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方法文章

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

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DOI：

10.3791/55311

⸱

2017年3月13日

 ,  , 
1School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology, 2Institute of Electronics and Nanotechnology, Georgia Institute of Technology, 3Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology

本文内容

摘要

我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。

摘要

生物样本的微流控处理通常涉及在不同力场下对悬浮颗粒进行差异化操控，从而根据感兴趣的生物特性实现样本的空间分离。为了将所得的空间分布用作检测读数，微流控装置通常需要进行显微分析，而这依赖于复杂且成本较高、便携性较差的仪器设备。为克服这一局限，我们开发了一种集成化电子传感技术，可在微流控芯片的不同位置对颗粒进行多重检测。我们的技术称为微流控编码检测技术（Microfluidic CODES），它将电阻脉冲传感与码分多址技术相结合，将二维空间信息压缩为一维电信号。本文展示了微流控编码检测技术在多个微流控通道中分布的培养癌细胞的检测与尺寸分析方面的实际应用。通过高速显微镜验证，该技术能够完全以电子方式准确分析高密度的细胞群体，无需依赖外部仪器。因此，微流控编码检测技术有望推动低成本、集成化的芯片实验室设备的发展，特别适用于生物样本的即时检测。

引言

准确检测和分析悬浮在液体中的细胞、细菌或病毒等生物颗粒，对于多种应用具有重要意义1,2,3。微流控装置在尺寸上与这些生物颗粒相匹配，为此目的提供了独特优势，例如高灵敏度、温和的样品操作以及高度可控的微环境4,5,6,7。此外，微流控装置可被设计为结合流体动力学与力场，以被动分离具有不同特性的异质性生物颗粒群体8,9,10,11,12。在这些装置中，颗粒的分布结果可用作读出信号，但空间信息通常只能通过显微镜获取，这使得微流控装置必须依赖实验室基础设施，从而限制了其实际应用。因此，若能集成一种传感器，可在颗粒于微流控装置上被操控的同时实时报告其时空分布信息，则有望实现低成本、集成化的芯片实验室装置，这类装置在移动性高、资源有限的检测环境中尤为具有吸引力。

薄膜电极已被用作微流控装置中的集成传感器，适用于多种应用13,14。电阻脉冲传感（RPS）在微流道中对小颗粒进行集成检测方面尤其具有吸引力，因为它能够通过直接的电学测量提供一种稳定、灵敏且高通量的检测机制15。在RPS中，浸没于电解液中的一对电极之间的阻抗调制被用于检测颗粒。当颗粒穿过尺寸与其相近的孔隙时，电流中瞬态脉冲的数量和幅度分别用于颗粒计数和尺寸测定。此外，传感器几何结构可通过光刻分辨率进行设计，以调控电阻脉冲波形，从而提高检测灵敏度16,17,18,19，或用于估计颗粒在微流道中的垂直位置20。

我们最近提出了一种可扩展且简单的多重电阻脉冲传感技术，称为微流控编码正交电学检测技术（Microfluidic Coded Orthogonal Detection by Electrical Sensing, Microfluidic CODES）21。Microfluidic CODES 依赖于一个相互连接的电阻脉冲传感器网络，每个传感器由微加工电极阵列构成，能够以独特且可区分的方式调制导电性，从而实现多重检测。我们特别设计了每个传感器，使其产生类似于码分多址22（CDMA）通信网络中所用数字编码的正交电信号，因此即使来自不同传感器的信号发生干扰，也能从单一输出波形中唯一地还原出各个电阻脉冲传感器的信号。通过这种方式，该技术将颗粒在二维空间中的位置信息压缩为一维电信号，从而能够在微流控芯片的不同位置对颗粒进行监测，同时最大限度地降低器件和系统层面的复杂性。

本文介绍了一套详细的实验与计算方法操作流程，用于实现微流控 CODES 技术，并展示了该技术在模拟生物样品分析中的代表性应用结果。以包含四个多路复用传感器的原型器件结果为例，本文提供了以下方面的操作方案：（1）采用微流控 CODES 技术制备微流控器件的微加工工艺；（2）实验装置的组成说明，包括电子、光学和流体硬件；（3）用于解码来自不同传感器的干扰信号的计算机算法；（4）在微流控通道中对癌细胞进行检测与分析的结果。我们相信，其他研究人员可依据本文所述的详细操作流程，将本技术应用于各自的科研工作中。

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方案

1. 编码电极的设计

注意：图1a展示了微图案电极的三维结构。

  1. 为微流控通道的编码设计一组四个7位Gold码23。
    1. 构建两个线性反馈移位寄存器（LFSR），每个寄存器代表一个本原多项式。
    2. 利用LFSR生成一对优选的7位m-序列。
    3. 对这对优选的m-序列进行循环移位，并在模2下相加，以生成四个不同的Gold码。
  2. 设计编码电极的布局（图1b）。
    1. 在三个角落放置三个电极端子，分别代表正极、负极和参考电极。
    2. 将正极和负极电极走线布设在每条微流控通道的相对两侧。
    3. 将正极和负极电极延伸为电极指状结构，插入微流控通道中，并按照唯一指定的Gold码进行排列（图1c）。
    4. 将参考电极置于正极和负极电极指状结构之间。
    5. 将正极和负极电极走线远离最外侧的参考电极指状结构，以尽量减少编码区域外的电导。

2. 表面电极的微加工

注意：图2b展示了表面电极的制备过程。

  1. 将一片4英寸的硼硅酸盐玻璃晶圆浸入piranha溶液（98%浓硫酸 : 30%过氧化氢 = 5 : 1）中，在120 °C下处理20分钟，以去除所有有机污染物。随后将晶圆置于200 °C的加热板上加热20分钟，以除去残留水分。
  2. 将晶圆转移至匀胶机。在晶圆表面滴加2 mL负性光刻胶，以3,000 rpm的转速旋转40秒，使晶圆表面均匀涂覆一层1.5-µm厚的光刻胶。
  3. 将晶圆置于150 °C加热板上，对旋涂后的光刻胶烘烤1分钟。
  4. 使用掩模对准仪，通过铬掩模将光刻胶暴露于365-nm紫外光（225 mJ/cm2）下进行曝光。
  5. 将晶圆置于100 °C加热板上，对曝光后的光刻胶进行1分钟的后烘处理。
  6. 将晶圆浸入光刻胶显影液（RD6）中显影15秒。用去离子水（DI水）轻轻喷淋冲洗晶圆，随后用压缩氮气吹干。
  7. 将带有图案化光刻胶的晶圆放入电子束金属蒸发仪中，在基础真空度为3×10-6 Torr、沉积速率为1 Å/s的条件下，先沉积20 nm厚的铬层，再沉积80 nm厚的金层。
  8. 将金属镀膜后的晶圆置于丙酮中超声浴中，在室温下以40 kHz频率、100%振幅处理30分钟，以蚀去底层的光刻胶，完成剥离工艺。
  9. 使用常规切割锯将晶圆切割成较小的芯片。

3. 微流控通道 SU-8 模具的制备

注意：图2a展示了微流控通道模具的制备过程。

  1. 使用与 2.1 节所述相同的步骤清洁并烘烤一片 4 英寸的硅片。
  2. 将硅片转移至匀胶机。在硅片上倒入 4 mL 光刻胶，对硅片进行光刻胶涂覆。
    1. 以 500 rpm 转速旋转硅片 15 秒。
    2. 以 1,000 rpm 转速旋转硅片 15 秒。
    3. 以 3,000 rpm 转速旋转硅片 60 秒，以获得均匀涂覆的 15-µm 厚光刻胶层。
  3. 将硅片面朝上放置在浸有丙酮的洁净室擦拭布上，去除硅片背面和边缘的残留光刻胶。
  4. 将硅片转移至加热板进行前烘。首先在 65 °C 下烘烤 1 分钟，然后迅速将硅片移至 95 °C 加热板上，继续烘烤 2 分钟。
  5. 使用掩模对准仪，通过铬掩模将光刻胶暴露于 365-nm 紫外光（180 mJ/cm2）下进行曝光。
  6. 曝光后，将硅片在 65 °C 下烘烤 1 分钟，随后在 95 °C 下烘烤 2 分钟。
  7. 将硅片浸入显影液中，轻轻摇晃容器 3 分钟。然后用异丙醇（IPA）冲洗硅片，并用压缩氮气吹干。若硅片表面出现白色残留物，需再次将其浸入显影液中延长显影时间并重新干燥。
  8. 将硅片置于 200 °C 加热板上烘烤 30 分钟，以实现完全干燥。
  9. 使用台阶仪在硅片不同位置测量图案化光刻胶的厚度，以确保其均匀性。
  10. 采用气相沉积法对模具硅片进行硅烷化处理。在培养皿中加入 200 µL 三氯硅烷，并与 SU-8 模具硅片一同置于真空干燥器中处理 8 小时。

4. 微流控 CODES 装置的组装

  1. 将带有模具的4英寸硅片放入直径为150毫米的培养皿中，并用胶带从边缘固定。
  2. 按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与交联剂，取50 g混合物倒入培养皿中。将培养皿置于真空干燥器中脱气1小时，然后在65 °C烘箱中固化至少4小时（图2a）。
  3. 使用解剖刀切割固化后的PDMS层，并用镊子将其从模具硅片上剥离。原理验证装置的尺寸约为20 mm × 7 mm。随后使用直径为1.5 mm的活检打孔器在PDMS上打孔，作为微流控通道的进样口和出样口。
  4. 将PDMS部件的图案面贴附于洁净室粘性胶带上，以清洁其表面。
  5. 用丙酮、异丙醇（IPA）、去离子水依次冲洗带有表面电极的玻璃基底，并用压缩氮气吹干。
  6. 将PDMS和玻璃基底的表面置于射频等离子体发生器中，在100 mW功率下进行30秒的氧气等离子体处理，使两者的微加工面朝上。
  7. 在光学显微镜下将PDMS微流控通道与玻璃基底上的表面电极对准，然后使两个经等离子体活化的表面紧密接触。
  8. 将装置置于70 °C加热板上加热5分钟，玻璃面朝向加热板。
  9. 通过焊接将电极的焊盘与导线连接。

5. 模拟生物样品的制备

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将HeyA8人卵巢癌细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，直至细胞融合度达到80%。
  2. 使用玻璃移液管吸除培养瓶中的培养基。加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后再次吸除。
  3. 加入2 mL 0.05%（w/v）胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2分钟，以悬浮贴壁细胞；然后加入4 mL培养基以中和胰蛋白酶活性。
  4. 将细胞悬液在试管中以100 × g离心5分钟，使细胞沉淀；随后完全吸除上清液。
  5. 用移液器轻轻吹打，以1–2 mL 1× PBS重悬细胞，机械性分散细胞团块。
  6. 吸取少量细胞悬液至移液器中，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
  7. 用PBS稀释细胞悬液，制备终浓度为105–106个细胞/mL的样品。

6. 运行微流控 CODES 装置

注意：图3展示了实验装置。

  1. 将微流控 CODES 装置放置在光学显微镜的载物台上。
  2. 使用电子函数发生器，向芯片上的参考电极施加 400 kHz 的正弦波信号。
  3. 将正负检测电极分别连接至两个独立的跨阻放大器，以将每个电极的电流信号转换为电压信号。
  4. 使用差分电压放大器将正检测电极的电压信号从负检测电极的电压信号中减去，从而获得双极性信号。
  5. 使用高速相机对装置的运行过程进行光学记录，用于验证和表征。
  6. 使用注射泵以恒定流速（50–1,000 µL/h）驱动细胞悬液通过微流控 CODES 装置。
  7. 使用锁相放大器测量阻抗调制信号。
    1. 将参考交流信号连接至锁相放大器的参考输入端，将差分双极性信号作为输入信号连接至锁相放大器。
    2. 从锁相放大器输出端获取差分信号的有效值（RMS）幅值。
  8. 通过数据采集板以 1 MHz 的采样率将锁相放大器的输出信号采集至计算机，用于进一步分析。

7. 传感器信号的处理

  1. 将记录的电学数据导入 MATLAB 进行后期处理和解码。
  2. 在数字域中使用巴特沃斯滤波器（MATLAB 内置函数）对记录的信号进行滤波，以去除高频噪声（>2.5 kHz）。
  3. 从传感器信号生成模板码库。
    1. 识别设备中每个传感器对应的代表性非重叠码信号，并从数据集中提取这些信号片段作为独立的波形向量。
    2. 通过信号功率对每个模板码波形向量进行归一化处理。使用 MATLAB 内置函数（bandpower）测量信号功率。
    3. 使用 MATLAB 函数（resample）通过数字方式生成具有不同持续时间的归一化码信号版本，以扩展模板库，适应细胞在电极上流动速度的变化。
  4. 在滤波后的波形中识别对应于传感器活动的信号片段（阈值：信噪比 SNR > 12 dB）。信噪比低于该阈值的波形将被视为噪声。
  5. 采用基于连续干扰消除的迭代算法对记录信号中各个传感器活动片段进行解码，该技术常用于多用户码分多址（CDMA）通信网络24,25。
    1. 使用滑动点积计算每个信号片段与模板库中所有模板的互相关。
    2. 识别产生最大自相关峰值的模板，以确定主导的单个传感器码信号。记录该自相关峰值的时间和幅度。
    3. 根据测得的自相关峰值幅度和时间信息（在步骤 7.5.2 中确定），通过缩放已识别的码模板构建估计的传感器码信号。
    4. 从原始数据中减去估计的传感器码信号。
    5. 从步骤 7.5.1 开始重复该过程，直到残差信号与模板库中的任何信号均无显著相似性，数学上定义为相关系数小于 0.5。
  6. 利用优化过程对步骤 7.5 得到的初始传感器信号估计值进行优化。
    1. 通过叠加每次迭代中估计的单个传感器信号重建信号。
    2. 在原始估计值附近扫描单个传感器信号的幅度、持续时间和时序，基于最小二乘法逼近26，获得与记录的电信号最佳拟合的结果。
  7. 通过将电信号与光学图像进行校准，将估计传感器信号的幅度转换为细胞尺寸。

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结果

一种微流控 CODES 装置，包含分布在四个微流控通道上的四个传感器，如图 1b所示。在该系统中，每个微流控通道的横截面设计为接近细胞尺寸，以确保（1）多个细胞无法并行通过电极上方，（2）细胞始终靠近电极，从而提高检测灵敏度。每个传感器设计为生成唯一的 7 位数字编码。随后使用细胞悬液对该装置进行测试。图 4展示了对应于四个独立传感器的记录电信号及其相应的理想数字编码。记录信号与理想的方波脉冲高度吻合，尽管存在微小偏差。这些偏差源于多种因素的综合作用，包括共面电极间非均匀电场、不同电极对之间的耦合效应、细胞的球形形态以及细胞在微流控通道中恒定的流动速度。我们基于记录的传感器信号构建了模板库。通过将记录信号与库中所有模板进行相关性比对，确定了产生最大自相关峰的模板（图 4）。由于各微流控通道的数字编码设计为相互正交，因此在此过程中可稳健地识别出主导的自相关峰。利用该方法，我们可计算确定细胞所通过的微流控通道、传感器信号持续时间，进而推算出细胞的流动速度。

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讨论

此前，多个电阻脉冲传感器已被集成到微流控芯片中28,29,30,31,32。在这些系统中，电阻脉冲传感器要么未实现多路复用28,29,30,31，要么需要各个传感器在不同频率下独立驱动32。在这两种情况下，芯片上的每个电阻脉冲传感器都需要专用的外部连接，因此若不增加硬件复杂性，便无法集成大量传感器。微流控 CODES（Microfluidic CODES）的重要优势在于，它能够在结构简单的设备中，通过单一输出端口同...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会资助项目（编号：ECCS 1610995）的支持。作者感谢电子与纳米技术研究所及帕克·H·佩蒂特生物工程与生物科学研究所工作人员在使用共享设施方面提供的支持。作者还感谢Chia-Heng Chu在手稿准备过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
98% 硫酸   BDH ChemicalsBDH3074-3.8LP
30% 过氧化氢  BDH ChemicalsBDH7690-3
三氯硅烷Aldrich Chemistry235725-100G
NR9-1500PY 负性光刻胶Furuttex
光刻胶显影液 RD6Furuttex
丙酮BDH ChemicalsBDH1101-4LP
SU-8 2015 负性光刻胶MicrochemSU8-2015
SU-8 显影液MicrochemY010200
聚二甲基硅氧烷 (PDMS)Dow Corning3097358-1004Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒
异丙醇BDH ChemicalsBDH1133-4LP
RPMI 1640 培养基Corning Cellgro10-040-CV
胎牛血清 (FBS)Seradigm1500-050
青霉素-链霉素AmrescoK952-100ML
磷酸盐缓冲液 (PBS)Corning Cellgro21-040-CM
PHD 22/2000 注射泵Harvard Apparatus70-2001
HF2LI 锁相放大器Zurich Instrument
HF2TA 电流放大器Zurich Instrument
Eclipse Ti-U 显微镜Nikon Corporation
DS-Fi2 高清彩色相机 Nikon Corporation
v7.3 高速相机Phantom
PCIe-6361 数据采集板 National Instruments781050-01
BNC-2120 屏蔽连接器模块National Instruments777960-01 
PX-250 等离子体处理系统Nordson MARCH 

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