方法文章

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

DOI：

10.3791/55334

⸱

2017年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑型疟疾是重症疟疾的征象，常预示死亡。尽管积极治疗可挽救生命，但脑型疟疾的诊断仍具挑战性。我们介绍一种实验性小鼠脑型疟疾模型，该模型具有人类疾病的多种特征，包括水肿和微血管病变。通过磁共振成像（MRI），我们能够检测并追踪血脑屏障破坏、水肿形成及继发性脑肿胀。本文描述了多种可用于可视化上述关键病理变化的MRI技术。因此，我们证明MRI是一种有价值的工具，可用于可视化和追踪水肿、脑肿胀及微血管病变等病理变化。 体内.

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

疟疾是一个重大的全球公共卫生问题。1 重症疟疾的部分特征是累及大脑，且常提示预后不良。在高疟疾传播地区，5岁以下儿童常出现脑部受累，这是该年龄组疟疾相关死亡的主要原因。1 尽管积极治疗可能挽救生命，但脑疟疾的检测，尤其是在早期阶段，可能较为困难。脑疟疾涉及的病理过程包括微血管破坏和脑水肿，这些可导致严重的脑肿胀。本文介绍了一种磁共振成像（MRI）方案，可用于实验性脑疟疾（ECM）的全脑in vivo成像。尽管目前对ECM在中枢神经系统中如何启动以及导致该疾病的特定机制尚不明确，但全脑高分辨率成像方法在此类疾病中的应用仍严重不足。in vivo MRI可覆盖整个大脑，是深入理解ECM病理的重要研究工具。MRI能够评估全脑脑肿胀情况，而脑肿胀最近已被确认不仅在ECM中，也在人类脑疟疾中是死亡的重要预测指标。2,3 严重脑肿胀出现在致命性疾病中，是ECM模型与人类疾病之间多种病理特征之一，该疾病以炎症反应和微血管改变为特征。4

可通过致死性感染在CBA或C57BL小鼠中诱导ECM 疟原虫伯氏曼氏株 ANKA5 ECM 的发病通常发生在感染后的第6至10天，表现为抽搐、共济失调、呼吸窘迫和昏迷，进而导致迅速死亡。4 快速小鼠昏迷与行为评分（RMCBS）是一种用于评估脑型疟疾临床症状的有用评分方法。该评分包含10个参数，每个参数评分范围为0至2分，总分最高为20分。6 最近，我们发现ECM小鼠的RMCBS评分严重程度与MRI显示的病理变化之间具有良好的一致性。7 在本方案中，我们描述了小鼠中细胞外基质（ECM）的诱导方法 体内 患有 ECM 的小鼠的磁共振成像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文报道的所有动物实验均按照实验动物科学协会联合会（FELASA）B类标准以及实验动物科学学会（GV-SOLAS）的标准指南进行，并已获得德国卡尔斯鲁厄当地主管部门（德国卡尔斯鲁厄政府主席团）的批准。请注意，蚊子和伯氏疟原虫ANKA子孢子相关工作需遵循生物安全二级标准。

1. 感染

  1. 通过让按蚊（Anopheles stephensi）在配子体血症小鼠身上吸血15分钟，使其感染伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）ANKA株。将感染后的蚊子置于80%湿度和21 °C条件下饲养。
  2. 在吸血后17至22天，从蚊笼中收集雌性蚊子，并将其置于冰上进行麻醉。
  3. 使用镊子将三到四只蚊子放置于载玻片上，载玻片表面预先滴加一滴冷的RPMI培养基。将载玻片置于显微镜下。
  4. 用镊子小心地拉伸蚊子的头部与身体之间部位，使用注射器和针头分离唾液腺。对剩余蚊子重复此操作。
  5. 用玻璃移液管吸取载玻片上的唾液腺，并将其收集至1.5 mL离心管中。
    注：根据感染率不同，通常每对唾液腺可获得8,000至15,000个具有感染性的子孢子。
  6. 在离心管中使用小型塑料棒剧烈研磨分离的唾液腺约3分钟，以从腺体组织中释放子孢子。
  7. 在1,000 × g、4 °C条件下离心3分钟，以从残留组织中纯化子孢子。
  8. 将含有子孢子（SPZ）的上清液用移液器转移至新的离心管中，并使用Neubauer血细胞计数板对纯化的子孢子进行计数。
  9. 加入磷酸盐缓冲液（PBS），将纯化子孢子的浓度调整为10,000/mL。
  10. 向近交系C57BL/6小鼠尾静脉注射总共1,000个子孢子（0.1 mL）以启动感染。为便于注射，将C57BL/6小鼠放入固定器中，并将尾巴浸入温水（约37 °C）以帮助显现尾静脉；
    注：注射操作本身为短暂过程，可在数秒内完成。
  11. 从子孢子感染后的第3天开始，每日一次通过血涂片检测血液阶段的寄生虫血症水平。
    注：监测寄生虫血症的方法已在Mueller et al.发表的JoVE文章中进行过可视化展示8。
  12. 从子孢子注射后第5天起，每日使用快速小鼠昏迷与行为评分量表（RMCBS）对小鼠进行评估。
    注：Caroll et al.已发表该操作的详细描述，包括视频演示6。
  13. 根据RMCBS评分及拟研究的科学问题，对小鼠进行MRI成像评估。6

2. 磁共振成像设置

  1. 使用9.4T小动物磁共振成像仪，配备用于射频发射的容积共振器和四通道相控阵表面接收线圈进行MRI扫描。开启温度控制水浴至42 °C，以维持小鼠的体温。
  2. 在麻醉舱内使用2%异氟烷和压缩空气诱导麻醉，直至小鼠对脚趾夹捏无反应。维持麻醉浓度为1–1.5%。
  3. 将尾静脉导管插入小鼠尾静脉。将小鼠俯卧位固定于配备头部固定器和门齿杆的动物床板上，背部呈蜷缩状，以尽量减少头部运动。注意不要拉直小鼠的颈椎。
  4. 将对比剂注射系统连接至尾静脉导管。可使用自制的注射系统，内含Gd-DTPA（0.3 mmol/kg）注射器，或使用PE管连接Gd-DTPA（0.3 mmol/kg）注射器。
  5. 在小鼠双眼涂抹右旋泛醇眼膏。将四通道相控阵表面接收头线圈放置于小鼠头部。将呼吸垫放置于小鼠背部，并连接至呼吸监测装置。

3. 成像方案

注意：根据拟解决的研究问题，从以下列出的方案中选择成像序列。所列出的所有参数均适用于该 MRI 软件，但如果使用其他软件程序，可能需要进行调整。

  1. 首先进行定位扫描，以确保小鼠脑部位于磁体的等中心位置。
  2. 为定性评估血管源性水肿，选择多层RARE序列进行三维T2加权成像。
    1. 在MRI软件中输入以下参数：重复时间 = 2.000 ms，回波时间 = 22 ms，各向同性分辨率 = 0.1 mm，视野 = 20 × 10 × 12 mm3；矩阵 = 200 × 100 × 120，翻转角 = 90–180°（自旋回波），RARE因子 = 8。启动序列并等待10分48秒以获取原始图像。
  3. 为定量评估血管源性水肿，选择多层多回波自旋回波序列进行T2弛豫测量。
    1. 使用以下参数：重复时间 = 3.100 ms，回波时间 = 8–136 ms（以8 ms为增量），切片数量 = 17，层厚 = 0.7 mm，平面内分辨率 = 0.116 mm × 0.116 mm，视野 = 20 × 20 mm2，矩阵 = 172 × 172，翻转角 = 90–180度（自旋回波）。启动序列并等待8分53秒以获取原始图像。
  4. 为定量评估血管源性水肿和细胞毒性水肿，选择自旋回波EPI扩散序列进行扩散加权成像/表观扩散系数（ADC）图谱分析。
    1. 使用以下参数：重复时间 = 3.400 ms，回波时间 = 20 ms，层厚 = 0.7 mm，切片数量 = 17，扩散敏感方向数 = 30，b值 = 1.500 s/mm2，δ = 3 ms，Δ = 9 ms，部分傅里叶编码加速因子 = 1.51，视野 = 12 × 15 mm2，矩阵 = 96 × 128，平面内分辨率 = 0.125 mm × 0.117 mm，翻转角 = 90–180度，饱和切片数量（矢状面）= 1。启动序列并等待7分56秒直至获取原始图像。
  5. 为评估微出血，使用三维T2*加权成像，选择流动补偿的FLASH序列。
    1. 在MRI软件中输入以下参数：重复时间 = 2.000 ms，回波时间 = 22 ms，各向同性分辨率 = 0.08 mm，视野 = 32 × 15 × 8 mm3，矩阵大小 = 400 × 188 × 100，翻转角 = 12度。启动序列并等待15分40秒以获取原始图像。
  6. 为评估动脉通畅性，选择三维FLASH序列进行时间飞跃法血管成像（TOF angiography）。
    1. 在MRI软件中使用以下参数：重复时间 = 16 ms，回波时间 = 3.5 ms，层厚 = 0.07 mm，平面内分辨率 = 0.104 × 0.104 mm，视野 = 20 × 20 × 10 mm3，矩阵 = 192 × 192 × 142，翻转角 = 15度。启动序列并等待7分16秒直至图像获取完成。
  7. 为评估血脑屏障破坏情况，在注射0.3 mmol/kg对比剂前后均进行三维T1加权成像，选择带有全局射频激发的射频扰相FLASH序列。
    1. 在MRI软件中使用以下序列参数：重复时间 = 5 ms，回波时间 = 1.9 ms，各向同性分辨率 = 0.156 mm，视野 = 20 × 18.7 × 18.7 mm3，矩阵 = 128 × 120 × 120，翻转角 = 8.5°。启动序列并等待1分14秒直至图像获取完成。

4. 图像处理与分析

  1. 为分析血脑屏障破坏，使用 ImageJ 中的算术工具或图像计算器工具，将增强前 3D T1 加权图像从增强后 T1 加权图像中减去。通过观察减影图像中信号的增加来评估血脑屏障的破坏情况。9
  2. 为分析脑体积，使用原始的 3D T1 加权或 3D T2 加权数据集。使用分割编辑器从嗅球到小脑对脑组织进行勾画。10
  3. 血管源性脑水肿
    1. 使用 MRI 软件处理 T2 弛豫测量数据，或采用非线性最小二乘法拟合程序。11 使用 MRI 软件或 FDT 工具箱（见材料表）处理扩散加权数据以获得表观扩散系数（ADC）图。
    2. 手动将感兴趣区域放置于不同的解剖区域。
      注意：由于明显的脑肿胀，自动放置感兴趣区域可能会导致定位错误。通过此方式获取所选解剖区域的 T2 弛豫时间和 ADC 值。
  4. 为分析微出血体积，使用分割编辑器对微出血区域进行勾画；微出血在 T2* 加权数据集中表现为卵圆形的低信号灶。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在感染 P. berghei ANKA 子孢子后，C57BL/6 小鼠通常在第6至10天之间出现脑型疟疾（ECM）的首发临床症状。60%–80%的感染小鼠会发展为ECM，并在24至48小时内迅速进展为昏迷和死亡。相比之下，未发展为ECM的小鼠则在感染后第二周因高寄生虫血症导致的严重贫血而死亡。12

在MRI成像中，ECM的最早征象出现在嗅球，嗅球属于小鼠的嗅觉系统，位于脑的吻侧部分。7,13 血脑屏障破坏的增加（在增强T1加权图像上可见）以及液体增加（T2加权图像、T2弛豫测量和弥散加权成像上的T2信号升高）提示嗅球中已存在早期血管源性脑水肿，这种改变在轻度疾病（RMCBS评分20-16）时即已出现，并随着疾病严重程度的增加而开始扩散。相对T1信号图像有助于检测轻微的血脑...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种全脑 MRI 方案，用于描绘实验性脑型疟疾中的变化。我们认为，迄今为止，MRI 在疟疾研究中的应用尚不充分，希望我们的方案能够为其他研究者提供帮助。我们愿介绍一些可能有帮助的补充要点。

如果对病情严重的实验小鼠进行成像，体位摆放至关重要。由于颅内压升高，小鼠易发生死亡，因此不应拉伸颈椎。麻醉也应尽量减少。若对病情较轻的小鼠进行成像，磁共振成像（MRI）的最佳时间点是在预计出现首个临床症状前12-24小时。在未表现出任何脑型疟疾（ECM）临床体征（RMCBS评分为20）的小鼠中，可在嗅球观察到轻度血管源性脑水肿。

MRI方案的持续时间可根据具体的研究问题进行调整。最基本的方案应包括T2加权序列或T2弛豫测量以及T2*加权序列，以评估血管源性水肿的存在以及微出血负荷/微血管功能障碍。为了获得高质量的图像，应尽量减少运动伪影。通过正确固定小鼠体位并将其呼吸频率维持在每分钟60–80次，可有效减少运动。

其他体内成像方法，例如活体显微镜，在细胞水平...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢米里亚姆·赖尼希（Miriam Reinig）提供的专业技术支持。A.H. 获得了海德堡大学医学院博士后津贴的资助。M.P. 受益于埃尔泽·克勒纳-弗雷森纽斯基金会（Else-Kröner-Fresenius Foundation）设立的纪念性津贴。A.K.M. 获得了德国感染研究中心（DZIF）DZIF学院产假津贴的资助。J.P. 获得了海德堡分子医学研究中心（HRCMM）职业发展奖学金的资助。此外，我们衷心感谢朱莉娅·M·萨特勒（Julia M. Sattler）和弗里德里希·弗里施克内希特（Friedrich Frischknecht）提供了子孢子运动的示范影片。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷Baxter1001747用于麻醉
DotaremGuebert1086923Gd-DTPA 对比剂；0.5 mmol/mL
Amira（图像处理程序）FEI GroupAmira 5.3.2 版本
MATLAB The MathWorks, Inc.发布版本 2012b
FDT 工具箱 FMRIB 软件库http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
  3. Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
  4. de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
  5. Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
  6. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
  7. Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).
  8. Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829(2014).
  9. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  10. Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
  11. Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).
  12. Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
  13. Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
  14. Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).
  15. Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).
  16. Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).
  17. Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).
  18. Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

T2 Gd DTPA

相关文章