模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

摘要

为了在生理相关模型中研究卵巢肿瘤的进展，将多细胞球体在微流控装置中于模拟流体流动条件下进行培养。该动态三维模型模拟了卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包含其中的细胞和机械组分。

摘要

卵巢癌的特征是广泛的腹膜转移，恶性腹水中常可见肿瘤球体。这种情况与不良的临床预后相关，目前尚缺乏有效的治疗方法。三维（3D）环境和动态机械力在此转移级联过程中均为极为重要的因素。然而，传统的细胞培养方法无法重现这种天然的肿瘤微环境。因此， 体内类器官模型能够模拟腹腔内环境，具有重要意义。本研究建立了一种新的腹膜微流控平台，用于模拟卵巢癌细胞球在转移过程中于腹腔内的存在状态。在非黏附条件下生成的卵巢癌细胞球被培养于微流控通道中，通道内壁覆盖有经生理相关剪切应力处理的腹膜间皮细胞。综上所述，这一动态三维卵巢癌-间皮微流控平台可为癌症基础生物学研究提供新见解，并可作为潜在药物筛选与开发的平台。

引言

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，其特征是广泛的腹膜播散和恶性腹水的形成¹。这种广泛的腹膜转移构成了重大的临床挑战，并与不良的临床预后相关。与大多数通过血液转移的实体癌不同，卵巢癌主要在腹膜腔内播散。在转移过程中，肿瘤细胞以多细胞聚集体/球状体的形式存在²。悬浮培养能够富集卵巢癌干细胞/肿瘤起始细胞，这一事实进一步表明，这些球状体可能与肿瘤侵袭性增强以及化疗耐药性提高有关^3,4。二维（2D）和三维（3D）培养体系在药物反应上存在差异，这可能是由于其分子机制不同所致⁵。

与间皮细胞的相互作用构成了卵巢肿瘤进展的主要微环境。这些间皮细胞位于细胞外基质（ECM）上，其中纤连蛋白是一种普遍存在的组分。已有研究显示，间皮细胞来源的纤连蛋白表达增加与肿瘤进展之间存在关联。在恶性腹水中可检测到大量纤连蛋白^6,7。卵巢癌细胞还能够诱导间皮细胞分泌纤连蛋白，从而促进早期卵巢癌的转移⁸。

越来越多的证据表明，机械刺激（包括剪....

方案

1. 微流控装置的设计与制备

1. 微流控母版设计
   1. 使用任意计算机辅助设计（CAD）软件设计并绘制微流控通道图案。
      注意：通常，CAD 图稿可直接发送至光掩膜公司以制作光掩膜。本微流控设计包含三条相同的平行通道，每条通道尺寸为 4 mm × 25 mm × 250 µm（宽 × 长 × 高），通道之间相距 2 mm。通道两端设计为 127° 角，以利于液体进出（图 1B）。本方案中所用通道设计此前已有文献报道¹³。
   2. 将硅片依次在丙酮、异丙醇和去离子水中进行超声清洗（500 W/42 kHz），每次 15 分钟。用加压氮气吹干硅片。将硅片置于加热板上，在 250 °C 下加热 15 分钟以彻底干燥。
   3. 在硅片上旋涂一层 SU-8 2075 光刻胶（厚度 125 µm），转速为 1,800 rpm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在 65 °C 烘烤 5 分钟，再在 95 °C 烘烤 25 分钟，以去除多余溶剂（具体参数依据 SU-8 产品说明书）。
   4. 重复步骤 3，再旋涂一层 SU-8 2075 光刻胶，使最终厚度达到 250 µm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在 65 °C 烘烤 7 分钟，再在 95 °C 烘烤 30 分钟。随后将硅片缓慢冷却至室温。禁止使用加压空气冷却。
   5. 将光掩膜对准并直接放置在....

结果

采用本方案，建立了在流体动力条件下模拟卵巢癌类球体与间皮细胞相互作用的微流控平台。将原代人腹膜间皮细胞在微流控装置中培养16小时，并在明场显微镜下观察。如图2A所示，微通道底部已成功覆盖单层人腹膜间皮细胞（HPMCs）。需要注意的是，在纤连蛋白或HPMC铺板过程中若产生气泡，将导致通道包被失败。通过非黏附悬浮培养，生成了直径约100 µm的多细胞类球体，其尺寸与患者腹水中发现的类球体相似，并使用绿色荧光染料CMFDA进行标记。随后将这些类球体转移至HPMC包被的微流控通道中并保持悬浮状态。在显微镜下观察细胞形态并采集图像（图2B）。在荧光显微镜下，荧光标记的癌类球体可与间皮细胞清晰区分（图2C）。

讨论

该检测方法提供了一种灵活且具有生理相关性的模型，可与多种生物化学和基于细胞的检测技术联合使用，包括但不限于黏附实验、间皮清除实验以及药物筛选。该模型可用于评估腹腔内微环境对癌症进展的影响。然而，具体的实验条件可能需要根据研究目标进行优化（例如， 每通道接种的HPMCs数量和癌细胞球体数量、共培养时间， 等等。）。为了研究卵巢癌球体与邻近细胞之间的重要相互作用，该系统还可纳入腹膜内微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞。此外，也可使用其他细胞外基质（ECM）成分，如层粘连蛋白（laminin）、玻璃体粘连蛋白（vitronectin）或胶原蛋白（collagen）。该方案的一个局限性在于，尽管营养补充与剪切应力的耦合情况类似于体内所见，但这一点可能需要加以考虑。 体内目前系统中无法独立控制营养补充和剪切应力。此外，还需采用芯片内胰蛋白酶消化结合荧光激活细胞分选等技术，以分别收集卵巢癌细胞和人腹膜间皮细胞，用于针对不同类型细胞的进一步分子研究。

与传统方法相比，该技术具有多项优势。首先，三维共培养能更好地模拟

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	University wafer	#1196	100 mm
SU-8 2075 光刻胶	Microchem
SU-8 显影液	Microchem	108-65-6
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	聚二甲基硅氧烷 (PDMS) + 固化剂套装
活检打孔器	Miltex	33-31AA	1 mm 直径
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-002
聚乙烯管	SCI	BB31695-PE/5	0.86 mm（内径）
注射器	Terumo
注射泵	Longer precision pump	LSP01-2A
199 培养基	Invitrogen	31100-035	添加 2.2 g/L 碳酸氢钠
MCDB 105 培养基	Sigma	M6395
胎牛血清 (FBS)	Hyclone	SH30068.02
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070-063
胰蛋白酶 EDTA 溶液	Gibco	25300-054	0.05% 胰蛋白酶 - 0.01% EDTA，含酚红
人纤维连接蛋白	BD	354008
琼脂糖	Invitrogen	15510-027
5-氯甲基荧光素二乙酸酯	Life technologies	C7025	绿色 CMFDA
CO2 培养箱	SANYO	MCO-18AIC
离心机	Hitachi	CT15RE
荧光显微镜	Nikon		型号：80i 或 ECLIPSE Ti；软件：SPOT
SKOV-3			由加拿大不列颠哥伦比亚大学 N Auersperg 博士惠赠