我们介绍了一些简单的方法，用于研究肠内5-羟色胺转运体（SERT）功能及其表达的调控，使用一种 体外 Caco-2细胞的三维细胞培养模型 和一个 离体 小鼠肠道模型。这些方法适用于其他上皮转运蛋白的研究。
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方法文章
研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
肠上皮具有重要的转运和屏障功能，在维持机体正常生理功能的同时，可对外来颗粒提供屏障作用。上皮转运功能（离子、营养物质或药物）受损与多种疾病相关，并可能产生超出转运蛋白正常生理功能的影响，例如影响上皮完整性及肠道微生物组。理解转运蛋白的功能及其调控机制，对于开发更有效的治疗干预手段至关重要。上皮转运研究中最大的挑战在于建立一个能够重现原代肠上皮细胞重要特征的合适模型系统。目前上皮转运研究中通常采用多种体外（in vitro）细胞培养模型，如Caco-2、T-84和HT-29-Cl.19A细胞。这些细胞系代表了对上皮建模的简化方法，已被广泛应用于多种机制研究，包括上皮-微生物相互作用的探讨。然而，单层细胞培养无法准确反映细胞间的相互作用以及体内（in vivo）微环境。三维（3D）培养的细胞已被证明是药物通透性研究中颇具前景的模型。我们展示Caco-2细胞在三维条件下可用于研究上皮转运蛋白。此外，对Caco-2细胞的研究应结合其他模型，以排除细胞特异性效应，并充分考虑原代肠道的复杂性。此前已有多种方法用于评估转运蛋白的功能，例如外翻肠囊法、分离的上皮细胞或分离的质膜小泡中的摄取实验。鉴于当前在模型构建和转运功能检测方面所面临的挑战，本文展示了一种在三维条件下培养Caco-2细胞的实验方案，并描述了使用尤斯灌流室（Ussing chamber）作为有效手段，用于测量完整极化肠上皮中5-羟色胺（serotonin）的转运过程。
引言
肠上皮具有多种转运蛋白（通道蛋白、ATP酶、共转运蛋白和交换蛋白），可执行多种功能，从吸收营养物质、电解质和药物，到向肠腔分泌液体和离子。转运蛋白可产生电化学梯度，从而介导离子或分子的定向移动。这一过程通过转运系统在极化上皮细胞的顶膜和基底外侧膜上的不对称分布而实现。此外，连接相邻上皮细胞的紧密连接在此过程中也发挥重要作用，其作为屏障可阻止组分在顶膜与基底外侧膜区域之间的膜内扩散。为了研究上皮转运系统的功能，建立能够恰当模拟天然肠道特征（即 极性、分化状态以及紧密连接完整性）的模型系统至关重要。
在模型方面，目前肠道上皮转运研究中常用的典型细胞系包括Caco-2，该细胞系作为完全分化的吸收性小肠上皮细胞模型；以及T84细胞或HT-29亚克隆，二者为来源于隐窝的大肠上皮细胞模型1通常，这些细胞系在塑料表面或包被的Transwell小室中以单层形式培养。Transwell细胞培养小室在一定程度上模拟了 体内 环境，使极化细胞能够从基底侧进行营养摄取。然而，传统的二维培养方法存在局限性 培养系统的一个局限在于，细胞被迫适应一种人工的、平坦且刚性的表面，因此二维系统无法准确反映天然上皮组织的生理复杂性。这一局限已通过三维细胞培养技术得到克服 在特定的微环境（如含有多种细胞外基质成分的明胶状蛋白质混合物）中2,
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方案
1. 利用Caco-2细胞的三维培养系统研究肠道转运蛋白：在胶状蛋白质混合物上培养三维Caco-2细胞
- 在冰上解冻生长因子减少的明胶状蛋白混合物，持续8小时（或过夜）于4 °C。解冻后，分装成1 mL或500 µL等份，用于实验或储存于-20 °C以备后续使用。
- 在培养当天，将培养板（用于RNA和蛋白质提取）或带孔载玻片（用于免疫染色）预先置于冰上冷却。向八孔玻璃腔室载玻片的每个孔中加入30 µL明胶状蛋白混合物（若使用6孔板，则每孔加入120 µL），并均匀铺展。操作过程中注意避免产生气泡。
- 将载玻片或培养板放入37 °C细胞培养箱中，静置15–30分钟，使明胶状蛋白混合物凝固。
- 在明胶状蛋白混合物凝固的同时，用胰蛋白酶消化一个融合度达到100%的Caco-2细胞培养瓶。
- 计数细胞数量，并在台式离心机中以500 × g离心5分钟。根据需要将细胞沉淀重悬于3D Caco-2培养基中。
- 以每孔4,000个细胞的密度接种玻璃腔室载玻片（对于培养板，每孔接种20,000个细胞）。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每3–4天更换一次培养基。
2. 三维 Caco-2 细胞中上皮转运蛋白的免疫荧光染色：第 1 天
- 吸弃培养基，加入 400 µL 2% 多聚甲醛（PFA）（溶于 PBS....
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结果
三维Caco-2囊状结构中的免疫染色如图所示 图1一张代表性XY平面图像，显示了用鬼笔环肽-肌动蛋白染色的3D囊肿中边界清晰的管腔结构 图1A面向管腔的一侧为顶侧。在三维环境中培养的上皮细胞可形成稳定的上皮表型。第12天时，经肌动蛋白与SERT共染色的不同Caco-2囊状结构如图所示。 图1B. 在此XY平面的示意图中（不同于图中所示的平面） 图1A），可见SERT染色主要位于管腔膜，并伴有顶下区域的染色。 图2 表明，与在12孔板上以单层形式培养的Caco-2细胞相比，3D类囊泡中SERT蛋白水平更高th 接种后第3天。这些数据表明，Caco-2细胞的三维培养可能触发模拟天然上皮组织的信号事件，从而导致SERT表达增加。 图3A 展示了Ussing腔室系统的总体概览和操作，以及固定在孔径插针上的小肠组织。该技术可用于评估天然肠组织中上皮转运蛋白的活.......
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讨论
完全分化的Caco-2细胞单层已被广泛用作极化上皮单层模型，以研究肠道转运过程10,11,12,13,14,15。然而，为了更好地模拟肠道上皮细胞的生理结构，近年来对建立三维（3D）培养条件下的Caco-2细胞模型产生了浓厚兴趣。目前已开发出多种用于肠道上皮细胞的三维细胞培养模型，这些模型相较于二维（2D）系统，能更真实地模拟细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，具有更高的生理相关性16。因此，含有常见组分（如层粘连蛋白、IV型胶原和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的基于ECM的天然水凝胶被广泛用于构建三维细胞培养体系16。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 RKG 实验室的医学博士/博士生 Christopher Manzella 先生，他协助我们编辑和校对了手稿。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | 细胞 |
| 10x PBS | Carl Zeiss | 共聚焦成像显微镜 | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | 用于显微镜观察的细胞培养 |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | 非危险物质 |
| 95% O2- 5% CO2 气瓶 | KPL | 71-00-27 | 非危险物质 |
| 琼脂（用于琼脂平板） | Fischer | BP151-100 | 急性毒性，经口 |
| 琼脂（用于电极） | Sigma | G7126-1KG | 非危险物质 |
| Alexa Fluor 鬼笔环肽 | Sigma | C3867-1VL | 非危险物质 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | P6148-500G | 吞咽或吸入有害 |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | 非危险物质 |
| Caco-2 细胞 | Sigma | A8806-5G | 非危险物质 |
| 细胞裂解缓冲液 | Fischer | BP337-100 | 非危险物质 |
| 载玻片（Chabered slides） | Sigma | S5886-1KG | 非危险物质 |
| Ⅰ型胶原溶液 | Sigma | S8045-500G | |
| 电极 | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | 356234 | 用作细胞外基质 |
| 氟西汀 | Qiagen | 74104 | |
| 庆大霉素 | ATCC | 30-2003 | 细胞培养基 |
| 甘氨酸 | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| 吲哚美辛 | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-抗坏血酸 | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| 液体闪烁计数器 | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| 甘露醇 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| 多通道电压/电流钳 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| 正常山羊血清（NGS, 10%） | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| 青霉素-链霉素（Pen-Strp） | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| 蛋白检测试剂 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini 试剂盒 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| 单通道电极输入模块 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Snapwell 小室用载玻片 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| 磷酸钠（Na2HPO4） | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| 吐温-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| 尤斯室（仅室体） | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| 尤斯室系统 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
参考文献
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.
One of the authors' names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan
