模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

摘要

为了在生理相关模型中研究卵巢肿瘤的进展，将多细胞球体在微流控装置中于模拟流体流动条件下进行培养。该动态三维模型模拟了卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包含其中的细胞和机械组分。

摘要

卵巢癌的特征是广泛的腹膜转移，恶性腹水中常可见肿瘤球体。这种情况与不良的临床预后相关，目前尚缺乏有效的治疗方法。三维（3D）环境和动态机械力在此转移级联过程中均为极为重要的因素。然而，传统的细胞培养方法无法重现这种天然的肿瘤微环境。因此， 体内类器官模型能够模拟腹腔内环境，具有重要意义。本研究建立了一种新的腹膜微流控平台，用于模拟卵巢癌细胞球在转移过程中于腹腔内的存在状态。在非黏附条件下生成的卵巢癌细胞球被培养于微流控通道中，通道内壁覆盖有经生理相关剪切应力处理的腹膜间皮细胞。综上所述，这一动态三维卵巢癌-间皮微流控平台可为癌症基础生物学研究提供新见解，并可作为潜在药物筛选与开发的平台。

引言

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，其特征是广泛的腹膜播散和恶性腹水的形成¹。这种广泛的腹膜转移构成了重大的临床挑战，并与不良的临床预后相关。与大多数通过血液转移的实体癌不同，卵巢癌主要在腹膜腔内播散。在转移过程中，肿瘤细胞以多细胞聚集体/球状体的形式存在²。悬浮培养能够富集卵巢癌干细胞/肿瘤起始细胞，这一事实进一步表明，这些球状体可能与肿瘤侵袭性增强以及化疗耐药性提高有关^3,4。二维（2D）和三维（3D）培养体系在药物反应上存在差异，这可能是由于其分子机制不同所致⁵。

与间皮细胞的相互作用构成了卵巢肿瘤进展的主要微环境。这些间皮细胞位于细胞外基质（ECM）上，其中纤连蛋白是一种普遍存在的组分。已有研究显示，间皮细胞来源的纤连蛋白表达增加与肿瘤进展之间存在关联。在恶性腹水中可检测到大量纤连蛋白^6,7。卵巢癌细胞还能够诱导间皮细胞分泌纤连蛋白，从而促进早期卵巢癌的转移⁸。

越来越多的证据表明，机械刺激（包括剪切应力）可以调节肿瘤细胞的形态、基因表达，从而影响其表型。^9,10,11. 恶性腹水 在肿瘤进展过程中发育并积累，卵巢肿瘤细胞暴露于 流体流动及其结果 剪切应力. 多个研究团队（包括我们自己）已证实剪切应力对卵巢癌进展的影响，包括细胞骨架的改变、上皮-间质转化以及肿瘤干细胞特性的获得^12,13,14,15因此，生理相关的微环境对于研究肿瘤腹膜转移至关重要。然而，目前 体外 流体动力学培养系统在模拟和控制恒定、低水平且具有生理相关性的剪切应力方面存在局限性^16,17,18,19. 传统方法 体外 仅关注细胞或机械环境的方法在模拟具有适当生理相关性的腹腔内微环境的复杂性方面仍然存在局限性。

在此，为了构建一种新型腹膜模型，以克服传统策略的局限性，并推动对癌症转移过程中腹腔内环境的研究，设计了一种基于微流控技术、具有可控流体流动的三维微流控平台。在该模型中，将卵巢癌类球体与原代人腹膜间皮细胞在微流控芯片中进行共培养，并施加持续的流体流动（图1A）。间皮细胞被接种于纤维连接蛋白包被的表面，而非黏附性的卵巢癌类球体则被接种至微流控通道中，并通过注射泵持续灌注培养基。三维环境和动态机械力均为转移级联过程中的关键因素。该平台可用于研究腹腔内微环境，涵盖复杂的细胞间及共培养相互作用，以及动态机械信号的影响。

方案

1. 微流控装置的设计与制备

1. 微流控母版设计
   1. 使用任意计算机辅助设计（CAD）软件设计并绘制微流控通道图案。
      注意：通常，CAD 图稿可直接发送至光掩膜公司以制作光掩膜。本微流控设计包含三条相同的平行通道，每条通道尺寸为 4 mm × 25 mm × 250 µm（宽 × 长 × 高），通道之间相距 2 mm。通道两端设计为 127° 角，以利于液体进出（图 1B）。本方案中所用通道设计此前已有文献报道¹³。
   2. 将硅片依次在丙酮、异丙醇和去离子水中进行超声清洗（500 W/42 kHz），每次 15 分钟。用加压氮气吹干硅片。将硅片置于加热板上，在 250 °C 下加热 15 分钟以彻底干燥。
   3. 在硅片上旋涂一层 SU-8 2075 光刻胶（厚度 125 µm），转速为 1,800 rpm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在 65 °C 烘烤 5 分钟，再在 95 °C 烘烤 25 分钟，以去除多余溶剂（具体参数依据 SU-8 产品说明书）。
   4. 重复步骤 3，再旋涂一层 SU-8 2075 光刻胶，使最终厚度达到 250 µm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在 65 °C 烘烤 7 分钟，再在 95 °C 烘烤 30 分钟。随后将硅片缓慢冷却至室温。禁止使用加压空气冷却。
   5. 将光掩膜对准并直接放置在硅片表面。用紫外光照射 20 秒，使图案区域发生交联。
   6. 将带有光刻胶的硅片置于加热板上，分别在 65 °C 和 95 °C 下烘烤 5 分钟和 12 分钟，以去除聚合过程中残留的溶剂（具体参数依据 SU-8 产品说明书）。之后将硅片冷却至室温。
   7. 将硅片浸入 SU-8 显影液中 25 分钟，去除未交联的光刻胶。用异丙醇冲洗硅片，并用加压空气吹干。
      注意：若在异丙醇冲洗过程中观察到乳白色溶液，表明显影不完全，应将硅片重新浸入 SU-8 显影液中延长显影时间。
   8. 将硅片置于 180 °C 加热板上加热 10 分钟，以修复图案中可能出现的裂纹。关闭加热板，让硅片在加热板上自然缓慢冷却至室温。
   9. 在离心管盖中加入数滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷。将管盖放入真空干燥器中，将硅片置于管盖旁，进行 10 分钟的硅烷化处理。
2. PDMS 芯片制备
   1. 用铝箔包裹硅片，制成托架。
   2. 按 10:1 的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与固化剂，使用离心混合器在混合与脱气模式下充分混合。将 PDMS 混合物缓慢倾倒至硅片上，厚度约为 5 mm。在真空条件下脱气 40 分钟。随后在 65 °C 烘箱中固化 2 小时。
   3. 小心地将 PDMS 块从母版上剥离，并沿通道修剪至载玻片大小。使用 1 mm 生检打孔器在 PDMS 上打孔，形成器件的进样口和出样口。
   4. 用加压空气和粘性胶带清洁 PDMS 表面，以去除灰尘和 PDMS 碎屑。
   5. 将 PDMS 块的通道面朝上放入等离子清洗仪中。同时将一块洁净的载玻片与 PDMS 块一同放入等离子清洗仪中。
   6. 在高射频功率下使用空气等离子体处理 PDMS 和载玻片 1 分钟。将 PDMS 与载玻片键合，形成不可逆的共价连接。
   7. 将 PDMS 芯片置于 150 °C 加热板上加热 1 小时，以增强键合强度，并在使用前恢复 PDMS 的疏水性。

2. 用原代腹膜间皮细胞（HPMCs）接种微流控芯片

1. 微流控通道的纤连蛋白包被
   1. 使用 30 µL 75% 乙醇对微流控通道进行灭菌。吸除乙醇后，用移液枪头加入 30 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次。彻底抽吸通道中的 PBS。
      注意：为尽量减少污染，微流控细胞培养应在超净工作台内严格无菌条件下操作。
   2. 在无血清 M199:MCDB105（1:1）培养基中配制 10 µg/mL 的纤连蛋白溶液。轻轻吹打混匀，特别注意避免产生气泡。切勿涡旋震荡。
   3. 缓慢向每个通道中加入 30 µL 纤连蛋白溶液。用封口膜密封通道，并将芯片在 4 °C 下孵育过夜。
2. 将 HPMCs 接种至微流控通道中
   1. 在含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基（M199:MCDB105 添加 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素）中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 HPMCs，直至细胞融合度达到 80%。
   2. 用 3 mL PBS 洗涤 HPMCs，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/0.01% EDTA（TE）溶液消化 30 秒。加入 4 mL 含 10% FBS 的培养基中和反应，然后在 1,000 × g 离心 5 分钟收集细胞。
   3. 将 HPMCs 重悬于 2 mL 含 10% FBS 的培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至 3.5×10⁶/mL。
   4. 使用前将纤连蛋白包被的微流控芯片置于 37 °C 培养箱中预热 5 分钟。彻底抽吸掉纤连蛋白溶液。
   5. 缓慢向每个通道中加入 30 µL HPMC 悬液。用封口膜密封通道，将装置置于 CO₂ 培养箱中孵育过夜。

3. 卵巢癌类球体形成与共培养

1. 卵巢癌球体形成
   1. 将人上皮性卵巢癌细胞系 SKOV-3 培养于含 5% FBS 的培养基（M199:MCDB105 加 5% FBS 及 100 U/mL 青霉素/链霉素）中，置于 5% CO₂ 条件下培养₂ 在实验前于37 °C下孵育。
   2. 将0.5%琼脂糖溶于无菌水中，煮沸溶解。将50 µL琼脂糖溶液加入96孔板的每个孔中。将板置于生物安全柜中20分钟，使琼脂糖充分凝固；凝固后的琼脂糖覆盖孔底可防止细胞贴壁，表明板已准备就绪可供使用。
   3. 用 3 mL PBS 清洗 SKOV-3 细胞。加入 2 mL TE 溶液消化 3 分钟。加入 4 mL 5% FBS 培养基中和，然后在 1,000 × g 离心 5 分钟收集细胞。
   4. 使用血细胞计数板对SKOV-3细胞进行计数，并将细胞重悬于含5% FBS的培养基中，调整细胞密度为5,000个细胞/mL。将200 µL细胞悬液加入每个涂有琼脂糖的孔中，在5% CO₂条件下培养₂ 37 °C 下孵育 48 小时。
2. 肿瘤球体接种
   1. 将癌细胞球体转移至预先用1 mL无血清培养基润湿的50 mL离心管中，在750 × g下离心5分钟。
      注意：预先润湿的移液器吸头和离心管可防止类球体非特异性地黏附在离心管上。
   2. 在无血清的 M199:MCDB105 培养基中配制 2.5 µg/mL 的 5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA）溶液。将癌细胞球体重悬于 1 mL CMFDA 溶液中，于 37 °C 孵育 30 分钟。以 750 × g 离心 5 分钟。
   3. 用2 mL无血清培养基冲洗肿瘤类球体，并在750 × g下离心5分钟。重复此步骤两次，以去除培养基中残留的荧光染料。
      注意：荧光信号在类球体中可保持超过96小时。
   4. 将肿瘤球体重悬于无血清的M199:MCDB105培养基中，使用血细胞计数板对球体数量进行计数。用无血清培养基将浓度调整至2,000个球体/mL。
   5. 在类球体加样前，缓慢注入100 µL无血清M199:MCDB105培养基，以冲洗掉通道内未贴壁的间皮细胞。
      注意：快速注射、抽吸或气泡形成会导致间皮单层细胞脱落。
   6. 将30 µL荧光标记的球状体悬液加入每个通道中。将微流控芯片放入CO₂ 培养箱
3. 灌流平台组装与共培养
   1. 将装有新鲜无血清M199:MCDB105培养基的注射器连接至一根1米长的管路。
   2. 将注射器安装至注射泵上，并固定推杆和注射器本体。将注射泵水平安装在培养箱内，使其与微流控芯片处于同一高度。
      注意：注射器的数量和规格取决于所用通道数量及实验持续时间。
   3. 通过按住快进按钮，迅速将培养基充满整段管路，直至培养基溢出管路末端。
   4. 以设定的流速进行注射。使用以下公式估算管壁剪切应力：
      
      其中 τ 表示腔室内的壁面剪切应力， ǫ = 流速， μ = 黏度（0.01 g cm·s⁻¹）^-1); h = 流动室高度，以及 w = 流动室宽度。
   5. 将管路连接至通道的入口。将多余的进样管路置于培养箱中，以确保培养基在注入通道前已预热。为便于管路与通道之间的连接，可选择合适的连接件。注意：切勿在注射器、管路及连接处引入任何气泡。
   6. 将通道出口通过一段短的输出管连接至一个50 mL锥形管，用于收集流出的培养基。
      注意：完整的动态共培养系统如图所示 图1D.

4. 灌注后对高表达间皮细胞和癌细胞球体的观察

1. 灌注1小时后，使用明场或荧光显微镜观察人腹膜间皮细胞（HPMCs）和癌细胞球状体，并拍照记录。

结果

采用本方案，建立了在流体动力条件下模拟卵巢癌类球体与间皮细胞相互作用的微流控平台。将原代人腹膜间皮细胞在微流控装置中培养16小时，并在明场显微镜下观察。如图2A所示，微通道底部已成功覆盖单层人腹膜间皮细胞（HPMCs）。需要注意的是，在纤连蛋白或HPMC铺板过程中若产生气泡，将导致通道包被失败。通过非黏附悬浮培养，生成了直径约100 µm的多细胞类球体，其尺寸与患者腹水中发现的类球体相似，并使用绿色荧光染料CMFDA进行标记。随后将这些类球体转移至HPMC包被的微流控通道中并保持悬浮状态。在显微镜下观察细胞形态并采集图像（图2B）。在荧光显微镜下，荧光标记的癌类球体可与间皮细胞清晰区分（图2C）。

讨论

该检测方法提供了一种灵活且具有生理相关性的模型，可与多种生物化学和基于细胞的检测技术联合使用，包括但不限于黏附实验、间皮清除实验以及药物筛选。该模型可用于评估腹腔内微环境对癌症进展的影响。然而，具体的实验条件可能需要根据研究目标进行优化（例如， 每通道接种的HPMCs数量和癌细胞球体数量、共培养时间， 等等。）。为了研究卵巢癌球体与邻近细胞之间的重要相互作用，该系统还可纳入腹膜内微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞。此外，也可使用其他细胞外基质（ECM）成分，如层粘连蛋白（laminin）、玻璃体粘连蛋白（vitronectin）或胶原蛋白（collagen）。该方案的一个局限性在于，尽管营养补充与剪切应力的耦合情况类似于体内所见，但这一点可能需要加以考虑。 体内目前系统中无法独立控制营养补充和剪切应力。此外，还需采用芯片内胰蛋白酶消化结合荧光激活细胞分选等技术，以分别收集卵巢癌细胞和人腹膜间皮细胞，用于针对不同类型细胞的进一步分子研究。

与传统方法相比，该技术具有多项优势。首先，三维共培养能更好地模拟

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	University wafer	#1196	100 mm
SU-8 2075 光刻胶	Microchem
SU-8 显影液	Microchem	108-65-6
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	聚二甲基硅氧烷 (PDMS) + 固化剂套装
活检打孔器	Miltex	33-31AA	1 mm 直径
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-002
聚乙烯管	SCI	BB31695-PE/5	0.86 mm（内径）
注射器	Terumo
注射泵	Longer precision pump	LSP01-2A
199 培养基	Invitrogen	31100-035	添加 2.2 g/L 碳酸氢钠
MCDB 105 培养基	Sigma	M6395
胎牛血清 (FBS)	Hyclone	SH30068.02
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070-063
胰蛋白酶 EDTA 溶液	Gibco	25300-054	0.05% 胰蛋白酶 - 0.01% EDTA，含酚红
人纤维连接蛋白	BD	354008
琼脂糖	Invitrogen	15510-027
5-氯甲基荧光素二乙酸酯	Life technologies	C7025	绿色 CMFDA
CO2 培养箱	SANYO	MCO-18AIC
离心机	Hitachi	CT15RE
荧光显微镜	Nikon		型号：80i 或 ECLIPSE Ti；软件：SPOT
SKOV-3			由加拿大不列颠哥伦比亚大学 N Auersperg 博士惠赠