可扩展的工程化血管将提升其临床应用价值。通过使用易于调节尺寸的3D打印导模，可形成血管平滑肌环并将其堆叠成管状结构，从而构建出血管移植物。通过简单更换3D打印导模的尺寸，即可调节移植物的大小，以满足人类冠状动脉各种尺寸范围的需求。
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摘要
摘要
冠状动脉疾病仍然是导致死亡的主要原因，影响着数百万美国人。由于自体血管移植物的可用性有限，工程化移植物为患者治疗提供了巨大潜力。然而，现有的工程化血管移植物通常难以实现规模化生产，需要制造定制的模具或聚合物管以适配不同尺寸，这一过程耗时且成本高昂。人类动脉的管腔直径约为2.0–38 mm，管壁厚度约为0.5–2.5 mm。我们开发了一种称为“环状堆叠法”的技术，通过使用中心柱导模控制管腔直径，并利用外层壳体设定血管壁厚度，从而制备出所需细胞类型的可变尺寸组织环，本文以血管平滑肌细胞（SMCs）为例进行了演示。随后将这些组织环逐层堆叠，形成管状结构，模拟天然血管的形态。通过简单调整堆叠环的数量，即可定制所需血管长度。利用该技术，可快速制造出多种尺寸和长度的管状组织，满足临床和个体患者的需要。
引言
在冠状动脉疾病（CAD）的治疗中，通常采用患者自身的血管作为旁路手术的移植材料。然而，许多病情较重的患者并无可用的健康血管供自身移植；即使存在合适的血管，取材部位也可能造成显著的额外损伤，并具有较高的感染风险。1 工程化血管移植物有望填补这一临床需求。为了满足不同患者对血管尺寸的广泛需求，血管工程的可扩展性至关重要。然而，目前的血管工程技术难以实现规模化扩展，通常需要重新制造复杂的模具或聚合物支架。大多数工程化移植物要么采用聚合物管状支架，并接种血管成纤维细胞、平滑肌细胞或内皮细胞；要么通过将细胞片卷绕在芯模上形成组织管状结构。目前处于临床试验阶段的两种工程化血管移植物均基于脱细胞化的聚合物-细胞外基质（ECM）平台。2,3,4 现有用于血管修复的聚合物移植物已知存在通畅性问题，若移植物中长期保留聚合物成分，可能在长期应用中引发严重问题。管状模具已被用于制造完全由细胞构成的血管5,6,7,8,
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方案
1. 细胞培养准备
- 使用 commercially 购买的血管平滑肌细胞。
- 将细胞培养于平滑肌细胞生长培养基中，该培养基由 88.6% 的 231 培养基、0.1% 的重组人胰岛素（rH-insulin）、重组人成纤维细胞生长因子（rH-FGF）、重组人表皮生长因子（rH-FGF）和抗坏血酸，以及 5% 的胎牛血清（FBS）、5% 的 L-谷氨酰胺和 1% 的抗生素/抗真菌剂组成。
注：每种生长因子、FBS 和 L-谷氨酰胺均购自血管培养基生长试剂盒。 - 每 48 小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到约 90%，并准备用于组织接种。
- 在更换培养基期间，将细胞置于培养箱中孵育以进行扩增。
2. 3D打印嵌件和定制硅胶模具板的制备
- 使用商用 3D 打印机（例如，Replicator Mini）打印培养皿插件。
- 使用开源 3D 设计软件（如 Blender）创建打印外层壳体和柱体的 3D 模型。
- 以 .stl 格式导出模型的驱动文件，以便导入 3D 打印机的软件中。
- 使用装入 3D 打印机的聚乳酸（PLA）丝材打印柱体和外壳。
- 打印完成后，将每个插件在 70%–100% 乙醇溶液中浸泡 30 分钟以进行灭菌。
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结果
此处展示的是三种不同尺寸的工程化血管移植物的制备过程（图1），表明环堆叠法（RSM）具有可扩展性。为验证其适用性，所选的三种不同血管尺寸分别对应人体实际血管尺寸：左前降支动脉（小尺寸；管腔直径 = 4 mm）17、降主动脉（中等尺寸；管腔直径 = 10 mm）和升主动脉（大尺寸；管腔直径 = 20 mm）18。小尺寸环的壁厚约为500 µm，中等和大尺寸环的壁厚均约为1,500 µm。所展示的每种血管均由6个环堆叠而成，对应小尺寸血管长度约为6 mm，中等和大尺寸血管长度约为9 mm。长度由每个单独环的壁厚决定。
组织学分析显示，所有尺寸的环状结构均表现出高细胞密度（图2）。红色物质为纤维蛋白凝胶。在小环中，环的外缘可见少量残留的纤维蛋白凝胶。在较大环状结构中，部分纤维蛋白凝胶与细胞成分相互.......
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讨论
环堆叠法相较于当前的血管组织工程构建技术具有多项优势。通过简单地定制柱体和外层壳的尺寸，即可采用环堆叠法（RSM）构建任意尺寸的人体血管。本方法可实现完全由人体细胞和体内自然伤口愈合过程中存在的快速降解支撑材料组成的无聚合物工程血管。临床上已知聚合物移植物可导致再狭窄，若将其用于工程化移植物中可能引发问题。不同尺寸的组织环需要调整细胞接种数量。细胞数量与接种表面积的关系如图5所示，可据此估算或外推接种细胞数。需注意，本研究中所用细胞为人类主动脉平滑肌细胞。若将环堆叠法应用于其他细胞类型，需考虑细胞大小和增殖速率，并确定最佳接种密度。例如，我们已利用环堆叠法成功构建人成纤维细胞环，发现其所需细胞数量至少为平滑肌细胞（SMCs）的两倍。通过增加环的数量，可构建任意所需长度的血管。环堆叠结构已成功培养长达2个月并保持稳定。尽管中等尺寸和大尺寸环分别在60 mm和100 mm培养皿中构建，但通过在100 mm培养皿中放置外层壳，两者均可维持适当的1,500 µm管壁厚度。这表明外层壳在控制和获得特定血管所需管壁厚度方面具有实用价值。在步骤3.3.1中加入TGF-β1，因其已知可刺激胶原蛋白生成
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
作者谨此感谢Lam实验室的同事Ammar Chishti和Bijal Patel在组织学和细胞培养方面提供的帮助。本研究由韦恩州立大学纳米医学博士后 fellowship（CBP）、启动资金以及心血管研究所种子基金（MTL）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人主动脉平滑肌细胞 | ATCC | PCS-100-012 | 血管平滑肌细胞 |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | 适用于血管平滑肌细胞的培养基 |
| 人主动脉平滑肌细胞生长试剂盒 | ATCC | PSC-100-042 | 维持血管平滑肌细胞活力的生长因子 |
| Replicator Mini 3D 打印机 | MakerBot | N/A | 3D 打印机 |
| 聚乳酸 3D 墨水（PLA） | MakerBot | N/A | 3D 打印机线材 |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | 用于粘合培养板部件的聚合物 |
| 纤维蛋白原 | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | 纤维蛋白凝胶组分 |
| 凝血酶 | Sigma Life Sciences | F3879-5G | 纤维蛋白凝胶组分 |
| 转化生长因子-β1 | PeproTech | 100-21 | 刺激胶原蛋白生成的生长因子 |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific Co. | 3200 | 用于细胞计数 |
| 聚碳酸酯管 | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | 用于制作高型环叠式培养板的材料 |
| 聚碳酸酯板 | Home Depot | 409497 | 用于制作高型环叠式培养板的材料 |
| 粘合性聚合物溶剂 | SCIGRIP | 10799 | 用于制作高型环叠式培养板的材料 |
| Instron 5940 | Instron | N/A | 拉伸测试仪 |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | 拉伸测试仪 |
| 平滑肌肌动蛋白 | MA5-11547 | Thermo Fisher | 抗体 |
| 原肌球蛋白 | MA5-11783 | Thermo Fisher | 抗体 |
参考文献
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dia....
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