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方法文章

活性氧在细胞内定位的评估 塞内加尔鳎 精子细胞

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DOI：

10.3791/55323

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2018年3月11日

 , 
1Department of Molecular Biology, University of León, 2INDEGSAL, University of León, 3Planta de Cultivos el Bocal, Spanish Institute of Oceanography (IEO)

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种利用对活性氧敏感的荧光染料DCFH-DA检测塞内加尔鳎（Solea senegalensis）精子中H2O2定位的方法，同时分别使用活体线粒体染料标记线粒体，DAPI标记细胞核以实现核的可视化。该方案设计为可在2小时内完成，适用于新鲜或解冻后的精子样本。

摘要

氧化应激是导致精子质量下降的重要因素之一。在任何物种中，建立高效检测精子中活性氧（ROS）的实验方案都具有重要意义，但这些方法在鱼类中很少被应用，尤其是在硬骨鱼类中更为罕见。冷冻保存技术在水产养殖中具有多种用途，包括基因库建立以及全年保障精子供应。然而，冻融过程可能引发活性氧的产生，从而对精子细胞造成损伤。鉴于活性氧过量产生可能因其在细胞内的定位不同而对精子造成潜在损伤，本文提供了一种详细的实验方法，用于检测H2O2并利用共聚焦显微镜评估其在细胞内的定位。为此，采用三种荧光染料联合染色：2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、活体线粒体染料以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），以评估H2O2在塞内加尔鳎（Solea senegalesis）精子样本中与细胞核或线粒体的共定位情况。

引言

近期研究表明，活性氧的产生与精子质量相关1。尽管线粒体中活性氧的生成可被视为一种正常的生理过程，但过量活性氧所导致的氧化应激则会从多个层面明确造成精子细胞的损伤。在人类中，氧化应激与男性不育相关，可影响精子的运动能力及其发生获能的能力2；在哺乳动物中，冻存精子样本中DNA完整性的改变也已被证实与H2O2的合成有关3。

低温保存是水产养殖中用于基因库保存的常用技术。该技术在存在繁殖问题的物种中尤为重要，例如Solea senegalensis。这一在市场上具有重要价值的物种，由于缺乏求偶行为，导致人工养殖出生的个体出现生殖功能障碍。这一情况使得精子低温保存成为实现人工授精所需精子供应的必要手段。然而，低温保存过程可能引发氧化应激，对精子造成不利影响4，已有研究报道添加抗氧化剂具有积极效果。据报道，通过线粒体靶向抗氧化剂抑制活性氧（ROS）对黄颡鱼的精子低温保存具有益处5。

因此，了解精子样本中活性氧（ROS）的水平非常重要，尤其是在冷冻保存后6,7，因为这些分子已被认为会影响精子存活率和生育能力8。此外，研究ROS在细胞内的分布对于推断潜在损伤程度至关重要。例如，线粒体中低水平的ROS可被视为正常，并与精子功能相容；而细胞核内高水平的ROS则可能提示精子DNA受损。H2O2 是一种重要的活性氧，可由线粒体释放并穿透进入细胞核，因其分子小且不带电荷9。二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）可特异性地检测细胞内过氧化物，并发出绿色荧光。本文介绍了利用共聚焦显微镜检测塞内加尔鳎（Solea senegalensis）精子细胞内H2O2定位的详细实验方案。

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方案

注意：荧光染料孵育和共聚焦分析至少需要2-3小时，适用于对照样本和处理样本。此时间估算不包括数据处理。所需材料见材料表。本方案适用于新鲜或冷冻保存的精子。Solea senegalensis 是一种在低温水中产卵的鱼类，操作时应始终在低温条件下（4-7 °C）进行。有关本方案的总体流程，请参见图1。

1. 实验前的准备工作

  1. 用分析纯DMSO配制1 mM线粒体染料储备液。
  2. 用去离子水配制1 μg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）储备液。
  3. 配制200 mOsm/kg的任氏液（116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPES，pH 7.7）。
  4. 用分析纯甲醇配制4 mM 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）储备液。
    注意：将储备液分装后于-20 °C保存，直至使用。
  5. 将微量离心机温度设置为4–7 °C。

2. 荧光染料孵育前的样本准备

注意：在移液和重悬精子时，应轻柔操作。

  1. 若使用冻存细胞，将水浴锅预热至 40 °C，用于解冻塞内加鳎（Solea senegalensis）精子10。将麦管样品浸入水浴中 7 秒。
  2. 用剪刀剪开麦管，将样品转移至微量离心管中，在 4–7 °C 条件下以 1000 × g 离心 1 分钟。
  3. 使用移液器去除冻存样品中的精浆或含冷冻保护剂的精浆，弃去可能干扰染色程序的任何组分。
  4. 用 50–100 μL 的 4 °C、200 mOsm/kg Ringer 溶液重悬细胞。
  5. 在体视显微镜下使用血细胞计数板（如 Neubauer 计数板）测定精子浓度。
  6. 用 4 °C Ringer 溶液将细胞悬液稀释至终体积 0.5 mL，终浓度为 1–2 × 106 个细胞/mL。

3. 荧光染料孵育

注意：荧光染料必须在低光照条件下操作，尤其是在溶液中时。

  1. 向工作样品稀释液中加入 3.125 μL DCFH-DA 储存液（样品中终浓度：25 μM）。在 4–7 °C 条件下避光孵育 40 分钟10。
  2. 30 分钟后，向样品中加入 0.5 μL DAPI 储存液（样品中终浓度：2 μM）和 0.5 μL 线粒体染料储存液（样品中终浓度：100 nM）。两种荧光染料均避光孵育 10 分钟。

4. 共聚焦显微镜样品制备

  1. 孵育结束后，将细胞悬液在 1000 x g、4–7 °C 条件下离心 1 分钟。
  2. 用移液器小心弃去上清液。
  3. 加入 10–20 μL 的 200 mOsm/kg Ringer 溶液。
  4. 取 5 μL 浓缩的细胞悬液滴加到载玻片上。
  5. 小心地将盖玻片覆盖在样品上，并用封片剂密封。待封片剂干燥后，样品即可用于共聚焦显微镜观察。

5. 实验前的共聚焦显微镜设置

注意：根据显微镜的不同，DCFH-DA 可能会被"灼烧"。请先使用非重要样品确定最佳条件。

  1. 打开显微镜、激光器、相机以及运行显微镜的计算机。
  2. 根据每种荧光染料的激发和发射最大值设置激发激光：
    1. 对于 DAPI，使用 358 nm 的激发最大值和 465 nm 的发射最大值。
    2. 对于线粒体染料，使用 644 nm 的激发最大值和 662 nm 的发射最大值。
    3. 对于 DCFH-DA，使用 504 nm 的激发最大值和 525 nm 的发射最大值。
  3. 首先使用 25X 物镜对精子进行聚焦。选择 DAPI 通道进行聚焦，因为该荧光染料信号强度最高。待细胞清晰聚焦后，改用 63X 或 100X 物镜进行详细观察，因为 Solea senegalensis 精子的大小约为 2 μm。
  4. 针对每个通道，优化针孔、增益和电压。同时，调节数字偏移以降低背景信号。在完成所用荧光染料各项参数的优化后，保存设置。在常规实验中，对单个 Solea senegalensis 精子细胞的检测，我们采用以下参数（这些参数在不同实验中可能有所调整）：针孔设为 1，增益电压设为 750 V。

6. 图像采集

  1. 选择图像采集所需的成像质量条件。定义采集参数，如位深度、图像格式、光片厚度，并选择单侧照明。对于单个塞内加尔鳎（Solea senegalensis）精子的常规实验，我们采用以下参数（这些参数在每次实验中可能有所调整）：帧尺寸为1024像素；每像素位数为16位；扫描速度为2-4。
  2. 打开扫描区域并将其居中，开始并对视野进行成像。
  3. 使用裁剪工具选择感兴趣区域，然后点击“live”（实时）按钮。
  4. 借助范围指示器工具，调节数字偏移以降低背景信号。对每个通道均执行此操作，然后进行成像。
  5. 检查每种荧光染料的各个通道及其组合的成像质量。

7. 创建三维图像视频

  1. Z轴堆栈采集设置。
    1. 在软件中选择Z轴堆栈选项。
    2. 选择单个细胞、细胞群或感兴趣区域，并进行对焦。
    3. 使用“第一层面”和“最后层面”选项界定Z轴堆栈范围，并借助微调焦功能将Z轴步进间隔设为0.2 µm。建议选择DAPI通道进行对焦，因为该荧光染料信号强度通常最高，便于完整识别精子头部。为每个通道选择最佳采集参数后开始实验。
  2. 运行Z轴堆栈实验。分离各通道，观察每种信号在细胞内的定位情况。
  3. Z轴堆栈处理。
    1. 三维体积渲染：实验完成后，选择Z轴堆栈处理软件的相关选项，启用体积渲染功能。设定步数和旋转角度（360°），并以视频格式保存文件。
    2. 立体红青图：在处理窗口中选择立体红青图选项。该工具可用于生成包含分通道信息的三维图像视频。

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结果

共聚焦显微镜是评估硬骨鱼类精子细胞内活性氧（ROS）的理想方法。本研究中采用的三种荧光染料（DAPI、线粒体染料和DCFH-DA）组合（图1）可提供大量有用信息，既可用于基础研究，也可应用于改进工业水产养殖场中的操作流程，例如精子冷冻保存方案。通过该方法可开展多种类型的分析，以关联细胞内ROS的存在与其他参数之间的关系，如精子活力、存活率、优良与劣质繁殖个体之间的差异、运动激活情况或季节性精子变化等。本研究展示了精子细胞内H2O2分布的两种不同模式：集中于线粒体或扩散至细胞核（图2、图3）。那些由ROS引起的潜在损伤较低的精子仅在线粒体中显示DCFH-DA荧光标记，而存在DNA损伤的精子则在细胞核中也出现DCFH-DA标记。共聚焦显微镜软件可生成有用的视频，并提供简便快速的共定位分析图谱。

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讨论

众所周知，线粒体是精子运动能力和功能的关键细胞器。这些细胞器同时也直接参与活性氧（ROS）的生成。有趣的是，精子正常功能的维持需要受控水平的活性氧1。在哺乳动物中已观察到生育力与氧化应激之间存在正相关关系11，但过量的活性氧会损害精子质量12。一个可能决定活性氧产生有益或有害作用的关键因素，不仅在于其总体水平，还在于其在细胞内的定位。活性氧的有害效应之一是导致DNA损伤9，因此细胞核中活性氧的存在可能提示核内潜在的损伤，而线粒体中的活性氧水平仍可能处于正常范围。因此，有必要在现有定量方法（例如，流式细胞术）的基础上，补充共聚焦显微镜等能够提供活性氧细胞内定位信息的技术。

共聚焦显微镜是观察细胞内活性氧定位的理想方法。使用特定荧光染料，如活细胞线粒体染料和DAPI，可分别显示线粒体和细胞核，将这些分子与DCFH-DA结合使用，可实现过氧化物在细胞内的定位观察。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢AQUAGAMETE FA 1205 COST行动项目的支持。本研究由AGL201568330-C2-1-R项目（MINECO/FEDER）提供资金支持。David G. Valcarce获得卡斯蒂利亚-莱昂自治区政府（EDU1084/2012）和欧洲社会基金的资助。作者感谢Ana Riaza博士和Stolt Sea Farm S.A.、 Paulino de Paz博士、Ignacio Martínez Montero博士以及 José Ramón Guiérrez。我们还感谢 Paula Fernández Colado在视频拍摄方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA） Sigma-AldrichD6883
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） Sigma-AldrichD9542
CaCl2Sigma-AldrichC1016 
共聚焦显微镜ZeissLSM800
盖玻片Thermo Fisher Scientific12-541B
DMSO，分析纯Sigma-AldrichW387520
HEPESSigma-AldrichH3375
KClSigma-AldrichP9541
甲醇，分析纯Sigma-Aldrich34860
MitoTracker Deep Red Thermo Fisher ScientificM22426
微量离心机（带制冷）Thermo Fisher Scientific75002441
NaClSigma-AldrichS7653 
血细胞计数板（Neubauer chamber）Sigma-AldrichBR717810
载玻片Thermo Fisher Scientific10143562BEF

参考文献

  1. Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
  2. Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
  3. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
  4. Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).
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  6. Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
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  9. Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
  10. Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
  11. Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
  12. Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).

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