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方法文章

研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

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DOI：

10.3791/55304

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2017年3月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

我们介绍了一些简单的方法，用于研究肠内5-羟色胺转运体（SERT）功能及其表达的调控，使用一种 体外 Caco-2细胞的三维细胞培养模型 和一个 离体 小鼠肠道模型。这些方法适用于其他上皮转运蛋白的研究。

摘要

肠上皮具有重要的转运和屏障功能，在维持机体正常生理功能的同时，可对外来颗粒提供屏障作用。上皮转运功能（离子、营养物质或药物）受损与多种疾病相关，并可能产生超出转运蛋白正常生理功能的影响，例如影响上皮完整性及肠道微生物组。理解转运蛋白的功能及其调控机制，对于开发更有效的治疗干预手段至关重要。上皮转运研究中最大的挑战在于建立一个能够重现原代肠上皮细胞重要特征的合适模型系统。目前上皮转运研究中通常采用多种体外（in vitro）细胞培养模型，如Caco-2、T-84和HT-29-Cl.19A细胞。这些细胞系代表了对上皮建模的简化方法，已被广泛应用于多种机制研究，包括上皮-微生物相互作用的探讨。然而，单层细胞培养无法准确反映细胞间的相互作用以及体内（in vivo）微环境。三维（3D）培养的细胞已被证明是药物通透性研究中颇具前景的模型。我们展示Caco-2细胞在三维条件下可用于研究上皮转运蛋白。此外，对Caco-2细胞的研究应结合其他模型，以排除细胞特异性效应，并充分考虑原代肠道的复杂性。此前已有多种方法用于评估转运蛋白的功能，例如外翻肠囊法、分离的上皮细胞或分离的质膜小泡中的摄取实验。鉴于当前在模型构建和转运功能检测方面所面临的挑战，本文展示了一种在三维条件下培养Caco-2细胞的实验方案，并描述了使用尤斯灌流室（Ussing chamber）作为有效手段，用于测量完整极化肠上皮中5-羟色胺（serotonin）的转运过程。

引言

肠上皮具有多种转运蛋白（通道蛋白、ATP酶、共转运蛋白和交换蛋白），可执行多种功能，从吸收营养物质、电解质和药物，到向肠腔分泌液体和离子。转运蛋白可产生电化学梯度，从而介导离子或分子的定向移动。这一过程通过转运系统在极化上皮细胞的顶膜和基底外侧膜上的不对称分布而实现。此外，连接相邻上皮细胞的紧密连接在此过程中也发挥重要作用，其作为屏障可阻止组分在顶膜与基底外侧膜区域之间的膜内扩散。为了研究上皮转运系统的功能，建立能够恰当模拟天然肠道特征（即 极性、分化状态以及紧密连接完整性）的模型系统至关重要。

在模型方面，目前肠道上皮转运研究中常用的典型细胞系包括Caco-2，该细胞系作为完全分化的吸收性小肠上皮细胞模型；以及T84细胞或HT-29亚克隆，二者为来源于隐窝的大肠上皮细胞模型1通常，这些细胞系在塑料表面或包被的Transwell小室中以单层形式培养。Transwell细胞培养小室在一定程度上模拟了 体内 环境，使极化细胞能够从基底侧进行营养摄取。然而，传统的二维培养方法存在局限性 培养系统的一个局限在于，细胞被迫适应一种人工的、平坦且刚性的表面，因此二维系统无法准确反映天然上皮组织的生理复杂性。这一局限已通过三维细胞培养技术得到克服 在特定的微环境（如含有多种细胞外基质成分的明胶状蛋白质混合物）中2,3然而， 体外 培养物无法模拟肠道上皮的复杂性，后者在肠道中具有多种细胞类型和区域特异性的结构。因此，利用细胞培养模型开展的研究需要在天然肠道中进一步验证。使用 体外 3D细胞培养与小鼠肠道黏膜，本文介绍了研究肠道5-羟色胺转运体（SLC6A4，SERT）调控的简单方法。

SERT 转运蛋白通过一种依赖 Na+/Cl- 的快速转运过程，调控一种重要激素和神经递质——5-羟色胺（5-HT）——在细胞外的可利用性。SERT 是已知的抗抑郁药物作用靶点，近年来也被认为是腹泻和肠道炎症等胃肠道疾病的一种新型治疗靶点。先前已有方法用于研究肠上皮细胞中 5-HT 的摄取。例如，已有研究表明，在塑料支持物或可渗透插件上培养的 Caco-2 细胞，在顶膜和基底侧膜区域均表现出对氟西汀敏感的 3H-5-HT 摄取4。我们此前也描述了从人类器官捐献者小肠组织制备的分离刷状缘膜囊泡（BBMVs）中检测 SERT 功能的方法5。在人源 BBMVs 中，3H-5-HT 的摄取表现为对氟西汀敏感、依赖 Na+/Cl-，并呈现饱和动力学特征，其 Km 值为 300 nM5。采用类似方法，我们此前还测量了小鼠肠道 BBMVs 中以 3H-5-HT 摄取为指标的 SERT 功能6。然而，纯质膜囊泡的制备需要大量组织黏膜。其他方法，如通过放射自显影技术可视化 3H-5-HT 摄取位点，也已在豚鼠和大鼠小肠中得到应用7。

Ussing室提供了一种更为生理性的系统，用于测量离子、营养物质和药物通过各种上皮组织的转运。Ussing室技术的主要优势在于能够精确测定完整、极化肠上皮的电学和转运参数。此外，为了最大限度减少内在神经肌肉系统的影响，可对肠黏膜进行浆膜肌层剥离，以研究上皮中转运蛋白的调控机制8。

我们证明，在明胶蛋白基质上以三维方式培养的Caco-2细胞可形成具有中空管腔的结构，并表达不同的顶端和基底外侧标志物。这些细胞中SERT的表达水平高于二维培养的Caco-2细胞。本文描述了三维细胞培养、免疫染色以及RNA和蛋白质提取的方法。此外，我们还介绍了利用Ussing室技术研究转化生长因子-β1（TGF-β1，一种多效性细胞因子）在小肠黏膜中对SERT功能与调控作用的方法。

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方案

1. 利用Caco-2细胞的三维培养系统研究肠道转运蛋白：在胶状蛋白质混合物上培养三维Caco-2细胞

  1. 在冰上解冻生长因子减少的明胶状蛋白混合物，持续8小时（或过夜）于4 °C。解冻后，分装成1 mL或500 µL等份，用于实验或储存于-20 °C以备后续使用。
  2. 在培养当天，将培养板（用于RNA和蛋白质提取）或带孔载玻片（用于免疫染色）预先置于冰上冷却。向八孔玻璃腔室载玻片的每个孔中加入30 µL明胶状蛋白混合物（若使用6孔板，则每孔加入120 µL），并均匀铺展。操作过程中注意避免产生气泡。
  3. 将载玻片或培养板放入37 °C细胞培养箱中，静置15–30分钟，使明胶状蛋白混合物凝固。
  4. 在明胶状蛋白混合物凝固的同时，用胰蛋白酶消化一个融合度达到100%的Caco-2细胞培养瓶。
  5. 计数细胞数量，并在台式离心机中以500 × g离心5分钟。根据需要将细胞沉淀重悬于3D Caco-2培养基中。
  6. 以每孔4,000个细胞的密度接种玻璃腔室载玻片（对于培养板，每孔接种20,000个细胞）。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每3–4天更换一次培养基。

2. 三维 Caco-2 细胞中上皮转运蛋白的免疫荧光染色：第 1 天

  1. 吸弃培养基，加入 400 µL 2% 多聚甲醛（PFA）（溶于 PBS 中，用 NaOH 调节 pH 至 8.5），室温固定细胞 30 分钟。
    注意：PFA 溶液在 4 °C 下储存不应超过 1 周，建议使用新鲜配制的溶液。警告：PFA 具有高毒性，且可能为致癌物。务必在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备，谨慎处理。
  2. 用 1× PBS 洗涤孔板两次，将玻片置于含 PBS（400 µL/孔）的容器中，于 4 °C 保存。固定后样品可在 4 °C 下保存最多一周。
  3. 将培养腔室玻片恢复至室温（此步骤可使凝胶状蛋白混合物硬化，便于后续洗涤过程中吸液操作）。
  4. 用含 0.5% Triton 的 PBS 处理细胞，时间不超过 15 分钟。
  5. 配制 PBS-甘氨酸缓冲液（130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3.5 mM NaH2PO4，100 mM 甘氨酸）。于室温下用 1× PBS-甘氨酸缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  6. 配制免疫荧光缓冲液（IF）：130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3.5 mM NaH2PO4，100 mM 甘氨酸，7.7 mM NaN3，0.1% BSA，0.2% Triton X-100，0.05% Tween-20。
  7. 用 IF 缓冲液于室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 IF 缓冲液进行封闭。加入用 IF 缓冲液加 1% 山羊血清稀释的一抗，每孔 200 µL，室温孵育 1–2 小时。再用 IF 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  8. 加入用 IF 缓冲液加 1% NGS 稀释的二抗（1:200），每孔 200 µL，室温孵育 1 小时。
  9. 用 IF 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。从本步骤起，需将玻片避光保存。通过将腔室玻片放入黑色支架中，并将白色剥离片沿支架滑动至其边缘接触孔边缘，从而将塑料腔室从玻璃玻片上轻轻揭下。缓慢提起腔室（支架和剥离片应随培养玻片配套提供）。
  10. 用抗荧光淬灭封片剂封片，室温干燥 10 分钟。
  11. 完全干燥后，用指甲油密封玻片，使用共聚焦显微镜成像。玻片可于 4 °C 保存两周，或于 -20 °C 保存数月。

3. 从三维Caco-2细胞中提取RNA和蛋白质

  1. 将培养在明胶蛋白混合物上的细胞用测试试剂（如 TGF-β1（10 ng/mL，1 h））处理 12–14 天 。
  2. 处理后，用 1× PBS 洗涤细胞，并将细胞置于冰上 30 分钟，以使明胶蛋白混合物液化。
  3. 用预冷的 PBS 洗涤孔板，将细胞分别收集至离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 低速离心 10 分钟收集细胞。按照标准操作提取 RNA，并进行实时 RT-PCR 分析。
  4. 进行蛋白提取时，使用含有 1× 蛋白酶抑制剂混合物的 1× 细胞裂解缓冲液裂解细胞。向细胞沉淀中加入裂解缓冲液后，通过超声处理裂解细胞，并在 4 °C 条件下以 7,500 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。

4. 利用尤斯室测量小鼠回肠5-HT摄取：肠道制备与浆肌层剥离

  1. 处死动物后，解剖小鼠并取出小肠（胃之后、盲肠之前）。将小肠分为三段，弃去中段，近端三分之一作为空肠使用，远端三分之一作为回肠使用。避免从肠系膜附着处牵拉肠道，以防损伤上皮。用预冷的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐（KBR）缓冲液覆盖组织，保持低温。
  2. 用剪刀纵向剪开肠道。在进行浆肌层剥离前，将新鲜切除的肠段置于含 1 µM 吲哚美辛的冰浴、持续通气的 KBR 缓冲液中孵育 10 分钟。
  3. 将肠段（长约 1 cm）黏膜面向下固定在含有 7% 琼脂糖或固化硅橡胶（厚度 0.5 cm）的培养板上。
  4. 在配有底部照明的解剖体视显微镜下剥离浆肌层。使用羽毛刀片切割浆肌层，用精细镊子沿肠段长轴方向夹住该层边缘进行剥离。
    注意：在剥离过程中，体视显微镜的底部照明有助于识别并避开派尔集合淋巴结区域。
  5. 完成浆肌层剥离后，小心将黏膜组织固定于 Ussing 半室腔的固定针上。在整个操作过程中，应仅夹持剥离后黏膜组织的边缘，避免撕裂。

5. 平衡与组织处理

  1. 配制 Krebs 溶液：115 mM NaCl、25 mM NaHCO3、2.4 mM K2HPO4、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2 和 0.4 mM KH2PO4，pH 7.4，用 95% O2/5% CO2 混合气体饱和，37 °C 恒温。在浆膜侧浴液中加入 10 mM 葡萄糖作为能量底物，在黏膜侧浴液中加入 10 mM 甘露醇以维持渗透平衡。
    注意：Krebs 溶液中需添加 L-抗坏血酸（100 µM）和反苯环丙胺（100 µM，单胺氧化酶抑制剂），以防止细胞内 5-HT 降解。
  2. 将滑片插入腔室，使组织的顶端（管腔）侧和基底外侧（浆膜）侧均暴露于 Krebs 溶液中。
  3. 经过 10 分钟的平衡期后，在顶端侧加入氟西汀（10 µM）预处理回肠组织 30 分钟，用于测定 Jm-s（黏膜至浆膜方向的转运通量）。
  4. 在基底外侧加入 TGF-β1（10 ng/mL）处理 1 小时，随后在顶端侧加入 3[H]-5-HT（20 nM）孵育 30 分钟。

6. 黏膜至浆膜转运量（Jm-s）及组织中3[H]-5-HT蓄积的定量分析

  1. 从浆膜侧储液池中收集0.75 mL等份样品（总量5 mL），用液体闪烁计数器测定放射性，以计算黏膜至浆膜（Jm-s）的转运速率；氟西汀敏感性转运代表SERT介导的3[H]-5-HT摄取。
  2. 为避免在转运期间黏膜两侧产生静水压差，应从浆膜侧取样，并以相同体积的灌流液补充替换。
    注意：转运速率计算时需校正终末样品的稀释因素（4.25 mL / 5 mL = 0.85）。
  3. 为定量组织中积累的3[H]-5-HT，将黏膜从滑片上取下，用冰冻KRB缓冲液冲洗一次，然后置于玻璃培养管中。
  4. 将黏膜在0.5 mL含10% KOH的溶液中37 °C过夜孵育。取150 µL裂解液等份样品（每样本设三个复孔），用液体闪烁计数器测定放射性。
  5. 取裂解液等份样品（3–5 µL）采用Bradford法测定蛋白浓度。
    注意：含放射性5-羟色胺的10 mL孵育液作为标准品。组织中保留的5-HT以pmol/mg蛋白/分钟表示。

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结果

三维Caco-2囊状结构中的免疫染色如图所示 图1一张显示用鬼笔环肽-肌动蛋白染色的三维囊肿中界限清晰管腔的XY平面代表性图像如图所示 图1A腔面朝向的一侧为顶膜侧。在三维环境中培养的上皮细胞可形成稳定的上皮表型。第12天共染肌动蛋白与SERT的不同Caco-2囊状结构如图所示。 图1B. 在此XY平面的示意图中（不同于图中所示的平面） 图1A），可见SERT染色主要位于管腔膜，并伴有顶下区域的染色。 图2 表明，与在12孔板上以单层培养的Caco-2细胞相比，3D囊肿中的SERT蛋白水平更高th 接种后第几天。这些数据表明，Caco-2 细胞的三维培养可能触发模拟天然上皮组织的信号事件，从而导致 SERT 表达增加。 图3A 展示了Ussing腔室系统的总体概览和操作过程，并显示小肠组织固定在孔隙插针上的状态。该技术可用于评估天然肠道中上皮转运蛋白...

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讨论

完全分化的Caco-2细胞单层已被广泛用作极化上皮单层模型，以研究肠道转运过程10,11,12,13,14,15。然而，为了更好地模拟肠道上皮细胞的生理结构，近年来对建立三维（3D）培养条件下的Caco-2细胞模型产生了浓厚兴趣。目前已开发出多种用于肠道上皮细胞的三维细胞培养模型，这些模型相较于二维（2D）系统，能更真实地模拟细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，具有更高的生理相关性16。因此，含有常见组分（如层粘连蛋白、IV型胶原和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的基于ECM的天然水凝胶被广泛用于构建三维细胞培养体系16。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 RKG 实验室的医学博士/博士生 Christopher Manzella 先生，他协助我们编辑和校对了手稿。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBSATCCATCC® HTB­37™细胞
10x PBSCarl Zeiss共聚焦成像显微镜
3[H]-5-HT LabtekII152453用于显微镜观察的细胞培养
5-HT Gibco70013-032非危险物质
95% O2- 5% CO2 气瓶KPL71-00-27非危险物质
琼脂（用于琼脂平板）FischerBP151-100急性毒性，经口
琼脂（用于电极）SigmaG7126-1KG非危险物质
Alexa Fluor 鬼笔环肽SigmaC3867-1VL非危险物质
牛血清白蛋白（BSA）SigmaP6148-500G吞咽或吸入有害
CaCl2LifeTechnologiesA12380非危险物质
Caco-2 细胞SigmaA8806-5G非危险物质
细胞裂解缓冲液FischerBP337-100非危险物质
载玻片（Chabered slides）SigmaS5886-1KG非危险物质
Ⅰ型胶原溶液SigmaS8045-500G
电极SigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
胎牛血清（FBS）Corning356234用作细胞外基质
氟西汀Qiagen74104
庆大霉素ATCC30-2003细胞培养基
甘氨酸Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
吲哚美辛Gibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-抗坏血酸 Gibco by Life Technologies10082147
液体闪烁计数器 Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
甘露醇Physiologic Instruments, San Diego, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
多通道电压/电流钳Physiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
正常山羊血清（NGS, 10%）Fisher Scientific, Hampton, NHS233
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
青霉素-链霉素（Pen-Strp）Sigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
蛋白检测试剂Sigma-Aldrich, St Louis, MO10420
蛋白酶抑制剂混合物MEDOX, Chicago, IL style G- 12300
RNA easy Mini 试剂盒Sigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
单通道电极输入模块 Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Snapwell 小室用载玻片Sigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
磷酸钠（Na2HPO4）Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
胰蛋白酶 EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
吐温-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
尤斯室（仅室体）Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
尤斯室系统Sigma-Aldrich, St Louis, MOA1296

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

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三维培养尤斯室5-羟色胺转运肠上皮SERT蛋白蛋白质印迹免疫荧光细胞培养
研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法
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