使用3D打印导板和环堆叠法制备可缩放的工程化血管移植物

摘要

可扩展的工程化血管将提高其临床适用性。利用易于调节尺寸的3D打印导模，可制备出血管平滑肌环并将其堆叠成管状结构，从而形成血管移植物。通过简单更换3D打印导模的尺寸，即可调节移植物的大小，以满足人体冠状动脉各种尺寸范围的需求。

摘要

冠状动脉疾病仍然是导致死亡的主要原因，影响着数百万美国人。由于自体血管移植物的可用性有限，工程化移植物为患者治疗提供了巨大潜力。然而，现有的工程化血管移植物通常难以实现规模化生产，需要制造定制的模具或聚合物管以适配不同尺寸，这一过程耗时且成本高昂。人类动脉的管腔直径约为2.0–38 mm，管壁厚度约为0.5–2.5 mm。我们开发了一种称为“环状堆叠法”的技术，通过使用中心柱导板控制管腔直径，并利用外层壳体设定血管壁厚度，从而制备出所需细胞类型的可变尺寸组织环，本文以血管平滑肌细胞（SMCs）为例进行了演示。随后将这些组织环堆叠形成管状结构，模拟天然血管的形态。通过简单调整堆叠环的数量，即可定制所需血管长度。利用该技术，可快速制造出多种尺寸和长度的管状组织，满足临床和患者的个体化需求。

引言

在冠状动脉疾病（CAD）的治疗中，通常采用患者自身的血管作为旁路手术的移植材料。然而，许多病情严重的患者并无可用的健康血管供自身移植；即使存在可用血管，供体部位也会造成显著的额外损伤，并具有较高的感染风险。¹ 工程化血管移植物有望填补这一临床需求。为了满足不同患者对血管尺寸的广泛需求，血管工程的可扩展性至关重要。然而，目前的血管工程技术难以实现规模化，通常需要重新制造复杂的模具或聚合物支架。大多数工程化移植物要么采用聚合物管状支架，并在其上接种血管成纤维细胞、平滑肌细胞或内皮细胞；要么将细胞片卷绕在芯模上以形成组织管状结构。目前处于临床试验阶段的两种工程化血管移植物均基于脱细胞化的聚合物-细胞外基质（ECM）平台。^2,3,4 现有用于血管修复的聚合物移植物已知存在通畅性问题，若移植物中长期保留聚合物成分，可能在长期应用中引发严重问题。管状模具已被用于制造完全由细胞构成的血管^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}，但此类方法若需制备多种尺寸的血管，则必须额外设计并制造定制模具。

本文所述方法涵盖一种利用可定制的3D打印嵌件和传统培养板制备易于扩缩的工程化血管移植物的新技术。¹⁴ 将细胞接种到含有中央柱和外层壳结构的培养板中。中央柱用于控制管腔直径，使细胞单层自组装成环状组织。外层壳则控制环的厚度，从而决定最终血管的壁厚。完成的组织环可堆叠形成管状血管移植物。该方法的优势在于被称为 "环堆法，" 任何贴壁细胞类型均可接种于该培养板装置中，通过简单调整引导插入件，即可生成适用于特定应用需求的任意尺寸的组织环或组织管。在组织工程的对比技术中，创建组织环的方法仍然难以实现规模化。^15,16 需要为每种所需尺寸重新制造模具。此外，采用该方法制造的血管移植物可在2-3周内完成生产，比其他人工血管的制备速度快数周。⁶ 对于临床而言，这种时间差异可能对病情恶化患者的治疗产生显著影响。

方案

1. 细胞培养准备

1. 使用购自商业渠道的人主动脉平滑肌细胞。
2. 将细胞培养于平滑肌细胞生长培养基中，该培养基由88.6%的231培养基、0.1%的重组人胰岛素（rH-insulin）、重组人成纤维细胞生长因子（rH-FGF）、重组人表皮生长因子（rH-EGF）和抗坏血酸，以及5%胎牛血清（FBS）、5% L-谷氨酰胺和1%抗生素/抗真菌剂组成。
   注：每种生长因子、FBS和L-谷氨酰胺均购自血管培养基生长套装。
3. 每48小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到约90%，并准备用于组织接种。
4. 在更换培养基期间，将细胞置于培养箱中孵育以进行扩增。

2. 3D 打印嵌件和定制硅胶模具板的制备

1. 使用商用3D打印机（例如，Replicator Mini）打印培养皿插件。
   1. 使用开源3D设计软件（如Blender）创建打印外层壳体和柱体的3D模型。
   2. 以.stl格式导出模型的驱动文件，以便传输至3D打印机的软件中。
   3. 使用装入3D打印机的聚乳酸（PLA）丝材打印柱体和外壳。
   4. 打印完成后，将每个插件在70%–100%乙醇溶液中浸泡30分钟以进行灭菌。
2. 按1:10的比例配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅胶聚合物的固化剂与基础聚合物混合液，并在室温下静置脱气10分钟。
   1. 定义用作小型（35 mm）、中型（60 mm）和大型（100 mm）的培养皿尺寸。
   2. 分别向小型、中型和大型培养皿中加入2 mL、4 mL和6 mL未固化的硅胶，形成覆盖整个培养皿底部的薄层。
   3. 通过将PDMS倒入100 mm培养皿中至7 mm高度来制作小型培养皿用柱体，并在60 °C加热板上固化约2–3小时。然后使用5 mm活检打孔器打出圆柱形柱体。用少量未固化的PDMS将每个PDMS圆柱体固定在小型培养皿的中央位置。
   4. 对于中型和大型培养皿，在培养皿底部的PDMS完全固化前，将直径分别为10 mm和20 mm的3D打印柱体居中放置于各自的培养皿中。对于大型培养皿，还需将一个直径约为66.7 mm的3D打印外壳等距放置于柱体周围。
      1. 将每个培养皿置于60 °C加热板上在开放空气中固化约2–3小时，并预留18小时用于聚合物脱气。按照图1所示，将打印部件固定在培养皿的正确区域和方向。
   5. 向所有培养皿内部加入70%乙醇与30%蒸馏水的混合溶液，浸泡30分钟以灭菌，然后盖上皿盖。
   6. 小心吸除每个培养皿中的乙醇，并使其自然风干。
   7. 在生物安全柜（BSC）内将每个培养皿与其皿盖正面朝上并列放置。将培养皿和皿盖在BSC内暴露于紫外光下照射30分钟以完成灭菌。自紫外照射后，所有操作均需采用无菌技术进行。

3. 纤维蛋白水凝胶的制备、平滑肌细胞接种及培养板的维护

1. 分别针对小、中、大尺寸的培养板，配制含有生长培养基和0.01% TGF-β1的纤维蛋白凝胶溶液，体积分别为0.5 mL、1.1 mL和1.81 mL。
   1. 分别向小、中、大尺寸培养板的培养基中加入40 µL、88.4 µL和145 μL凝血酶（储存浓度为100 U/mL）。用手轻轻晃动每个培养板，确保凝血酶在培养基中均匀混合。
   2. 随后，分别以滴加方式将160 µL、354 µL和580 μL纤维蛋白原（储存浓度为20 mg/mL）沿圆形路径加入小、中、大尺寸培养板的凝血酶-培养基混合液中。用手轻轻晃动，确保水凝胶充分混合并形成均匀的覆盖层。
   3. 在室温下静置10–15分钟，使水凝胶完成固化。
2. 用胰蛋白酶消化在150 mm细胞培养皿中扩增的平滑肌细胞，并按照标准操作进行离心。将所得细胞沉淀重悬于3 mL分化培养基中，该培养基由98% 231培养基、1% FBS和1%抗生素/抗真菌剂组成。
   1. 使用2 mL移液器反复吹打细胞，充分混匀以打散任何细胞团块。用血细胞计数板计数细胞，并分别制备浓度为2 × 10⁶ cells/mL、1.0 × 10⁷ cells/mL和1.4 × 10⁷ cells/mL的小、中、大尺寸培养板所需细胞悬液。
   2. 将每种细胞悬液各1 mL分别加入标记为“小”、“中”、“大”的50 mL锥形离心管中。如需制备更多组织环，按相同方式设置额外的50 mL锥形离心管。
   3. 向每根离心管中加入分化培养基，使最终接种体积分别为2 mL、4 mL和5 mL，对应小、中、大尺寸血管环。然后，小心地将细胞悬液以滴加方式逐滴滴加至相应培养板中已准备好的水凝胶表面。
   4. 将培养板放入37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
3. 每48–72小时更换一次各培养板中的分化培养基。对于大尺寸培养板，首次换液在24小时进行，之后每48–24小时更换一次，以补偿较高的细胞接种密度。
   1. 接种后2–4天，组织环会完全向中心支柱收缩。此时，分别向小、中、大尺寸组织环中加入10 µL、20 µL和35 μL TGF-β1。TGF-β1作用至少24小时后，组织环即可进行后续操作。

4. 血管结构的组装与维持

1. 在制备最终的血管结构之前，需先制作一个专用容器以承载完成的血管。
   1. 对于小型血管，通过从一个50 mL聚碳酸酯锥形管顶部切下2英寸的段落来制作一个用于环状堆叠的高板，并将切口边缘用PDMS胶粘接到一个35 mm的培养皿底板上。使用锥形管的盖子作为该培养皿的盖子。
   2. 对于中型和大型血管的高环堆叠板，将直径为1.75英寸的聚碳酸酯管沿长度方向切割成2.5英寸长的段，作为高板的侧壁。高板底部则使用厚度为0.125英寸的聚碳酸酯板切割成直径2英寸的圆形片。使用丙烯酸溶剂胶将聚碳酸酯管段与圆形片粘合。使用60 mm培养皿的盖子作为高板的盖子。
   3. 3D打印直径分别为5 mm、10 mm和20 mm，长度为50 mm的柱状支撑杆。
   4. 向每个容器中加入10 mL未固化的硅胶。在PDMS完全固化前，将步骤4.1.3中制作的每根支撑杆居中放置于小型、中型和大型容器中。
   5. 在设定为60 °C的加热板上静置固化2–3小时。
   6. 使用70%乙醇与30%蒸馏水的混合溶液浸泡30分钟进行灭菌。
   7. 小心吸除各容器中的乙醇，随后在生物安全柜（BSC）中自然晾干。接着将容器在操作台内有序排列，每个培养皿与其盖子面对面朝上放置。在生物安全柜内用紫外光照射容器额外30分钟以进一步灭菌。自紫外照射后，所有操作均需采用无菌技术。
2. 使用极细的镊子，小心地将每个紧密卷曲的平滑肌水凝胶环从其支撑杆上取下，并转移至对应尺寸更大的、带有高支撑杆的容器中。
   1. 双手各持一把镊子，先抬起环的一侧脱离支撑杆，再抬起另一侧。操作时需小心保护并维持管腔结构。
   2. 采用这种双手操作法，先将环的一侧滑上高支撑杆，再滑入另一侧。通过轻柔、渐进的动作，沿环周方向缓慢将环推至支撑杆上。随后逐层堆叠组织环，直至达到所需血管长度，每个环可使最终结构增加约1–2 mm的长度。
3. 将堆叠好的环结构置于高3D打印支撑杆上后，旋转培养板使支撑杆与工作台面平行。
   1. 使用微量移液器，分别向小型、中型和大型血管的外表面轻柔地加入40 μL、80 μL和160 μL浓度为100 U/mL的凝血酶。在添加凝血酶的同时，缓慢旋转培养板以确保结构所有表面均被均匀覆盖。该步骤形成的凝块将作为构建初期固定环堆结构所用纤维蛋白胶的基础。
   2. 随后，使用微量移液器在快速旋转结构的同时，分别向小型、中型和大型结构中加入40 μL、80 μL和160 μL浓度为20 mg/mL的纤维蛋白原。凝血酶与纤维蛋白原混合后会迅速形成坚固的凝胶。由于固化时间较短，应尽快且均匀地施加纤维蛋白原。
4. 向每个承载结构的容器中加入20 mL分化培养基。将血管结构置于37 °C培养箱中备用。每3–5天更换一次培养基。

结果

此处展示的是三种不同尺寸的工程化血管移植物的制备过程（图1），表明环堆叠法（Ring Stacking Method, RSM）具有可扩展性。为验证其适用性，所选的三种不同血管尺寸分别对应人体实际血管尺寸：左前降支动脉（小尺寸；管腔直径 = 4 mm）¹⁷、降主动脉（中等尺寸；管腔直径 = 10 mm）和升主动脉（大尺寸；管腔直径 = 20 mm）¹⁸。小尺寸环的壁厚约为 500 µm，中等和大尺寸环的壁厚均约为 1,500 µm。所展示的每种血管均由6个环堆叠而成，因此小尺寸血管长度约为 6 mm，中等和大尺寸血管长度约为 9 mm。血管长度由每个单个环的壁厚决定。

组织学分析显示，所有环状结构的不同尺寸均表现出高细胞密度（图2）。红色物质为纤维蛋白凝胶。在小环中，环的外缘可见少量残留的纤...

讨论

环堆叠法相较于当前的血管组织工程构建技术具有多项优势。通过简单定制中心柱和外层壳的尺寸，即可利用环堆叠法构建任意尺寸的人体血管。本方法可实现完全不含聚合物的工程化血管的构建，仅由人体细胞和体内自然伤口愈合过程中存在的快速降解支撑材料组成。临床上已知聚合物移植物可导致再狭窄，若存在于工程化移植物中可能引发问题。不同尺寸的组织环所需的细胞接种数量需相应调整。细胞数量与接种表面积之间的关系如图5所示，可据此估算或外推接种细胞数。需注意，本研究中所用细胞类型为人主动脉平滑肌细胞。若将环堆叠法应用于其他细胞类型，需考虑细胞大小和增殖速率，并确定最佳接种密度。例如，我们已使用环堆叠法成功构建人成纤维细胞环，发现其所需细胞数量至少为平滑肌细胞的2倍。通过增加环的数量，可构建任意所需长度的血管。环堆叠结构已成功培养长达2个月并保持稳定。尽管中等和大型环分别在60 mm和100 mm培养皿中构建，但通过在100 mm培养皿中放置外层壳，两者均可维持适当的1,500 µm管壁厚度。这表明外层壳在控制和获得特定血管所需管壁厚度方面具有实用价值。在步骤3.3.1中加入TGF-β1，因其已知可刺激胶原蛋白生成

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人主动脉平滑肌细胞	ATCC	PCS-100-012	血管平滑肌细胞
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	适用于血管平滑肌细胞的培养基
人主动脉平滑肌细胞生长试剂盒	ATCC	PSC-100-042	维持血管平滑肌细胞活性的生长因子
Replicator Mini 3D 打印机	MakerBot	N/A	3D 打印机
聚乳酸 3D 耗材（PLA）	MakerBot	N/A	3D 打印机线材
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Ellworth Adhesives	3097358-1004	用于粘合培养板部件的聚合物
纤维蛋白原	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	纤维蛋白凝胶组分
凝血酶	Sigma Life Sciences	F3879-5G	纤维蛋白凝胶组分
转化生长因子-β1	PeproTech	100-21	刺激胶原蛋白生成的生长因子
血细胞计数板	Hausser Scientific Co.	3200	用于细胞计数
聚碳酸酯管	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	用于制作高型环叠式培养板的材料
聚碳酸酯板	Home Depot	409497	用于制作高型环叠式培养板的材料
粘合性聚合物溶剂	SCIGRIP	10799	用于制作高型环叠式培养板的材料
Instron 5940	Instron	N/A	拉伸测试仪
U-Stretch	Cell Scale	N/A	拉伸测试仪
平滑肌肌动蛋白	MA5-11547	Thermo Fisher	抗体
原肌球蛋白	MA5-11783	Thermo Fisher	抗体