Method Article

与复用电子检测的粒子的空间跟踪微流体平台

DOI:

10.3791/55311

⸱

March 13th, 2017

 ,  , 
1School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology, 2Institute of Electronics and Nanotechnology, Georgia Institute of Technology, 3Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们证明与结合电阻脉冲感测（RPS）与码分多址（CDMA）的综合表面电极网络的微流体平台，来复用在多个微流体通道的粒子的检测和大小。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物样品的微流体处理典型地涉及以空间分馏基于感兴趣的生物特性的样品在各种力场悬浮颗粒的差动操作。对于要用作化验读数所得的空间分布，微流体装置经常受到需要具有更高的成本和减少的可移植性复杂的仪器显微镜分析。为了解决此限制，我们开发了一种集成电子传感技术用于在微流体芯片上的不同位置的粒子的多重检测。我们的技术，被称为微流控码，结合电阻脉冲感测与码分多址压缩二维空间信息转换成一维的电信号。在本文中，我们介绍了微流控技术CODES的实际演示，检测和大小培养的癌细胞分布在多个微流体通道。如由高速显微镜验证，我们的技术能够准确地分析密集细胞群体的所有电子，而不需要外部的仪器。这样，微流控代码可以潜在地使该非常适合用于生物样品的床边血糖检测低成本集成上实验室的单芯片器件。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物粒子如悬浮在液体中的细胞，细菌或病毒的精确检测和分析是一系列应用1，2，3的极大兴趣。在大小旗鼓相当，微流体器件提供用于此目的的独特优势，如高感光度，柔和的样本处理和控制良好的微环境，4，5，6，7。此外，微流体装置可被设计成采用流体动力学和力场的组合来被动地分馏基于各种属性8，9，10，11，12生物颗粒的异质群体。在这些设备s时，得到的颗粒分布可以用作读出，但空间信息典型地只能通过显微镜，通过其直接连接到一个实验室基础设施限制了微流体装置的实用价值。因此，一个集成的传感器，可以容易地报告粒子的时空映射，因为它们是一个微流体装置上操作，可以潜在地实现低成本，集成上实验室一个芯片装置，其对样品的移动的检测特别有吸引力，资源有限的环境。

薄膜电极已被用作微流体装置集成传感器用于各种应用13,14。电阻脉冲传感（RPS）是小颗粒在微流控通道，因为它直接从电气测量15提供了一个强大的，敏感的，高通量检测机制，整合感应特别有吸引力。在RPS，在一对电极之间的阻抗调制，浸渍在电解液中，作为检测粒子的装置。当粒子穿过的孔，尺寸的粒子的顺序，数目及电流瞬态脉冲的振幅分别用于计数和大小的颗粒。此外，该传感器的几何形状可被设计用光刻分辨率塑造电阻脉冲的波形，以提高灵敏度16，17，18，19或估计在微流体通道20的颗粒的垂直位置。

我们最近推出了可扩展和简单的复用的电阻脉冲传感技术称为微流控编码正交检测由电气传感（微流控代码）21。微码依赖于电阻脉冲传感器的互连网络，每个包含微机械以独特的，可区别的方式来调节传导电极阵列的，以便使多路复用。我们已经专门设计每一个传感器，以产生类似于在码分多路访问中使用的数字码正交的电信号22（CDMA）的电信网络中，从而使各个电阻脉冲传感器信号可以从一个单一的输出波形被唯一恢复，即使信号从不同的传感器干扰。以这种方式，我们的技术压缩颗粒的二维空间信息转换成一维的电信号，允许在一个微流体芯片上的不同位置的粒子的监测，同时保持两个器件和系统级的复杂性降至最低。

在本文中，我们提出了一个详细的协议需要使用微流控技术CODES的实验和计算方法，以及为r从它在模拟生物样品的分析使用具有代表性的结果。使用来自具有四个复用的传感器，例如一原型设备的结果来解释的技术中，我们提供了（1）的微细加工的协议来创建具有微流控码技术，（2）实验装置的说明中，包括微流体装置电子，光学，和流体硬件，（3）的计算机算法，用于解码来自不同传感器的干扰信号，以及（4）从检测和癌细胞中的微流体通道的分析的结果。我们相信，通过详细的协议这里描述，其他研究人员可以申请我们的技术为他们的研究。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.编码电极的设计

注意:图1a示出了微图案化电极的3-D结构。

  1. 设计一组四个的7位Gold码进行编码的微流体通道23。
    1. 构造两个线性反馈移位寄存器（的LFSR），每个代表本原多项式。
    2. 使用的LFSR生成一个优选的一对7-m位-sequences。
    3. 循环移位首选对米 -sequences并加入他们MOD 2，产生四种不同的Gold码。
  2. 设计编码电极（ 图1b）的布局。
    1. 将三个电极端子，在三个角表示正，负电极和参考电极。
    2. 路线正极和负极迹线在每个微流体通道的相对两侧。
    3. 延长的正极和负极进微流体通道作为电极指，以下的唯一分配金码（ 图1c）。
    4. 放置参考电极中的正，负电极指之间。
    5. 放置正极和负极痕迹远离最外层的参考电极指，以最小化的编码区外部的电传导。

2.表面电极的微细

注意:图2b示出表面电极的制造过程。

  1. 清洗在食人鱼溶液4英寸的硼硅玻璃晶片（98％硫酸:30％过氧化氢= 5:1）在120℃下进行20分钟，以除去所有的有机污染物。然后放置在一个200℃热板上的晶片20分钟以去除残留的水。
  2. 晶圆转移到一个微调。分配2毫升负光致抗蚀剂到晶片并以3的速度旋转该晶片，000转40秒，以均匀涂布用1.5微米的光致抗蚀剂层的晶片。
  3. 放置在一个150℃热板上的晶片和烘烤纺丝光刻胶1分钟。
  4. 通过使用掩模对准一个铬掩模暴露光致抗蚀剂，以365纳米的UV光（225毫焦耳/厘米2）。
  5. 放置在100℃的热板上的晶片和烘烤曝光的光刻胶1分钟。
  6. 通过浸渍在光致抗蚀剂显影剂（RD6）晶片15秒开发光致抗蚀剂。轻轻喷洒去离子（DI）水和洗晶片。通过吹压缩氮气干燥。
  7. 放置具有图案化光致抗蚀剂的晶片到一个电子束金属蒸发器，并在3×10 -6乇的与碱压力沉积20纳米厚的铬膜，接着是80纳米厚的金膜到晶片1埃/秒的沉积速率。
  8. 浸入涂覆有金属的晶片在丙酮超声波浴设定在40千赫与100％的幅度的频率在室温回火30分钟ATURE蚀刻下面的光刻胶并完成剥离工艺。
  9. 切块的晶片成使用常规的切割锯小块。

3. SU-8模具微流体通道的制作

注意:图2a示出了模具的微流体通道的制造过程。

  1. 清洗和烘烤用2.1描述的相同的顺序的4英寸硅晶片。
  2. 晶圆转移到一个微调。倾4mL的光致抗蚀剂到晶片上。涂上光刻胶的晶片。
    1. 旋转晶片以500rpm进行15秒。
    2. 旋转晶片以1000rpm进行15秒。
    3. 旋转晶片以3000rpm 60秒，以获得一个均匀地涂敷15微米厚的光致抗蚀剂层。
  3. 放置晶片面朝上擦拭浸泡在丙酮洁净室，并从背面和晶片的边缘去除残留光致抗蚀剂。
  4. 传送晶片到热复吃软烘烤。首先，烘烤晶片在65℃下1分钟。然后迅速将晶片移动到95℃的热板上烘烤2分钟。
  5. 通过一个铬掩膜通过使用掩模对准器暴露光致抗蚀剂，以365纳米的UV光（180毫焦耳/厘米2）。
  6. 烘烤在65℃下将晶片暴露后1分钟，然后在95℃下2分钟。
  7. 浸入开发商晶圆并轻轻摇动容器3分钟。然后，冲洗用异丙醇醇（IPA）的晶片，并通过吹压缩氮气干燥。如果一个白色的残余物出现在晶片上，再浸入入显影剂和开发用于更长的时间和干燥。
  8. 烤上的200℃热板上的晶片30分钟完全干燥它。
  9. 使用轮廓在整个晶片的不同位置，以确保均匀性测量图案化的光致抗蚀剂的厚度。
  10. 通过利用汽相淀积的技术Silanize模具晶片。加入TR 200微升ichlorosilane在与8小时的SU-8模具晶片沿真空干燥器培养皿和地点。

4.微流体代码设备的组装

  1. 放置4英寸硅晶片，在一个150毫米直径的培养皿的模具中，并通过从它的边缘胶带固定。
  2. 混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚合物和交联剂以10:1的比例，并倾将50g混合物放入培养皿。放置在真空干燥器培养皿脱气该混合物1小时，然后在65℃下固化它的烘箱中至少4小时（ 图2a）。
  3. 用手术刀切出固化硅橡胶层，使用镊子把它剥开模具晶圆。验证的原理的设备的尺寸是约20mm×7毫米。然后通过与PDMS用于使用活检穿孔机微流体通道的入口和出口的直径为1.5毫米打孔。
  4. 通过将我清洁PDMS部分的图案的一面T于无尘室胶带。
  5. 通过用丙酮，IPA的去离子水漂洗清洗与表面电极的玻璃基板和使用压缩氮气干燥。
  6. 与每个部分在设定为100毫瓦的RF等离子体发生器朝上的微机械加工的侧激活的PDMS在氧等离子体的表面和玻璃基板30秒。
  7. 对齐用在玻璃基板上表面的电极的光学显微镜，然后将在物理接触的两个等离子体激活表面的PDMS微流体通道。
  8. 烤上的70℃热板上的设备5分钟，朝向热板玻璃侧。
  9. 通过焊接连接的电线电极的接触垫。

5.制备模拟生物样品

  1. 培养HeyA8人卵巢癌细胞中的RPMI 1640补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素-链霉素在5％CO 2气氛中于37℃直到他们达到80％汇合。
  2. 使用玻璃吸管培养瓶中吸出介质。分配，然后吸出1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
  3. 孵育细胞在2mL 0.05％（重量/体积）在37℃下2分钟的胰蛋白酶溶液中止贴壁细胞。然后，加入4毫升培养基中和胰蛋白酶。
  4. 离心机在100×g下5分钟将细胞悬浮液以沉淀细胞在试管中。然后，吸上清彻底。
  5. 轻轻吹打上下以机械解离的细胞团块重悬在1-2毫升1×PBS中的细胞。
  6. 绘制细胞悬液少量到吸管和计数用血球细胞的数目。
  7. 稀释用PBS将细胞悬液以10 5 -10 6个细胞/ mL的最终细胞浓度制备样品。

6.运行微流控代码设备

注:网络古尔图3示出的实验装置。

  1. 放置的微流体码装置上的光学显微镜的阶段。
  2. 申请使用电子函数发生器400 kHz正弦波到芯片上的参比电极。
  3. 正和负感测电极连接到两个独立的跨阻抗放大器的电流信号从每个转换为电压信号。
  4. 减去以获得一个双极信号使用差分电压放大器的负感测电极的电压信号的正感测电极的电压信号。
  5. 使用高速摄像机来进行验证和表征的目的设备的光学记录操作。
  6. 驱动通过微流体码装置中的细胞悬浮液在使用注射泵以恒定流速（50-1000微升/小时）。
  7. 测量使用锁定放大器的阻抗调制信号。
    1. 参考交流信号连接到裁判该锁定放大器的erence输入。差分的双极信号连接到锁定放大器作为输入信号。
    2. 获得来自锁相放大器输出的差分信号的RMS幅值。
  8. 样品在1 MHz速率的锁定放大器的输出信号转换成通过一个数据采集板用于进一步分析的计算机。

7.处理传感器信号的

  1. 传输记录电气数据到MATLAB进行后期处理和解码。
  2. 过滤使用巴特沃斯滤波器（MATLAB内置函数），以去除高频噪声（> 2.5千赫）数字域记录的信号。
  3. 生成传感器信号模板的代码库。
    1. 识别对应于在该装置的每个传感器代表非重叠码信号和从数据集作为单独的波形矢量提取这些信号块。
    2. 每个标准化模板代码波形矢量通过它的力量。使用MATLAB内置函数（bandpower）来测量信号功率。
    3. 使用MATLAB函数（重采样）由具有变化的持续时间，以适应在细胞流速在电极变型数字创建标准化代码信号的版本以展开模板库。
  4. 识别对应于传感器的活动中的信号块:在滤波后的波形（阈SNR> 12dB）的波形与下阈值的SNR将被视为噪声。
  5. 通过使用基于连续干扰消除的迭代算法，在多用户CDMA通信网24，25通常采用的技术，解码中所记录的信号的传感器活性各个块。
    1. 计算与所有的使用滑动点积库中的模板的每个信号块的互相关。
    2. 确定产生LARG模板EST自相关峰值以确定主个人传感器码信号。记录的自相关峰的时间和幅度。
    3. 通过缩放基于所测量的自相关峰值幅度所确定的代码模板和定时信息（在步骤7.5.2确定）构造一个估计的传感器代码信号。
    4. 减去从原始数据所估计的传感器代码信号。
    5. 从7.5.1迭代的过程中，直到剩余信号没有像在模板库中的任何信号，数学上定义为相关系数小于0.5。
  6. 缩小步骤7.5使用一个优化过程的初始传感器信号估计。
    1. 通过从每次迭代增加估计个体传感器信号重建该信号。
    2. 扫围绕原始估计各个传感器信号的幅度，持续时间和定时，以产生与记录的电信号的最佳拟合基于最小二乘逼近26。
  7. 通过对光学图像校准电信号转换估计传感器信号的振幅成细胞大小。

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Results

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由分布在四个微流体通道四个传感器微流体码装置， 如图1b所示。在这个系统中，每个微流体通道的横截面被设计为接近的小区的大小，以便（1）的多个细胞不能越过在平行和（2）细胞保持靠近电极提高灵敏度的电极。每个传感器被设计以产生一个唯一的7位的数字码。然后将该装置用的细胞悬浮液进行测试。对应于四个单独的传感器记录，电信号被示出在图4中相关的理想的数字码。记录的信号密切配合与理想的方波脉冲，而确实存在小的偏差。这种偏离的几个因素，包括共面的电极之间的非均匀电场的组合造成的，不同的电极对，的球状之间耦合细胞，以及在微流体通道的细胞的恒定流速。我们创建基础上，重新编码传感器信号的模板库。由所记录的信号与所有的在库中的模板相关，我们确定的模板产生的最大自相关峰值（ 图4）。作为用于微流体通道的数字码被设计成彼此正交，显性自相关峰值可以有力地在此过程中确定。使用这种方法，我们可以计算确定微流体通道中的细胞穿过时，传感器信号的持续时间，因此，细胞的流动速度。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多个电阻脉冲传感器先前已经掺入微流控芯片28，29，30，31，32。在这些系统中，电阻脉冲传感器要么不多路复用28，29，30，31或它们需要在不同的频率32被驱动单个传感器。在这两种情况下，需要有专用的外部连接的芯片上的每个电阻脉冲传感器，因此大量的传感器不能没有更大的硬件的复杂集成。微流体码的重要的优点在于，它允许从一个简单的装置中的单个输出的多个电阻脉冲传感器的同时读取。我们利用米实现这一目标电信常用ult...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了美国国家科学基金奖 No.ECCS 1610995。作者要感谢电子与纳米技术研究所和 Parker H. Petit 生物工程与生物科学研究所的工作人员在使用共享设施方面提供的支持。作者还要感谢 Chia-Heng Chu 在准备手稿时提供的帮助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
98% 硫酸   BDH ChemicalsBDH3074-3.8LP
30% 过氧化氢  BDH ChemicalsBDH7690-3
三氯氢硅Aldrich 化学235725-100G
NR9-1500PY 负性光刻胶Furuttex
光刻胶显影剂 RD6Furuttex
丙酮BDH 化学品BDH1101-4LP
SU-8 2015 负性光刻胶MicrochemSU8-2015
SU-8 显影MicrochemY010200
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）道康宁3097358-1004Sylgard 184 有机硅弹性体套件
丙醇BDH 化学品BDH1133-4LP
RPMI 1640康宁 Cellgro10-040-CV
胎牛血清 （FBS）Seradigm1500-050
青霉素-链霉素AmrescoK952-100ML
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）康宁 Cellgro21-040-CM
PHD 22/2000 注射泵哈佛仪器70-2001
HF2LI 锁相放大器苏黎世仪器
HF2TA 电流放大器苏黎世仪器
EclipseTi-U 显微镜尼康公司
DS-Fi2 高清彩色相机 尼康公司
v7.3 高速相机幻影
PCIe-6361 数据采集板 National Instruments781050-01
BNC-2120屏蔽连接器块National Instruments777960-01 
PX-250 等离子处理系统Nordson MARCH 
剂 异

References

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