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方法文章

使用3D打印导板和环堆叠法制备可缩放的工程化血管移植物

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DOI：

10.3791/55322

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2017年3月27日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Wayne State University, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University

本文内容

摘要

可扩展的工程化血管将提升其临床应用价值。通过使用易于调节尺寸的3D打印导模，可形成血管平滑肌环并将其堆叠成管状结构，从而构建出血管移植物。通过简单更换3D打印导模的尺寸，即可调节移植物的大小，以满足人类冠状动脉各种尺寸范围的需求。

摘要

冠状动脉疾病仍然是导致死亡的主要原因，影响着数百万美国人。由于自体血管移植物的可用性有限，工程化移植物为患者治疗提供了巨大潜力。然而，现有的工程化血管移植物通常难以实现规模化生产，需要制造定制的模具或聚合物管以适配不同尺寸，这一过程耗时且成本高昂。人类动脉的管腔直径约为2.0–38 mm，管壁厚度约为0.5–2.5 mm。我们开发了一种称为“环状堆叠法”的技术，通过使用中心柱导模控制管腔直径，并利用外层壳体设定血管壁厚度，从而制备出所需细胞类型的可变尺寸组织环，本文以血管平滑肌细胞（SMCs）为例进行了演示。随后将这些组织环逐层堆叠，形成管状结构，模拟天然血管的形态。通过简单调整堆叠环的数量，即可定制所需血管长度。利用该技术，可快速制造出多种尺寸和长度的管状组织，满足临床和个体患者的需要。

引言

在冠状动脉疾病（CAD）的治疗中，通常采用患者自身的血管作为旁路手术的移植材料。然而，许多病情较重的患者并无可用的健康血管供自身移植；即使存在合适的血管，取材部位也可能造成显著的额外损伤，并具有较高的感染风险。1 工程化血管移植物有望填补这一临床需求。为了满足不同患者对血管尺寸的广泛需求，血管工程的可扩展性至关重要。然而，目前的血管工程技术难以实现规模化扩展，通常需要重新制造复杂的模具或聚合物支架。大多数工程化移植物要么采用聚合物管状支架，并接种血管成纤维细胞、平滑肌细胞或内皮细胞；要么通过将细胞片卷绕在芯模上形成组织管状结构。目前处于临床试验阶段的两种工程化血管移植物均基于脱细胞化的聚合物-细胞外基质（ECM）平台。2,3,4 现有用于血管修复的聚合物移植物已知存在通畅性问题，若移植物中长期保留聚合物成分，可能在长期应用中引发严重问题。管状模具已被用于制造完全由细胞构成的血管5,6,7,8,9,10,11,12,13，但此类方法若需制备多种尺寸的血管，则必须额外设计并制造定制模具。

本文所述方法涵盖了一种利用可定制的3D打印插件和传统培养板来制备易于放大的工程化血管移植物的新技术。14 将细胞接种至含有中心柱体和外层壳体插件的培养板中。中心柱体用于控制管腔直径，并促使细胞单层自组装形成环状组织。外层壳体则控制环的厚度，从而决定最终血管的壁厚。完成的组织环随后被逐层堆叠，形成管状血管移植物。该方法被称为“"环状堆叠法"”，其优势在于，任何贴壁细胞类型均可接种于该培养体系中，且只需更换引导插件，即可按需生成任意尺寸的组织环或组织管。相比之下，组织工程中现有的环状组织制备技术仍难以实现规模化生产，15,16 每次改变目标尺寸均需重新制造模具。此外，采用本方法制备的血管移植物可在2至3周内完成，比其他工程化血管的制备时间快数周。6 在临床应用中，这一时间差异可能对病情恶化的患者治疗产生重要影响。

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方案

1. 细胞培养准备

  1. 使用 commercially 购买的血管平滑肌细胞。
  2. 将细胞培养于平滑肌细胞生长培养基中，该培养基由 88.6% 的 231 培养基、0.1% 的重组人胰岛素（rH-insulin）、重组人成纤维细胞生长因子（rH-FGF）、重组人表皮生长因子（rH-FGF）和抗坏血酸，以及 5% 的胎牛血清（FBS）、5% 的 L-谷氨酰胺和 1% 的抗生素/抗真菌剂组成。
    注：每种生长因子、FBS 和 L-谷氨酰胺均购自血管培养基生长试剂盒。
  3. 每 48 小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到约 90%，并准备用于组织接种。
  4. 在更换培养基期间，将细胞置于培养箱中孵育以进行扩增。

2. 3D打印嵌件和定制硅胶模具板的制备

  1. 使用商用 3D 打印机（例如，Replicator Mini）打印培养皿插件。
    1. 使用开源 3D 设计软件（如 Blender）创建打印外层壳体和柱体的 3D 模型。
    2. 以 .stl 格式导出模型的驱动文件，以便导入 3D 打印机的软件中。
    3. 使用装入 3D 打印机的聚乳酸（PLA）丝材打印柱体和外壳。
    4. 打印完成后，将每个插件在 70%–100% 乙醇溶液中浸泡 30 分钟以进行灭菌。
  2. 按 1:10 的比例配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅胶聚合物的固化剂与基础聚合物混合液，并在室温下静置脱气 10 分钟。
    1. 定义用作小型（35 mm）、中型（60 mm）和大型（100 mm）的培养皿尺寸。
    2. 分别向小型、中型和大型培养皿中加入 2 mL、4 mL 和 6 mL 未固化的硅胶，形成覆盖整个培养皿底部的薄层。
    3. 通过将 PDMS 倒入 100 mm 培养皿至 7 mm 高度来制作小型培养皿用柱体，并在 60 °C 的加热板上固化约 2–3 小时。然后使用 5 mm 活检打孔器打出圆柱形柱体。使用少量未固化的 PDMS 将每个 PDMS 圆柱体固定在小型培养皿的中心位置。
    4. 对于中型和大型培养皿，在培养皿底部的 PDMS 完全固化前，将直径分别为 10 mm 和 20 mm 的 3D 打印柱体居中放置于各自的培养皿中。对于大型培养皿，还需将一个直径约为 66.7 mm 的 3D 打印外层壳体放置在距柱体等距的位置。
      1. 将每个培养皿置于 60 °C 加热板上，在开放空气中固化约 2–3 小时，并预留 18 小时用于聚合物脱气。按照 图 1 所示，将打印部件固定在培养皿的正确区域和方向。
    5. 向所有培养皿内部加入 70% 乙醇与 30% 蒸馏水的混合溶液，浸泡 30 分钟以灭菌，然后盖上皿盖。
    6. 小心吸除每个培养皿中的乙醇，并使其自然风干。
    7. 在生物安全柜（BSC）内将每个培养皿与其皿盖正面朝上并列放置。将培养皿和皿盖在生物安全柜内暴露于紫外光下 30 分钟以完成灭菌。自紫外照射后，所有操作均需采用无菌技术进行。

3. 纤维蛋白水凝胶的制备、平滑肌细胞接种及培养板的维护

  1. 分别针对小、中、大尺寸的培养板，配制含有生长培养基和0.01% TGF-β1的纤维蛋白凝胶溶液，体积分别为0.5 mL、1.1 mL和1.81 mL。
    1. 从小、中、大培养板各自的培养基中，分别加入40 µL、88.4 µL和145 μL的凝血酶（储存浓度为100 U/mL）。用手轻轻晃动每个培养板，确保凝血酶在培养基中均匀混合。
    2. 随后，从小、中、大培养板各自的凝血酶-培养基混合液中，分别以滴加方式沿圆形路径加入160 µL、354 µL和580 μL的纤维蛋白原（储存浓度为20 mg/mL）。用手轻轻晃动，确保水凝胶充分混合并分布成均匀的一层。
    3. 在室温下使水凝胶固化10–15分钟。
  2. 用胰蛋白酶消化在150 mm细胞培养皿中扩增的平滑肌细胞，并按照标准操作进行离心。将所得细胞沉淀重悬于3 mL分化培养基中，该培养基由98% - 231培养基、1%胎牛血清（FBS）和1%抗生素/抗真菌剂组成。
    1. 使用2 mL移液器反复吹打细胞，充分混匀以打散任何细胞团块。用血细胞计数板计数细胞，并分别制备浓度为2 × 106 cells/mL、1.0 × 107 cells/mL和1.4 × 107 cells/mL的小、中、大培养板所需细胞悬液。
    2. 将每种细胞悬液各1 mL加入相应标记为小、中、大的50 mL锥形离心管中。如需制备更多组织环，每增加一个则按此方法额外设置一个50 mL锥形离心管。
    3. 向每个锥形离心管中加入分化培养基，使最终接种体积分别为2 mL、4 mL和5 mL，对应小、中、大血管环。然后，小心地将细胞悬液逐滴加至相应培养板中已制备好的水凝胶表面。
    4. 将培养板放入37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
  3. 每48–72小时为每个培养板更换一次分化培养基。对于大尺寸培养板，首次换液在24小时进行，之后每48–24小时更换一次，以补偿较高的细胞接种密度。
    1. 2–4天后，组织环会完全向中心支柱收缩。此时分别向小、中、大组织环中加入10 µL、20 µL和35 μL的TGF-β1。在TGF-β1作用至少24小时后，组织环即可进行后续操作。

4. 血管结构的组装与维持

  1. 在制备最终的血管结构之前，需先制作一个专用容器以承载完成的血管。
    1. 对于小尺寸血管，通过从一个50 mL聚碳酸酯圆锥形管顶部切下2英寸的段落，并将切口边缘用PDMS胶粘接到一个35 mm培养皿底板上，制成用于环状堆叠的高板。使用该圆锥形管的盖子作为培养皿的盖子。
    2. 对于中等和大尺寸血管的高环堆叠板，将直径为1.75英寸的聚碳酸酯管沿长度方向切割成2.5英寸长的段，作为高板的侧壁。高板底部使用厚度为0.125英寸的聚碳酸酯板材切割成直径2英寸的圆形片。使用丙烯酸溶剂胶将聚碳酸酯管段与圆形片粘合。使用60 mm培养皿的盖子作为高板的盖子。
    3. 3D打印直径分别为5 mm、10 mm和20 mm，长度为50 mm的柱状支撑杆。
    4. 向每个容器中加入10 mL未固化的硅胶。在PDMS完全固化前，将步骤4.1.3中制作的每根支撑杆居中放置于小、中、大容器中。
    5. 在设定为60 °C的加热板上静置固化2–3小时。
    6. 使用70%乙醇与30%蒸馏水的混合溶液浸泡30分钟进行灭菌。
    7. 小心吸除各容器中的乙醇，随后在生物安全柜（BSC）中自然晾干。接着将容器在操作台内有序排列，每个培养皿与其盖子面对面朝上放置。在生物安全柜内用紫外光照射容器额外30分钟以进一步灭菌。自紫外照射后，所有操作均需采用无菌技术。
  2. 使用极细的镊子，小心地将每个紧密卷曲的平滑肌水凝胶环从其支撑杆上取下，并转移至对应尺寸更大的、带有高支撑杆的容器中。
    1. 双手各持一把镊子，先抬起环的一侧脱离支撑杆，再抬起另一侧。操作过程中需小心保护并维持管腔结构。
    2. 采用双手操作法，先将环的一侧滑上高支撑杆，再滑入另一侧。通过轻柔、渐进的动作，沿环周方向缓慢将环向下推入高支撑杆上。随后逐层堆叠组织环，直至达到所需血管长度，每个环可使最终结构增加约1–2 mm的长度。
  3. 将堆叠好的环结构置于高3D打印支撑杆上后，旋转培养皿使支撑杆与工作台面平行。
    1. 使用微量移液器，分别向小、中、大血管的外表面轻柔地加入40、80和160 μL浓度为100 U/mL的凝血酶。在添加凝血酶的同时，缓慢旋转培养皿以确保结构所有表面均被均匀覆盖。该步骤形成的凝块将作为构建初期固定环堆结构所用纤维蛋白胶的基础。
    2. 随后，使用微量移液器在快速旋转结构的同时，分别向小、中、大结构中加入40、80和160 μL浓度为20 mg/mL的纤维蛋白原。凝血酶与纤维蛋白原混合后会迅速形成坚固的凝胶。由于固化时间较短，应尽快且均匀地施加纤维蛋白原。
  4. 向每个承载结构的容器中加入20 mL分化培养基。将血管结构置于37 °C培养箱中备用，每3–5天更换一次培养基。

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结果

此处展示的是三种不同尺寸的工程化血管移植物的制备过程（图1），表明环堆叠法（RSM）具有可扩展性。为验证其适用性，所选的三种不同血管尺寸分别对应人体实际血管尺寸：左前降支动脉（小尺寸；管腔直径 = 4 mm）17、降主动脉（中等尺寸；管腔直径 = 10 mm）和升主动脉（大尺寸；管腔直径 = 20 mm）18。小尺寸环的壁厚约为500 µm，中等和大尺寸环的壁厚均约为1,500 µm。所展示的每种血管均由6个环堆叠而成，对应小尺寸血管长度约为6 mm，中等和大尺寸血管长度约为9 mm。长度由每个单独环的壁厚决定。

组织学分析显示，所有尺寸的环状结构均表现出高细胞密度（图2）。红色物质为纤维蛋白凝胶。在小环中，环的外缘可见少量残留的纤维蛋白凝胶。在较大环状结构中，部分纤维蛋白凝胶与细胞成分相互...

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讨论

环堆叠法相较于当前的血管组织工程构建技术具有多项优势。通过简单地定制柱体和外层壳的尺寸，即可采用环堆叠法（RSM）构建任意尺寸的人体血管。本方法可实现完全由人体细胞和体内自然伤口愈合过程中存在的快速降解支撑材料组成的无聚合物工程血管。临床上已知聚合物移植物可导致再狭窄，若将其用于工程化移植物中可能引发问题。不同尺寸的组织环需要调整细胞接种数量。细胞数量与接种表面积的关系如图5所示，可据此估算或外推接种细胞数。需注意，本研究中所用细胞为人类主动脉平滑肌细胞。若将环堆叠法应用于其他细胞类型，需考虑细胞大小和增殖速率，并确定最佳接种密度。例如，我们已利用环堆叠法成功构建人成纤维细胞环，发现其所需细胞数量至少为平滑肌细胞（SMCs）的两倍。通过增加环的数量，可构建任意所需长度的血管。环堆叠结构已成功培养长达2个月并保持稳定。尽管中等尺寸和大尺寸环分别在60 mm和100 mm培养皿中构建，但通过在100 mm培养皿中放置外层壳，两者均可维持适当的1,500 µm管壁厚度。这表明外层壳在控制和获得特定血管所需管壁厚度方面具有实用价值。在步骤3.3.1中加入TGF-β1，因其已知可刺激胶原蛋白生成

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

作者谨此感谢Lam实验室的同事Ammar Chishti和Bijal Patel在组织学和细胞培养方面提供的帮助。本研究由韦恩州立大学纳米医学博士后 fellowship（CBP）、启动资金以及心血管研究所种子基金（MTL）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人主动脉平滑肌细胞 ATCCPCS-100-012血管平滑肌细胞
Medium 231Gibco (Life Technologies M-231-500适用于血管平滑肌细胞的培养基
人主动脉平滑肌细胞生长试剂盒 ATCCPSC-100-042维持血管平滑肌细胞活力的生长因子
Replicator Mini 3D 打印机 MakerBot N/A3D 打印机
聚乳酸 3D 墨水（PLA）MakerBot N/A3D 打印机线材
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Ellworth Adhesives 3097358-1004用于粘合培养板部件的聚合物
纤维蛋白原Hyclone Labratories, Inc.SH30256.01纤维蛋白凝胶组分
凝血酶 Sigma Life SciencesF3879-5G纤维蛋白凝胶组分
转化生长因子-β1 PeproTech100-21刺激胶原蛋白生成的生长因子
血细胞计数板 Hausser Scientific Co.3200用于细胞计数
聚碳酸酯管 US Plastics PCTUB1.750X1.625用于制作高型环叠式培养板的材料
聚碳酸酯板 Home Depot409497用于制作高型环叠式培养板的材料
粘合性聚合物溶剂 SCIGRIP10799用于制作高型环叠式培养板的材料
Instron 5940InstronN/A拉伸测试仪
U-StretchCell ScaleN/A拉伸测试仪
平滑肌肌动蛋白 MA5-11547Thermo Fisher抗体
原肌球蛋白MA5-11783Thermo Fisher抗体

参考文献

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