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一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

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DOI：

10.3791/55310

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2017年7月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy and Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin - Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin - Madison, 3Department of Soil, Water, and Climate, University of Minnesota, 4Faculty of Science and Engineering, Curtin University

本文内容

摘要

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。

摘要

微生物群落是生态系统过程的重要驱动者和调节者。为了理解生态系统管理如何影响微生物群落，通常采用一种相对精确但操作较为繁琐的方法——磷脂脂肪酸（PLFA）分析，来检测微生物群落组成。PLFA 方法用于分析磷脂生物标志物，这些标志物可作为微生物生物量以及真菌和细菌等主要功能类群组成状况的指示指标。该方法常被用于比较不同植物群落、生态条件及管理措施下的土壤微生物状况。研究表明，PLFA 方法能够灵敏地检测出微生物群落组成的变化。

另一种方法是脂肪酸甲酯提取与分析法（MIDI-FA），该方法用于从纯培养物中快速提取总脂质，无需分离磷脂组分，可作为微生物鉴定技术。该方法虽然快速，但不太适用于土壤样品，因为它缺少初始的土壤颗粒分离步骤，而是直接从皂化反应开始，这可能导致土壤中背景有机质产生干扰物质。

本文介绍了一种在提高通量的同时平衡工作量与准确性的方法，用于从微生物细胞膜中提取脂质，以表征总脂质及指示性脂质的相对丰度，从而在包含大量样本的研究中确定土壤微生物群落结构。该方法结合了磷脂脂肪酸（PLFA）分析的准确性，首先提取并浓缩土壤脂质；随后通过皂化所提取的有机物质，并采用MIDI-FA方法进行处理，从而减少操作步骤和工作量。

引言

鉴于微生物在养分循环1、植物群落组成改变2、植物生产力调控3以及有机物分解4中所起的关键作用，了解土壤微生物群落对于理解陆地生态系统至关重要。

由于脂质生物标志物在土壤中相对含量较高，且具有特定的化学特征，因此可用于分析构成土壤微生物群落的主要生态类群5。通过定量不同微生物类群特有的脂质生物标志物，可以估算总脂质含量，并将这些脂质进一步划分为具有生态学意义的类群，如革兰氏阳性（Gm+）和革兰氏阴性（Gm-）细菌、丛枝菌根（AM）真菌和腐生真菌，以及放线菌5,6,7,8。

表征微生物群落特征的方法有多种。磷脂脂肪酸（PLFA）法是常用于了解微生物群落基本结构的一种方法。该方法可有效评估不同微生物类群的相对丰度以及总微生物生物量。由于脂质代谢迅速，PLFA分析还能相对较快地检测土壤微生物群落的变化，并提供可用于比较生态系统功能的信息，例如通过真菌与细菌的比例来评估养分循环速率1,9,10。然而，尽管PLFA提取方法历史悠久且广受认可，但其操作过程耗时较长，难以适用于需要大量田间重复样品的生态系统尺度研究11,12。

相比之下，脂肪酸甲酯提取法（MIDI-FA）具有实现高通量分析的潜力。该方法中，样品经过皂化、转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）、提取，然后进行分析。MIDI-FA 方法快速，但分辨能力低于磷脂脂肪酸分析法（PLFA），后者结合了脂质提取与不同脂质类别（磷脂、中性脂质和糖脂）的分离13。

在本实验方案中，我们描述了一种结合了PLFA和MIDI-FA脂质分析方法特点的技术。该方法采用改良的Bligh和Dyer法中的初始氯仿提取步骤进行脂质提取，随后进行皂化并转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）。这种方法能够有效检测微生物群落结构，同时排除大量非微生物来源的背景干扰5,14。本方法的开发旨在平衡PLFA与MIDI-FA两种方案的优势，即在保留大部分准确性的同时提高通量，从而使大规模、多样本研究中的脂质分析在操作和经济上更具可行性15。通过在执行MIDI-FA前先进行初始提取，分离出有机溶剂可溶性组分（e.g. 脂质），并结合纯化步骤，该方案在分析速度与精确性之间实现了良好平衡。

方案

注意：在整个操作过程中，务必始终佩戴适当的个人防护装备（PPE）。为避免样品可能受到污染，请勿用手直接接触玻璃器皿。在执行需要接触氯仿的实验步骤时，应佩戴适当的手套。

1. 准备工作（约40个样本需2天）

  1. 将土壤采集到无菌袋中，并用含冰的冷藏箱从野外运回。若无法立即过筛并进行冷冻干燥，应将样品储存于 -80 °C 超低温冰箱中，直至开始分析。
  2. 通过均质化处理土壤。去除根系和石块，并通过粗筛（例如 2 mm）打碎土块。
  3. 按照冻干机说明书的要求，将子样品放入合适的容器中，尽快进行冷冻干燥。土壤冻干后，应储存在密封容器中并加入干燥剂，直至提取前。最好将冻干土壤至少储存在 -20 °C，更佳条件为 -80 °C。
  4. 为提取做准备时，从储存中取出冻干土壤，研磨至类似面粉的细度。研磨方法包括球磨机、振荡磨和研钵研杵。研磨后，将土壤存入冰箱（见步骤 1.3）。
    注意：用于提取的样品量取决于其有机质含量。一般建议，对于含碳量为 12% 至 18%（质量分数）的土壤，使用 0.5 至 1 g；对于含碳量为 1% 至 3%（质量分数）的土壤，使用 3 至 5 g。
  5. 用正己烷预冲洗 30 mL 离心管。向管中加入约 2 至 3 mL 正己烷，涡旋振荡 5 秒。将正己烷倾入另一管中再次涡旋。2 至 3 mL 正己烷可依次冲洗六支离心管。将冲洗后的离心管倒置存放于通风橱中，使用过的正己烷应倒入适当的废液容器中处理。
  6. 用 2 至 3 层铝箔包裹玻璃器皿，并放入马弗炉中。在 450 °C 下灼烧（马弗）4.5 小时。
  7. 配制试剂。
    1. 根据所用土壤量，按磷酸盐缓冲液（P 缓冲液）: CHCl3 : MeOH 体积比 0.8:1:2 的比例加入化学试剂。
    2. 配制 P 缓冲液：磷酸盐缓冲液，0.1 M，pH 7.0。
      1. 加入 61 mL 1 M K2HPO4 储备液（无菌，试剂应为 ACS 认证级或更高纯度），再加入 39 mL 1 M KH2PO4 储备液（无菌，试剂应为 ACS 认证级或更高纯度）。用 1 级水定容至 1000 mL 。用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.0。未使用的溶液可在室温下保存最多 7 天，或在冰箱中保存 30 天。
      2. 或者，称取 10.62 g K2HPO4 和 5.31 g KH2PO4，用 1 级水稀释至 1 L。检测 pH，必要时进行调节。
    3. 配制试剂 1：皂化试剂。
      1. 量取 300 mL 1 级水。加入 300 mL CH3OH（HPLC 级或更高纯度）。加入 90.00 g NaOH（ACS 认证级或更高纯度）。在搅拌下将 NaOH 颗粒加入溶液中，持续搅拌至完全溶解。建议该溶液储存时间不超过 30 天。
    4. 配制试剂 2：甲基化试剂。
      1. 量取 275 mL CH3OH（HPLC 级或更高纯度）。在搅拌下加入 325 mL 6.00 N HCl（经认证）。建议该溶液储存时间不超过 30 天。
    5. 配制试剂 3：提取试剂：50% C6H14（正己烷），50% C5H12O（MTBE）。
      1. 在通风橱中，将 200 mL C6H14（HPLC 级或更高纯度）与 200 mL C5H12O（HPLC 级或更高纯度）混合。充分混匀后密封。储存于易燃品柜或通风橱中，储存时间不超过 1 年。
    6. 配制试剂 4：碱洗试剂。
      1. 量取 900 mL 1 级水至烧杯中。在搅拌下加入 10.80 g NaOH（ACS 认证级或更高纯度）。搅拌至颗粒完全溶解。建议该溶液储存时间不超过 30 天。
    7. 配制内标储备液。
      1. 称取 100 mg 19:0 EE 标准品，加入经正己烷冲洗过的 50 mL 容量瓶中。加入约 15 mL 正己烷-MTBE 溶液（试剂 3），轻轻旋转使其溶解。用正己烷-MTBE 溶液（试剂 3）定容至 50 mL。盖紧瓶盖并旋转混匀。转移至经正己烷冲洗、带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的玻璃管中，于 -20 °C 保存。

第2天 - 从土壤中提取脂肪酸（约40个样品需4至5小时）

  1. 准备三个 5 到 10 mL 的分配移液管，分别用于 P 缓冲液、氯仿和甲醇。
    注意：已有研究提出氯仿的较低危害性替代萃取剂。这些替代物可能获得相当的脂质回收率16,17，但本方案未对其进行评估。
  2. 将冻干土壤称重后放入 30 mL 离心管中，并记录土壤质量。
  3. 制备两个空白样，并加入一个检核查标准样（即先前已提取过的土壤）。
  4. 在通风橱中，按以下顺序向离心管中的土壤加入试剂： P 缓冲液、CHCl3 和 MeOH（见表 1）。在加入 P 缓冲液后，需等待土壤充分润湿，再加入 CHCl3。盖紧离心管盖，并用遮光材料包裹以避光。
  5. 将离心管水平放置于摇床上，确保固定牢固。设置摇床转速为 280 rpm，振荡 1 小时18。
  6. 为每个样品准备两支 16 mm × 150 mm 玻璃试管，操作如下：标记试管，并向其中各加入等体积的 CHCl3 和等量的 P 缓冲液。
  7. 将离心管从摇床上取出，于 1,430 × g 和 25 °C 条件下离心 10 分钟。玻璃试管中应可见明显的相分离。
  8. 在通风橱中，将离心管中的上清液倾入步骤 2.6 中准备好的其中一支试管中。重复步骤 2.4 至 2.5，将第二次提取的上清液倾入第二支试管中。
  9. 使用带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的盖子严密封闭所有 16 mm × 150 mm 玻璃试管，倒置 10 次以充分混匀。
  10. 让样品静置过夜，以完成两相的完全分离。为此，应将样品置于避光的柜子或用铝箔包裹，于室温下存放。允许提取物在周末期间进行相分离。
    1. 或者，若希望直接进入下一步，或次日样品受到扰动，可将样品于 1,000 × g 和 25 °C 条件下离心 10 分钟。
      注意：同一比较组内的所有样品应采用相同的相分离静置时间。

第3步 第2天 - 脂质的提取（约40个样本需3至4小时）

  1. 开启蒸发装置和溶剂捕集器。将蒸发装置温度设为 33 °C 并预热。
  2. 在通风橱内安装真空抽滤装置：将侧臂烧瓶连接至真空泵，再通过一段高纯度管路连接玻璃移液管。
  3. 用真空抽滤法吸除两支玻璃管中的上层及界面部分（约向下抽取三分之二），保留水相层。每个样品使用新的洁净移液管重复此操作 。
  4. 小心倾倒，将第二支管中的水相提取物合并至第一支管中。确保用于倾倒的试管表面无划痕或裂纹。
  5. 当氯仿（CHCl3）提取液合并后，检查液体状态——应呈澄清透明。若浑浊，加入甲醇（MeOH）直至溶液变清。
  6. 使用真空蒸发装置将所有样品干燥。初始设置为温度 33 °C、涡旋速度 26%、压力 400 mbar。
  7. 将样品放入蒸发系统，10 分钟后缓慢将压力降至 350 mbar。
  8. 持续监测蒸发进程，当管内液面降至加热块高度时，将压力进一步降至 300 mbar。
  9. 继续监测剩余液体高度，当液深约为 1 cm 时，将压力降至 200 mbar。
  10. 样品完全干燥后，取出样品，并继续运行真空泵 10 分钟以清除残留蒸气。
  11. tightly 封闭试管，将脂质样品于 -80 °C 超低温冰箱中保存。
  12. 根据相关化学品安全法规，妥善处理已抽吸的废液。

4. 第3天——皂化与甲基化（约40个样品需6至7小时）

  1. 打开水浴锅，将水浴锅1设定为95 °C，水浴锅2设定为80 °C。
  2. 设置移液器分配装置，并确保其分配的体积准确。
    试剂1：每份样品1 mL
    试剂2：每份样品2 mL
    试剂3：每份样品1.25 mL
    试剂4：每份样品3 mL
    注意：加热过程会在试管内产生压力。请勿使用有划痕、裂纹或缺口的试管。
  3. 使用移液分配器向干燥的脂质中加入1.0 mL试剂1。盖紧管盖，涡旋振荡5秒，然后置于试管架中。
  4. 将装有样品管的试管架放入95 °C水浴中加热5分钟。从水浴中取出试管架，检查各管是否有泄漏，泄漏表现为管内有气泡上升。对泄漏的管子重新拧紧或更换管盖，并再次检查是否存在裂纹或破损。继续将试管置于水浴中加热额外10分钟。
  5. 将样品从浴槽1中取出，放入浴槽2（80 °C）中，继续孵育15分钟。
  6. 取出离心管，将装有离心管的架子放入盛有自来水的容器中冷却样品。
  7. 向每个样品中加入2 mL试剂2。盖紧盖子，涡旋5至10秒。
  8. 将架子放入80 °C水浴中，孵育10分钟。
  9. 从水浴中取出试管架，放入盛有自来水的容器中冷却。振荡试管架以加快冷却过程。
    注意：切勿超过规定的时间和温度。过度加热可能导致脂肪酸甲酯（FAMEs）降解。
  10. 使用移液分配器向每个样品管中加入1.25 mL试剂3，以提取脂肪酸甲酯。盖紧管盖，将试管置于摇床中振荡10分钟。
  11. 振荡后，将试管架静置10分钟，使各相分层。使用玻璃移液管将有机相（上层）转移至一支16 mm × 100 mm的玻璃试管中。
  12. 再次加入试剂3，振荡，静置分层后，转移上层相，重复提取。
    注意：不要转移任何下层相。在管中残留少量上层相是允许的。
  13. 使用移液分配器，向16 mm × 100 mm试管中加入3 mL试剂4。
  14. 盖紧试管，涡旋振荡20-30秒。
  15. 涡旋后，在1,000 × g条件下离心3分钟。
  16. 使用洁净的玻璃移液管吸取上层有机相，并转移至4 mL棕色样品瓶中。
  17. 打开蒸发装置和溶剂捕集器。将蒸发装置温度设为 30 °C，涡旋速度设为 26%，真空度设为 200 mbar，然后按下预热。
  18. 监测实验进程。样品干燥后，取出样品，并继续运行泵 10 分钟，以清除蒸气。
  19. 从试剂瓶1和4中取出移液管，并用稀酸冲洗例如 1% HCl），然后用去离子水冲洗。用去离子水抽吸冲洗用于试剂2的移液管。在通风橱内，将用于试剂3的移液管中的溶剂排入适当的容器中，并将移液管留在通风橱内，直至溶剂残留物完全挥发。
  20. 将移液器倒置存放，并取下活塞，以防止止回阀粘连。
  21. 使用玻璃移液管一次后，应将其丢弃至适当的容器中。
  22. 在通风橱中，使玻璃器皿上的溶剂残留挥发干净。
  23. 用清水和洗涤剂溶液冲洗玻璃器皿。

5. 第4天——工作溶液的配制及FAMEs转移至GC小瓶（约40个样品需2-3小时）

  1. 收集材料：4 mL 棕色小瓶（含干燥样品）；2 mL 棕色气相色谱小瓶 400 µL 平底玻璃插件及瓶盖；500 µL 玻璃注射器；50 mL 容量瓶；储备液——十九酸乙酯（19:0 EE 内标）溶于 50/50 己烷/甲基叔丁基醚（试剂 3）
  2. 使用玻璃注射器，将500 µL十九酸乙酯（19:0 EE）储备液加入50 mL容量瓶中。
  3. 用试剂3加至容量刻度线。
  4. 盖紧瓶盖，倒置混匀5次。
  5. 将3 mL转移至洁净的4 mL小瓶中，作为工作溶液储备。
  6. 使用玻璃注射器，向每个含有干燥脂肪酸甲酯的4 mL小瓶中加入300 µL工作液，并盖紧瓶盖。
  7. 涡旋混匀样品15秒，静置15分钟。
  8. 使用玻璃巴斯德吸管，小心地将悬浮的脂肪酸甲酯转移至含有400 µL内插管的2 mL GC小瓶中。
  9. 将密封的气相色谱小瓶在分析前存放于 -20 °C 冰箱中。
  10. 提交样品进行气相色谱分析。
    注意：分析必须使用补充文件中所述的特定气相色谱柱和条件进行。 S1甲基化后最好在两周内完成气相色谱分析。

结果

报告中的数据表可汇总至电子表格或数据库中。在对响应因子（用于校正不同碳链长度响应值的校正因子）进行校正后，可通过将峰面积与外标或内标的峰面积进行比较，计算出提取物中的浓度。通过除以所提取土壤的质量，数据可表示为每克土壤中脂肪酸甲酯（FAME）的质量，或通过使用每种FAME的分子量，更常以每克土壤中含有的FAME的纳摩尔数（nmol/g）表示。微生物FAME的总量可反映总微生物生物量，并可用于不同处理间的比较（图1）。某些FAME还可与特定微生物类群相关联，例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌、放线菌、丛枝菌根真菌以及腐生性真菌19,20,21,22,23,24。特定生物标志物质量的比值可反映这些类群的相对丰度（图2）。总体FAME丰度模式可形成群落水平的“指纹”特征，从而可通过排序等多元统计方法对微生物群落间的差异性进行比较（图3）。与大多数基于DNA的方法不同，群落水平的脂质数据既可按相对丰度也可按绝对丰度进行分析。若样品间总生物量存在显著差异，这两种分析方法将产生截然不同的结果；应根据实验所针对的生态学问题来决定采用哪种方法。

figure-results-1
图1：总FAME生物量。连续玉米、施肥草原和未施肥草原的总FAME生物标志物生物量（nmol g-1 土壤）比较。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：细菌和真菌的FAME生物量。连续玉米、施肥草原和未施肥草原处理下细菌与真菌FAME生物标志物生物量（nmol g-1 土壤）的比较。真菌与细菌生物量基于绝对丰度计算（真菌总和/细菌总和的平均值）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：FAME 脂质生物标志物的非度量多维尺度分析。基于所有微生物FAME脂质生物标志物的绝对丰度谱，对整体微生物群落进行比较。在本例中，连续种植玉米和未施肥草原的微生物群落相互分离且相距较远，而部分施肥草原样品的微生物群落与玉米地的群落相似，另一些则与未施肥草原的群落相似。请点击此处查看该图的放大版本。

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表 1：溶剂类型、添加比例（g-1 土壤）及其加入顺序。这对有机相与水相的充分提取和分离至关重要。

补充文件 S1：请点击此处下载。

讨论

对于包含大量重复和/或实验单元的实验中多个样品的检测，研究人员可能会发现磷脂脂肪酸分析（PLFA）在时间和材料消耗方面具有较高限制性25。在PLFA方法中，通过改良的Bligh和Dyer26双相水-有机溶剂萃取法提取、纯化并鉴定细胞膜磷脂。随后采用固相硅胶色谱法按极性分离脂类，并将磷脂脂肪酸进行碱性甲酯化，转化为脂肪酸甲酯。在PLFA分析中，脂类得率可能较低，但纯度非常高。Microbial ID提出了一种替代方法，即脂肪酸甲酯法（MIDI-FA）。在MIDI-FA方法中，所有脂类直接通过皂化法从纯培养物或土壤/沉积物样品11,12,27中提取。该方法脂类损失较少，且操作快速，因其省去了PLFA方法中的浓缩和纯化步骤。然而，尽管MIDI-FA方法快速且成本较低，但由于其最初设计用于鉴定纯培养中的生物体，因此缺乏初始的提取和纯化步骤。因此，该方法可能共提取土壤有机质中的类脂化合物，从而干扰微生物群落特征信号27,28,29。由于此类干扰也可能影响生物量测定结果，MIDI-FA通常仅用于粗略的定性描述土壤脂类组成13。

本文所述方法结合了两种独立提取流程的优点：1）采用改良的 Bligh 和 Dyer26 方法进行脂质的提取与浓缩；2）采用商业化开发的脂肪酸甲酯皂化、甲基化、提取及碱洗流程。该方法旨在兼收上述两种方案的优势，同时尽量减少各自的缺点15。通过在执行 MIDI-FA 之前先进行初始提取，分离出有机溶剂可溶性组分（例如 脂质），并结合纯化步骤，本方案在速度与精确性之间实现了良好平衡。尽管该方法在需要高纯度（即 用于13C PLFA 分析）或需分别分析磷脂与中性脂质的情况下可能不适用，但在许多情况下，其检测微生物群落对环境条件响应的灵敏度高于基于 DNA 的方法30,31,32,33。细胞死亡后膜脂迅速降解，因此其可反映采样时刻存活的微生物群落状态5,7，而环境 DNA 中的大量信息则来源于已死亡或非活跃的生物体34。鉴于土壤微生物中普遍存在休眠现象35，对活体生物量的表征可用于在较精细的时间尺度上理解植物-微生物间的动态相互作用，而脂质生物标志物则可用于评估微生物群落的生理状态7。已有研究表明，在大范围野外条件下评估微生物响应需要高通量方法25。尽管本文提出的方法无法完全达到 PLFA 生物标志物分析的精确度，但其在提高通量的同时，显著降低了 MIDI-FA 流程中的变异性。该方法已被证明是研究大规模农业和生态系统中多种土壤微生物群落动态问题的有效工具36,37,38,42,43,44,45,46,47,48,49,50。

采用该方法会合并脂质类别，可能导致这些独立类别中所含信息的丢失22,39，但合并脂质类别可能增强检测来自磷脂和中性脂质的16:1 ω5c的丛枝菌根真菌来源的能力40。此外，尽管该方法检测出的未知脂肪酸（可能来源于非生命有机质）数量可能较高，但研究表明其数量仍低于MIDI-FA法，并且适用于需要处理大量样品、关注样品通量的研究中对脂质谱进行处理间的比较15。通常认为中性脂质组分主要来源于真菌合成的储存脂质，尽管也可能有少量来自土壤动物的贡献41。鉴于此，本文所述方法所得结果可能显示真菌脂质18:2 ω6,9c和18:1 ω9c的贡献高于PLFA法。在中性组分中常见的其他脂质还包括一些饱和脂肪酸，例如 16:0、18:0、20:0。

脂质数据的表达和分析有多种方式。最常见的表示方法是丰度（nmol/g）-1 土壤），摩尔分数（nmol 单个脂质 / nmol-1 总脂质）和摩尔百分比（摩尔分数×100）。以样品中总脂质为归一化基准，摩尔分数和摩尔百分比用于衡量特定脂质的相对丰度。经过适当转换后， 例如，反正弦平方根变换，摩尔分数适用于主成分分析或冗余分析排序。丰度是指每克土壤中提取的特定脂质的绝对含量。由于每个细胞的脂质含量相对恒定，且脂质提取效率高且全面，因此总丰度可良好估计总脂质量，而关键指示物种的丰度则反映了其所代表生态类群的生物量17最后，分析微生物群落组成的一个有效方法是采用多变量分析方法。16, 例如排序方法，例如非度量多维尺度分析（NMDS——无需数据转换）或主成分分析（PCA），可用于比较所有脂质生物标志物的相对丰度。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国能源部大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室生物能源研究计划 DE-FC02-07ER64494）和美国能源部生物能源技术办公室可再生能源与能源效率计划（DE-AC05-76RL01830）资助。作者谨此感谢 Anders Gurda 在视频拍摄与编辑工作中所付出的耐心与精湛贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RapidVapLabconco7900000蒸发系统
RapidVapLabconco7491400样本块
耐化学腐蚀真空泵Labconco7584000真空泵
化学捕集罐Labconco7815300捕集罐
溶剂插入件Labconco7515200溶剂捕集插件
隔膜泵韦尔奇7398000DryFast 真空泵
水浴锅Fisher15-462-15Q2孔水浴锅
气相色谱仪各种N/A用于样品分析
离心各种N/A用于样品分离
冷冻干燥机各种N/A用于样品冻干
Repipet (6)BrandTech4720440用于试剂的分装
涡旋混合Fisher02-215-365模拟旋涡混合器
聚四氟乙烯离心管Thermo/Nalgene3114-0030聚四氟乙烯样品管
胶囊Thermo/NalgeneDS3131-0020聚四氟乙烯管帽
试管康宁9825-1616x100毫米试管
试管康宁9825-16xx16x150毫米试管
胶囊康宁9998-1515-415 螺纹黑色酚醛盖，带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫
巴斯德吸管Fisher13-678-20B14.6厘米
500 uL 玻璃注射器Fisher13684106LCHamilton 81217
琥珀色小瓶安捷伦5182-07164 mL 棕色小瓶
胶囊安捷伦5182-0717蓝色螺旋盖
插入片段安捷伦5181-3377400 μL 平底玻璃插件
<强>标准
19:0 乙基十九烷酸酯（Ethyl nonadecanoate）VWRTCN0459-5G分析标准品
<强>化学品
磷酸氢二钾（K2HPO4 - ACS级或更高纯度）各种N/A用于配制磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾（KH2PO4 - ACS 级或更高纯度）各种N/A用于配制磷酸盐缓冲液
甲醇（CH3OH - HPLC 级或更高纯度）各种N/A用于制备试剂1 &和 2
氢氧化钠（NaOH - ACS 级或更高纯度）各种N/A用于制备试剂1 &和 4
盐酸（6N HCl）各种N/A用于配制试剂2
正己烷（HPLC 级或更高纯度）各种N/A用于配制试剂3
MTBE（甲基叔丁基醚 - HPLC 级或更高纯度）各种N/A用于配制试剂3

参考文献

  1. Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).
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