯， MO	A1296