一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

摘要

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。

摘要

在蛋白质生物治疗药物中分析低含量（1-100 ppm）的蛋白质杂质（例如，宿主细胞蛋白（HCPs））是一项具有挑战性的检测，需要高灵敏度和宽动态范围。基于质谱的蛋白质定量检测通常包括蛋白质消化，随后使用低分辨率（Rs ~1,000）串联四极杆质谱仪对肽段进行选择反应监测/多反应监测（SRM/MRM）定量。该方法的一个局限性是，当目标肽段的前体离子和碎片离子质量（以m/z值表示）与样品中其他共洗脱肽段的质量“相同”（在1 Da窗口内）时，会出现干扰现象。为避免这一问题，我们提出一种替代性的质谱方法——高选择性（HS）MRM检测，该方法结合了肽段前体离子的离子淌度分离与肽段碎片的高分辨率（Rs ~30,000）质谱检测。我们探索了该方法在单克隆抗体（mAb）消化产物中 spiked 低丰度肽段标准品的定量能力，并证明其灵敏度和动态范围（至少3个数量级）可达到HCP分析中的典型水平。在高丰度肽段背景（进样量为2 µg mAb消化产物）存在下，所有六种肽段标准品在低至0.1 nM浓度（进样至内径2.1 mm色谱柱的量为1飞摩尔）时均被检测到。考虑到 spiked 肽段来源的兔磷酸化酶分子量（97.2 kDa），该检测方法的定量限（LOQ）低于50 ppm。在整个研究考察的浓度范围（0.1-100 nM 或 1-1,000 ppm）内，峰面积的相对标准偏差（RSD）（n = 4次重复）均小于15%。

引言

在工业环境中，大分子生物物质（蛋白质）的定量目前主要依赖免疫分析法（例如，ELISA），这主要归因于其多项优势：高灵敏度、高通量、操作简便以及单位样品成本较低。当用于分析蛋白质治疗药物中存在的低丰度蛋白质杂质（宿主细胞蛋白（HCPs）含量为1-100 ppm）时，这些生物学检测方法通常仅能提供总的HCP浓度（通常以ppm或ng HCP/mg单克隆抗体表示），而无法识别和定量各个单独的HCP污染物。近年来已开发出多种基于质谱（MS）的检测方法，以补充ELISA或提供ELISA无法获得的信息^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。由于样品复杂性以及需要在宽动态范围（至少跨越3个数量级）内检测HCP肽段，传统上通常采用多维色谱方法并结合广泛的样品分级，以帮助鉴定低丰度的HCPs^{1,2,3,4,5,6,7}。

在宿主细胞蛋白（HCP）鉴定与验证之后，一个自然的后续步骤是对多批次生物制药产品中的HCP进行追踪（监测）。在此背景下，已有研究提出采用一维液相色谱-质谱（LC/MS）方法以提高样品通量^8,9。然而，在一维LC/MS检测中，由于生物制药肽段的大量存在，可能会影响HCP检测的准确性和动态范围。与多维分离相比，单维色谱分离中肽段前体共洗脱的概率更高，因而导致信号干扰的潜在风险增加^19,20,21,22。若能在不延长色谱分离时间的前提下引入正交分离手段以分离肽段前体，则将具有明显优势。行波离子淌度（Travelling wave ion mobility, TWIM）¹⁰ 能够在毫秒级时间内解析复杂的质谱图谱。假设单个肽段的色谱峰宽为10秒，且离子淌度分离在仪器上的运行时间为20毫秒，则在单个肽段洗脱期间可完成约500次淌度分离。

过去十年中，基于串联质谱仪上实现的、已被广泛接受的选择反应监测（或多反应监测）方法（SRM/MRM法），已成功开发出用于蛋白质定量的质谱分析技术。^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}该低分辨率质谱检测方法的局限性之一是存在干扰现象^19,20,21,22 当目标肽具有以下特征时可观察到 "相同" 前体离子和碎片离子质量与其他在样品中同时洗脱的肽段（在1 Da窗口范围内）相同。提高SRM/MRM方法准确性的途径有两种：一种是增加前体水平的额外分离步骤，以去除干扰的前体离子；另一种是提高质谱对前体离子或碎片离子检测的分辨率，以避免质谱信号重叠。本文所述的高选择性（HS）MRM采集模式结合了这两种策略，即通过肽段前体的离子淌度分离与肽段碎片的高分辨率（Rs ~30,000）质谱检测相结合。本实验方法的检测范围至少跨越三个数量级，这在SRM/MRM蛋白质组学实验中属于典型的动态范围^17,18,24.

通过在单克隆抗体酶切产物中加入六种肽标准品（浓度范围为0.1至100 nM），监测其信号的线性关系，验证了HS-MRM检测法在宿主细胞蛋白定量中的实用性。

方案

1. 英夫利昔单抗消化物的制备（约24小时操作）

1. 配制新鲜的50 mM碳酸氢铵、50 mM NH₄HCO₃中含1%阴离子表面活性剂、50 mM NH₄HCO₃中含500 mM二硫苏糖醇（DTT）以及50 mM NH₄HCO₃中含500 mM碘乙酰胺（IAM）的溶液。
2. 向750 µL的50 mM NH₄HCO₃溶液中加入200 µL英夫利昔单抗mAb（10 mg/mL）和50 µL 1%阴离子表面活性剂溶液，在60 °C下变性蛋白质15分钟，反应体系中阴离子表面活性剂终浓度为0.05%。
3. 加入40 µL的500 mM DTT，在60 °C下还原样品60分钟，反应体系中DTT终浓度为20 mM。
4. 加入20 µL的500 mM IAM，在避光条件下室温烷基化30分钟，反应体系中IAM终浓度约为10 mM。
5. 将微量离心管中的内容物转移至含有20 µg质谱级Lys C/胰蛋白酶的玻璃小瓶中，在37 °C下消化样品3小时。
6. 将已部分消化的样品转移至另一含有20 µg质谱级Lys C/胰蛋白酶的玻璃小瓶中，加入第二份酶量（20 µg），在37 °C下继续过夜消化（12–15小时）。
7. 过夜蛋白酶解反应结束后，加入5 µL 100%甲酸（FA），在37 °C下孵育30分钟，以分解酸不稳定的阴离子表面活性剂。
8. 将消化液在离心机中以4,000 × g离心15分钟，使阴离子表面活性剂的不溶性组分沉淀。
9. 回收约1,000 µL的英夫利昔单抗消化产物，转移至液相色谱自动进样瓶中；消化产物浓度应约为2 mg/mL。将消化产物于-20 °C冰箱中保存，直至LC/MS系统准备就绪进行分析。

2. 肽段标准品的加标（约30分钟）

1. 将装有冷冻样品的玻璃小瓶置于室温下，解冻英夫利昔单抗酶解产物。
2. 向一个含有兔磷酸化酶b（PHO）酶解产物的小瓶中加入1 mL含0.1%甲酸的水溶液（H₂O），以配制小瓶中所含六种肽标准品的1-µM储备液（每种肽含量为1 nmol）。
3. 使用0.1%甲酸作为稀释溶剂，对PHO储备液进行4次1 mL系列稀释，得到浓度分别为0.1、1、10和100 nM的肽溶液。所有稀释液均需在玻璃小瓶（液相色谱自动进样瓶）中配制，并向每个小瓶中加入100 µL英夫利昔单抗酶解产物作为背景基质。每次进样10 µL，柱上加载2 µg酶解产物背景。另准备一份空白样品，其中仅含稀释后的英夫利昔单抗酶解产物（相同1:10稀释），不添加任何目标肽段。

3. LC/HDMS ^E 数据采集方法的设置

注意：建立 HS-MRM 检测所需步骤的工作流程如图 1 所示，并在第 3-6 节中详细描述。需要采集一份数据非依赖型 HDMS^E 数据集，以确定每个被监测肽段的保留时间、电喷雾离子化后最丰富肽离子的母离子 m/z 值，以及通过离子淌度分离获得的相应 CCS（碰撞截面）。 此外，该数据非依赖型数据集还提供了每个肽段前体离子三个最丰富碎片离子的 m/z 值信息。在工作流程的第二步（碰撞能量优化）中，通过调节碰撞池能量以使每个碎片离子的信号强度达到最高，从而提高检测的灵敏度。最后，在最终步骤中，上述所有参数将被导入 HS-MRM 方法编辑器中，用于每个被监测的肽段。

1. 使用配备超高效液相色谱系统的四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪，采用数据非依赖性采集方法（HDMS^E）进行液相色谱-质谱（LC/MS）实验。
   注：有关仪器配置的更多细节见材料部分。该仪器使用行波离子淌度装置对肽段前体进行分离¹⁰。
2. 配制两种流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A相）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B相）。
   注：使用带电表面杂化（CSH）C18色谱柱（2.1 × 150 mm，填充1.7-µm颗粒）对添加的单克隆抗体（mAb）酶解产物进行分离。
3. 在数据采集软件中，点击"创建/分析方法"，选择"生成采集和处理方法"。输入方法名称，浏览至方法文件夹（目录），然后点击"下一步"。
4. 在"分析类型"中选择"肽图分析（IMS）"，在"仪器系统"选项卡中选择"四元溶剂管理器"仪器。编辑梯度设置，以200 µL/min的流速实现肽段分离。采用梯度洗脱程序：30分钟内B相从1%升至40%，随后2分钟清洗色谱柱，再用9分钟重新平衡，总运行时间为50分钟。将这些实验参数输入液相色谱方法编辑器中。
5. 在"仪器系统"选项卡中选择"样品管理器"仪器。设置样品温度为10 °C，色谱柱温度为60 °C。
6. 将QTOF质谱仪设置为正离子电喷雾电离（ESI）高灵敏度模式，典型分辨率可达30,000 FWHM。
   注：LC/HDMS^E是一种数据非依赖性采集（DIA）模式，通过在低能量（6 V，用于MS通道1扫描）和高能量（15–40 V梯度，用于在MS通道2中产生无前体选择的碎片谱图）之间快速切换碰撞池中的碰撞能量来连续采集数据。
   1. 在数据采集软件中输入默认的与离子源相关的质谱参数：从"我的工作/仪器系统"中选择"Vion IMS Qtof"选项卡，在"工具"菜单中输入以下参数：毛细管电压3.0 kV，源温度100 °C，源偏移电压100 V，锥孔气流速50 L/h，锥孔电压40 V。设置去溶剂化温度为250 °C，去溶剂化气流速为500 L/h，参考毛细管电压为3.0 kV。
   2. 在数据采集软件中点击"创建/分析方法"，选择"生成采集和处理方法"。输入方法名称，浏览至方法文件夹（目录），然后点击"下一步"。
   3. 在"分析类型"中选择"肽图分析（IMS）"，在"仪器系统"选项卡中选择"Vion IMS QTof"仪器。点击"完成"。
      注：新创建的LC/HDMS^E 方法将自动在"仪器方法配置"界面中打开。
   4. 在"设置"选项卡中输入以下参数：毛细管电压3.0 kV，源温度100 °C，去溶剂化温度250 °C，锥孔气流速50 L/h，去溶剂化气流速500 L/h。
   5. 在"实验"选项卡设置中选择"高分辨率MS^E"，并选择"分析方法运行时间"。在"扫描设置"选项卡中输入以下参数：低质量数100，高质量数2,000，扫描时间400 ms。在"碰撞能量（CE）"选项卡中输入低能量为"6 V"，高能量设置为15至40 V的梯度。确保勾选"禁用数据压缩"。
   6. 在数据采集过程中，以10 µL/min的流速注入50 ng/mL的亮氨酸脑啡肽（LE）溶液（溶于含0.1%甲酸的50%乙腈中），用于锁质量校准。
      注：锁质量数据每隔5分钟采集一次，使用相同的采集速率和相同的质量范围。
7. 采用上述LC/HDMS^E分析方法，对10 nM PHO添加样品进行分析，进样量为10 µL（每种肽段标准品上柱量为100 fmol）。

4. 用于碰撞能量（CE）优化的飞行时间-多反应监测（Tof-MRM）方法的建立

1. 从 LC/HDMS^E 数据集中获取每种 PHO 肽的保留时间、前体离子和碎片离子的 m/z 值。保留最丰富的前体离子的 m/z 值及其电荷态，以及对应的三个最丰富的碎片离子信息。
   注：图 2 展示了 LC/HDMS^E 检测通常记录的低能量和高能量质谱图示例。
2. 在 SRM/MRM 实验中使用碰撞能量（CE）优化，以获得每种肽的最佳信号强度²³。
   1. 在数据采集软件中，点击 "创建/分析方法"，选择 "生成采集和处理方法"。输入方法名称，浏览至方法文件夹（目录），然后点击 "下一步"。
   2. 在 "分析类型"中，选择 "定量分析"。选择 "Quantify Assay Tof 2D 色谱"，然后点击 "下一步"。在 "仪器系统"选项卡中，选择 "Vion IMS QTof"，然后点击 "完成"。
      注：新创建的 Tof-MRM 方法将自动在 "仪器方法配置"界面中打开。
   3. 在 "设置"选项卡中，输入以下参数：毛细管电压 3.0 kV，源温度 100 °C，去溶剂化温度 250 °C，锥孔气体流速 50 L/h，去溶剂化气体流速 500 L/h。
   4. 在 "实验"选项卡设置中，选择 "功能表"，并选择 "一个或多个 MS、MSMS 或 MRM 功能"。使用下拉箭头，为每种肽设置一个 "Tof-MRM"功能，输入三个 "跃迁"（即最丰富的前体离子与其三个最丰富的碎片离子的组合）。
      注：在 Tof-MRM 模式下，采用时间窗 MRM 方法可实现最高的灵敏度。
   5. 在 "Tof-MRM"功能编辑器中，为每种肽选择一个保留时间窗口（至少 1 分钟长），并根据肽的洗脱顺序进行排列。在 "Tof-MRM"功能编辑器中，输入肽前体离子的 m/z 值和产物离子的 m/z 值；将四极杆隔离窗口设置为 "低"（4-Da 窗口）用于肽前体离子；选择固定的扫描时间为 100 ms；并在 14–36 V 范围内选择十二个不同的碰撞能量值，分别为：14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34 和 36，如图 3 示例所示。
      ​注：使用上述 Tof-MRM 方法，每个跃迁在每个指定的 CE 条件下，色谱峰上至少采集到 10 个数据点。为减小数据文件大小，可为碎片离子信号选择 "宽"选项（6-Da 窗口）。CE 优化值的示例如表 2 所示。
   6. 使用上述 Tof-MRM 检测方法分析 10 nM 的 PHO 加标样品，进样量为 10 µL（每种肽标准品上柱量为 100 fmol）。

5. 使用离子淌度分离肽前体进行肽定量的最终HS-MRM检测方法的建立

1. 在 "研究" 数据采集软件菜单中，显示每次毛细管电泳每种肽段生成的全部11条色谱图谱，并使用软件对峰进行积分 "整合" 按钮从 "处理选项/操作" 工具栏；最高峰面积将指示每个跃迁的最佳碰撞能量。
2. 目视比较每种肽段三个片段的最佳峰面积，并仅保留最佳者 "转变" （产生最强信号的碎片离子）；表2列出了最佳结果 "转换" 来自四种PHO肽
3. 建立一个HS-MRM方法，每个肽段仅包含一个碎片离子。使用来自LC/HDMS的各肽段前体的CCS值^E 数据集
   1. 在上一节（第4节）创建的Tof-MRM方法基础上，将“Tof-MRM”功能更改为选择“HS-MRM”功能。
   2. 在“HS-MRM”功能编辑器中，输入以下前体离子相关参数：m/z、四极杆分辨率：低（4 Da）、电荷态、前体离子碰撞截面（CCS）值以及前体离子CCS分辨率：低。对于产物离子，输入其m/z、最佳碰撞能量，选择0.4 s的扫描时间，并选择“宽”谱图设置（6 Da），以包含其所有同位素。图4展示了针对全部四种肽段的最终HS-MRM采集方法示例。
4. 使用HS-MRM方法分析所有样品，首先分析mAb消化空白样品（未加标样品），随后依次进行以下浓度PHO肽段的4次重复进样（每次10 µL）：0.1、1、10和100 nM。

6. 创建用于分析 HS-MRM 数据集的处理方法

1. 创建一种用于分析HS-MRM数据集的处理方法。
   1. 为分析方法创建的 "HS-MRM" 数据采集方法，单击 "目的" 标签并选择 "管理组件"
   2. 从下拉菜单中 "实验类型," 选择 "HS MS/MS / HS-MRM" 选项
   3. 点击 "创建/新条目" 并在处理方法编辑器中引入以下参数：肽段保留时间（RT）、前体离子电荷态、前体离子m/z值以及前体离子漂移时间（DT）。对于碎片离子，输入其m/z值和电荷态，并指定 "XIC" 以痕量提取模式进行提取。
   4. 在 "目的" 相同标签页 "HS-MRM" 采集方法，点击 "默认用量" 并输入以下浓度：0.1、1、10 和 100 nM PHO 肽。
   5. 输入以下参数 "处理/提取设置"：默认质量容差为10 ppm（针对所有碎片离子的m/z值），默认漂移时间容差为5%；PHO肽段处理方法的示例如图5所示。
   6. 校准类型选择采用 1/X 的线性曲线拟合² 加权。
2. 处理HS-MRM数据，以积分所有色谱图并构建每种PHO肽的校准曲线。

结果

PHO 肽混合物中包含的六种磷酸化酶 b 肽段标准品的各自序列如表 1 所示，同时列出了它们在 HDMS^E 实验中观察到的保留时间及其最丰富的前体离子。开发高选择性（HS）MRM 检测方法的第一步是获取 HDMS^E 数据集，以确定每种 PHO 肽段的洗脱时间，以及其对应的最丰富前体离子和三个最丰富的碎片离子。图 2 展示了在英夫利昔单抗酶解产物中添加的一种 PHO 肽段（Pep 6）所获得的 HDMS^E 谱图。在为每种肽段确定三个最佳“跃迁”（前体离子与碎片离子质量的组合）后，进行 Tof-MRM 实验以寻找最佳碰撞能量，从而最大化每种肽段产生的信号。碰撞能量优化实验的结果总结于表 2。最终的 HS-MRM 检测方法（见图 4）仅保留每种肽段的最佳“跃迁”，并用于分析所有添加样品。图 7 展示了在所研究的全部浓度范围内，针对 4 种 PHO 肽段生成的 HS-MRM 色谱图示例。对图 7 中标示的 HS-MRM 峰进行积分后，得到每种肽段的四条校准曲线，如图 8 所示。此外，基于四次重复进样的峰面积相对标准偏差汇总于表 3 所示的四个表格中。

肽段	肽段		保留时间	电荷态
编号	序列		时间（分钟）	+1	+2	+3	+4
Pep 1	VLYPNDNFFEGK		19.4	1442.6951	721.8512	481.5699	361.4292
Pep 2	TCAYTNHTVLPEALER		16.0	1874.9065	937.9569	625.6404	469.4821
Pep 3	IGEEYISDLDQLRK		18.9	1678.8646	839.9360	560.2931	420.4716
Pep 4	LLSYVDDEAFIR		21.1	1440.7369	720.8721	480.9172	360.9397
Pep 5	LITAIGDVVNHDPVVGDR		19.7	1890.0080	945.5076	630.6742	473.2574
Pep 6	VFADYEEYVK		17.7	1262.5939	631.8006	421.5362	316.4039

表1. 在英夫利昔单抗酶解产物中加入的Mass PREP混合物所含PHO肽标准品。 肽段保留时间及其最丰富的前体离子（以粗体突出显示）以表格形式列出。

肽	肽		保留时间	肽前体		丰度最高的碎片离子/电荷			最佳条件
编号	序列		时间（分钟）	m/z 及电荷	漂移时间（毫秒）	I	II	III	碰撞能量（V）
Pep 2	TCAYTNHTVLPEALER		16.0	625.6404 (+3)	6.2	714.3781 (+1)	807.4177 (+2)	827.4621 (+1)	24
Pep 4	LLSYVDDEAFIR		21.1	720.8721 (+2)	7.5	865.4050 (+1)	964.4734 (+1)	1214.5688 (+1)	22
Pep 5	LITAIGDVVNHDPVVGDR		19.7	630.6742 (+3)	6.3	642.3570 (+1)	689.8391 (+2)	832.4236 (+2)	20
Pep 6	VFADYEEYVK		17.7	631.8006 (+2)	7.0	830.3931 (+1)	945.4200 (+2)	1016.4571 (+1)	24

表2. Tof-MRM优化实验结果：本研究中定量的每种PHO肽的三个最丰富片段及其对应的优化碰撞能量。

浓度	上柱量（飞摩尔）	Pep 2 峰面积（表 3A）
(nM)	on-column (fmoles)	Rep01	Rep02	Rep03	Rep04	均值	RSD (%)
0.1	1	490	439	462	431	456	5.8
1	10	5121	4842	5198	4842	5001	3.7
10	100	63853	64279	66111	62509	64188	2.3
100	1000	612392	605553	613229	611004	610545	0.6
浓度	上柱量（飞摩尔）	Pep 4 峰面积（表 3B）
(nM)	on-column (fmoles)	Rep01	Rep02	Rep03	Rep04	均值	RSD (%)
0.1	1	275	359	325	288	312	12.2
1	10	3559	3694	3287	3754	3574	5.8
10	100	45259	45775	42976	45548	44890	2.9
100	1000	459374	467927	436272	458994	455642	3.0
浓度	上柱量（飞摩尔）	Pep 5 峰面积（表 3C）
(nM)	on-column (fmoles)	Rep01	Rep02	Rep03	Rep04	均值	RSD (%)
0.1	1	3194	3243	3202	3257	3224	1.0
1	10	31464	31150	31464	31433	31378	0.5
10	100	313638	320712	311943	311943	314559	1.3
100	1000	2845736	2840031	2882006	2864052	2857956	0.7
浓度	上柱量（飞摩尔）	Pep 6 峰面积（表 3D）
(nM)	on-column (fmoles)	Rep01	Rep02	Rep03	Rep04	均值	RSD (%)
0.1	1	490	583	440	440	488	13.8
1	10	6429	6429	6848	6623	6582	3.0
10	100	71295	70400	71563	70400	70915	0.9
100	1000	707640	707640	694461	729490	709808	2.0

表3. 包含针对4种PHO肽段（Pep 2、4、5和6）在每次LC/MS进样中记录的HS-MRM色谱峰面积的表格（共16次LC/MS运行，测试了4个浓度水平）。
所有肽段在整个测试浓度范围内，其相对标准偏差均优于15%。

图1. 总结建立 HS-MRM 采集方法所需三个步骤的工作流程图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2. HDMSE 数据示例：
（A）显示Pep 6前体离子的低能量谱图。（B）同一肽段的高能量碎裂谱图，显示了用于飞行时间-多反应监测（Tof-MRM）碰撞能量优化的丰度最高的3个碎片离子（用圆圈标出）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3. 用于设置飞行时间-MRM 优化实验的参数。
针对每个转换，测试了十一种碰撞能量（范围为 16 至 36 V）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 最终 HS-MRM 方法示例。
每个“跃迁”都需要设置多个参数，包括肽段前体离子的 m/z、电荷态和离子淌度漂移时间、最丰富碎片离子的 m/z、最佳碰撞能量以及质谱采集时间。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. 处理方法用于分析 HS-MRM 数据集的设置。
每种肽段通过一条单一的“跃迁”进行监测，该跃迁由肽段前体的 m/z 值、电荷态和预期保留时间，以及最丰富碎片离子的 m/z 值及其电荷态共同定义。请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 离子淌度质谱仪示意图。
在HS-MRM采集模式下，待定量肽段的前体离子在离子淌度池中与其他共洗脱（干扰性）肽段前体离子实现分离，随后由四极杆进行选择，并在碰撞池中以固定的碰撞能量进行碎裂。通过调节推斥器频率可增强肽段碎片离子产生的信号，肽段的定量则基于每个肽段最强碎片离子所产生的高质谱分辨率（>30,000）信号完成。请点击此处查看该图的放大版本。

图7. 在跨越三个数量级（0.1、1、10 和 100 nM）的四种不同浓度下，针对4种PHO肽段记录的HS-MRM色谱图。
（A）Pep 2 色谱图，（B）Pep 4 色谱图，（C）Pep 5 色谱图，以及（D）Pep 6 色谱图。请点击此处查看该图的高清版本。

图8. 四种PHO肽在四个不同浓度（0.1、1、10和100 nM）下的校准曲线。
每条曲线下方的表格显示了每次进样所记录的各个峰面积（Y值），而每个表格的第二列则显示相对于预期线性响应的百分偏差。（A）Pep 2 校准曲线，（B）Pep 4 校准曲线，（C）Pep 5 校准曲线，（D）Pep 6 校准曲线。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

高分辨率（Rs >20,000）质谱技术通常用于在多种仪器平台上对治疗性蛋白质进行结构表征。相比之下，基于质谱的蛋白质定量通常在低分辨率（Rs ~1,000）串联四极杆质谱仪上通过SRM/MRM方法进行，所用特征肽段由蛋白质经酶解产生^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}。由于一维色谱分离无法完全分辨酶解产生的复杂肽段混合物，即使在单一蛋白质的酶解产物中，肽段共洗脱也十分常见。对于极为复杂的蛋白质酶解物（例如，在由治疗性蛋白质产生的富含肽段的背景下定量1-100 ppm的宿主细胞蛋白HCPs），SRM/MRM检测的灵敏度、准确性或线性可能受到干扰影响。

SRM/MRM 检测具有单维选择性，仅依赖于一个 "独特的" 前体/片段质荷比组合。因此，当肽段背景发生意外变化时，这些检测方法将失效（例如， 针对不同纯化步骤获得的生物制药样品。为克服这些局限性，本文提出一种在配备离子淌度的高分辨率四极杆飞行时间（QTOF）杂合质谱仪上实现的高选择性（HS）MRM检测方法（仪器示意图见图6）。

该仪器在离子淌度池中将目标肽段的前体离子与其他共洗脱（干扰性）肽段前体分离开，随后在四极杆中富集该前体离子的完整同位素峰簇，并在碰撞池中以固定的碰撞能量对其进行碎裂。通过调节推斥器频率（目标增强，Target Enhancement），选择性地将特定质荷比区域的离子送入飞行管，而非像全扫描模式那样推送所有离子，从而进一步增强其最丰富肽段碎片所产生的信号。肽段的定量分析基于该碎片离子所产生的高质谱分辨率（Rs ~30,000）信号进行。与SRM/MRM检测方法相比，HS-MRM检测方法提供了两个额外的选择性层级：其一是前体离子水平的离子淌度分离，其二是飞行时间（TOF）分析器更高的质荷比分辨率。这些选择性提升所带来的效果在图7所示的HS-MRM色谱图中清晰可见，其在三个数量级范围内均无干扰信号。

与SRM/MRM检测方法不同，HS-MRM检测方法中有多个可调节的参数用于优化：肽前体周围的保留时间窗口（通常设为0.2分钟）、四极杆隔离窗口（4 Da）、前体离子周围迁移时间窗口（±对应离子迁移谱图中前体峰的半峰全宽，FWHM），以及碎片离子的质谱分辨率（20,000–40,000）。HS-MRM检测方法非常灵敏：每种PHO肽在柱上的最低检测量为1飞摩尔（femtomole）（或以肽浓度计为0.1 nM）。考虑到肽的分子量（准确分子量见表1），在柱上检测到的肽量约为1–2皮克（pg），而柱上加载的背景肽（来自单克隆抗体酶解产物）量则显著更高，达2 µg。

根据全长PHO蛋白（97.2 kDa）的分子量（ spiked 肽段来源于此蛋白），该检测方法能够在高丰度背景离子存在的情况下检测到50 ppm的蛋白质杂质。对于分子量较低的宿主细胞蛋白（HCPs，10–20 kDa），检测限可进一步降低至5–10 ppm。该检测方法的线性范围跨越三个数量级（如图8中的校准曲线所示），意味着其可定量检测1–1,000 ppm范围内的HCPs。此外，如表3所示，HS-MRM检测方法的重复性与小分子SRM/MRM检测方法相当，其峰面积的相对标准偏差（RSD）优于15%。

我们探索了一种新型检测方法在单克隆抗体（mAb）酶解产物中定量添加的肽段标准品的能力，并验证了该方法在HCP分析中通常遇到的宽动态范围（至少三个数量级）内的灵敏度和实用性。在高丰度肽段背景（上样2 µg mAb酶解产物）存在的情况下，所有六种肽段标准品在低至0.1 nM（上样至2.1 mm内径色谱柱的量为1飞摩尔）的浓度下均被检测到。通过结合靶向高分辨质谱（HRMS）和离子淌度前体离子分离技术，HS-MRM检测方法在实现对多批次生物制药中多种HCP进行快速、高通量监测方面具有巨大潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
沃特世 Vion IMS Qtof 质谱仪	Waters	186009214
Acquity H-Class 四元溶剂管理器（QSM）	Waters	186015041
Acquity H-Class FTN 样品管理器（SM）	Waters	186015040
Acquity H-Class 柱温箱（CM）	Waters	186015043
乙腈（ACN）	Fisher Chemical	A996-4
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	40867-50G-F
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC 色谱柱，1.8 µm 粒径	Waters	186005298
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma Aldrich	D5545-5G
甲酸，LC/MS 流动相添加剂	Sigma Aldrich	56302-10X1ML-F
Hi3 兔磷酸化酶（PHO）MassPREP 标准品	Waters	186006011
碘乙酰胺（IAM）	Sigma Aldrich	I-1149-5G
液相小瓶（12x32 mm 玻璃小瓶，螺口）	Waters	186000327c
亮氨酸脑啡肽乙酸盐水合物	Sigma Aldrich	L9133-10MG
蛋白 LoBind 2.0 mL 离心管（2x50）	Eppendorf	22431102
RapiGest SF	Waters	186001861
胰蛋白酶/Lys-C 酶混合物，质谱级（5 x 20 µg）	Promega	V5073
水，LC/MS 级	Sigma Aldrich	39253-1L-R