多聚体-PAGE：一种用于捕获和解析生物样品中蛋白质复合物的方法

摘要

本文介绍了一种利用胺反应性蛋白质交联剂结合新型二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）系统，从未经修饰的组织裂解液中稳定并分离天然蛋白质复合物的方法。

摘要

目前已有多种成熟的方法用于纯化和研究单一蛋白质和多肽。然而，大多数细胞功能是由相互作用的蛋白质复合物网络来执行的，这些复合物通常难以研究，因为它们之间的结合是非共价的，容易受到纯化技术的干扰。本文描述了一种利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从未经修饰的组织中稳定并分离天然蛋白质复合物的方法。将组织裂解液加样至非变性的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶上，施加电流使蛋白质在凝胶中迁移一段短距离。随后切下含有迁移后蛋白质的凝胶条，并与胺反应性交联试剂二硫双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（dithiobis(succinimidyl propionate)）孵育，从而共价稳定蛋白质复合物。接着将含有交联复合物的凝胶条嵌入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，实现复合物的完全分离。该方法依赖于大多数分子生物学家所熟悉的实验技术和材料，因此成本低廉且易于掌握。尽管该方法在充分分离极大分子量复合物方面存在局限性，且尚未在所有体系中均获得成功，但它已成功捕获了多种已被深入研究的复合物，预计可广泛适用于多种感兴趣的生物体系。

引言

正常的细胞功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用^1,2。因此，人类疾病通常伴随着各种蛋白质复合物组装和行为的异常³。因此，表征此类相互作用的能力至关重要。目前检测这些相互作用的方法需要纯化目标蛋白质，通常随后通过下拉法捕获其相互作用的伴侣蛋白。传统的纯化方法包括差速离心、沉淀和/或色谱法⁴。这些方法耗时较长，需针对每种目标蛋白质进行条件优化，且常常导致产率较低。现代纯化技术涉及将肽标签与目标蛋白质融合，随后通过免疫沉淀或使用负载有与捕获分子结合的微珠的柱子进行提取^5,6。尽管该方法可广泛应用于多种蛋白质，但它需要对目标蛋白的序列进行修饰，可能导致其与常规结合伴侣之间的亲和力发生变化。由于某些蛋白质-蛋白质相互作用具有高度敏感性，该方法可能不适用于许多情况。此外，用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用图谱的下拉实验可能无法准确反映细胞内的真实情况，原因在于其自由度受限以及诱饵蛋白的表达水平非生理状态。

理想情况下，蛋白质复合物可在其天然状态下被检测，而无需进行纯化或免疫共沉淀。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）作为一种变性程度较低的方法被开发出来，用以替代....

方案

1. 组织制备

1. 配制 10 mL 的 4× BN-PAGE 样品缓冲液（200 mM 双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷（Bis-Tris）、200 mM NaCl、40% w/v 甘油、0.004% 丽春红 S、pH 7.2）。
   注意：该储备液可预先配制，并于 4 °C 保存。
2. 将 250 µL 的 4× 样品缓冲液加入含 1× 商品化蛋白酶抑制剂混合液的 750 µL dH₂O 中进行稀释。涡旋混匀后置于冰上冷却。
3. 取 20 mg 目标组织，用 1 mL 冰冷的 1× BN-PAGE 样品缓冲液，使用干净的 Dounce 匀浆器匀浆 30 次。
   注意：本演示实验中，目标组织为大鼠全脑组织。匀浆后，样品可用温和去垢剂（如 2% 洋地黄皂苷）处理，以溶解膜蛋白并使其适用于电泳。
4. 将匀浆液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 14,000 × g 离心 30 分钟，以沉淀不溶性细胞成分。离心后，将上清液小心倾入置于冰上的洁净离心管中。
5. 按照制造商说明，使用二辛可宁酸（BCA）或其他类似的蛋白质定量检测方法测定上清液中的蛋白质浓度。
6. 如果匀浆样品中含有去垢剂，则加入适量的 5% 考马斯亮蓝 G-250 水溶液，使匀浆液中最终考马斯亮蓝浓度达到 0.25%。

2. BN-PAGE

结果

在本演示实验中，对大鼠全脑裂解液进行了多聚体聚丙烯酰胺凝胶电泳（multimer-PAGE）。将分离后的蛋白质转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，随后使用已知可形成复合物的蛋白质抗体进行探针检测。图1通过两种方式验证了该实验方案的有效性。首先，我们证明了交联的蛋白质可通过添加还原剂进行切割，表明所观察到的高分子量条带是由交联试剂形成的，而非实验方案中其他组分所致（图1A）。其次，我们证明了交联反应对去垢剂的添加敏感（图1B），表明该交联特异性针对蛋白复合物，且在凝胶中因空间邻近而产生的非特异性反应被降至最低。图2表明该方法未能捕获呼吸链复合物II，但总体上可广泛适用于捕获可溶性及膜结合的蛋白复合物。

讨论

蛋白质相互作用对生物体执行的每一项任务都至关重要，因此成为深入研究和广泛关注的课题。Multimer-PAGE 是一种用于捕获、分离和分析多种蛋白质复合物的新型方法。我们此前已证明该方法适用于研究与疾病相关的蛋白 α-突触核蛋白的寡聚化过程¹¹。然而，如图2所示，该方法可广泛应用于多种蛋白质复合物的研究。与其他研究蛋白质复合物的方法相比，Multimer-PAGE 具有操作简便、耗时短的优势。从组织样本到完成 SDS 凝胶电泳分离的整个过程大约仅需 8 小时。由于检测可通过常规 Western 印迹法完成，因此该方案可直接用于未经修饰的组织裂解液，其检测灵敏度远高于pull-down实验。此外，大多数设备齐全的分子生物学实验室均可在几乎无需额外投入的情况下开展该技术。正如后文所述，Multimer-PAGE 的主要挑战通常在于针对每一种研究的蛋白质复合物进行方法的故障排查与优化。

尽管多聚体PAGE技术对大多数分子生物学家而言是可及的，但其成功与否取决于研究人员的技术水平和经验。关键步骤在于，必须小心.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
ε-氨基己酸	Sigma	A2504
丙烯酰胺	Acros Organics	164855000	有毒。
丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1（40%T 储存液）	BioRad	161-0148	有毒。
过硫酸铵	Sigma	A3678
山羊抗兔 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
双辛可宁酸蛋白定量试剂盒	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
丁醇	Fisher Scientific	A399-1
化学发光底物试剂盒	ThermoFisher	24078
考马斯亮蓝 G-250	Sigma-Aldrich	B0770
皂苷	Sigma	D141	有毒。
二甲基亚砜	Fisher Scientific	D128-1
二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)	Thermo Scientific	22585
脱脂奶粉	LabScientific	M0841
甘油	Sigma	G9012
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-5
Halt 蛋白酶抑制剂混合物	Thermofisher	78430
盐酸	Fisher Scientific	A144SI-212	用于滴定。腐蚀性。
甲醇	Fisher Scientific	A412-4	用于 PVDF 膜活化。有毒。
兔源单克隆抗 α-突触核蛋白 IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-四甲基乙二胺	Sigma	T9281
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺	Acros Organics	16479	有毒。
NP40	Boston Bioproducts	P-872
聚山梨酯 20（Tween-20）	Fisher Scientific	BP337-500
聚偏二氟乙烯转印膜	Thermo Scientific	88518
丽春红 S	Sigma	P3504
氯化钾	Fisher Scientific	P217-3
磷酸二氢钾	Sigma	P9791
蛋白酶抑制剂混合物	Thermo Scientific	88265
SDS 溶液（10% w/v）	BioRad	161-0416
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
十二烷基硫酸钠	Sigma	L37771
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl（0.5 M 缓冲液，pH 6.8）	BioRad	161-0799
Tris-HCl（1.5 M 缓冲液，pH 8.8）	BioRad	161-0798
名称	公司	目录编号	备注
仪器
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ 软件	NIH
Synergy H1 微孔板读数仪	BioTek
Gel Former + 支架	Biorad
Microfuge 22R 离心机	Beckman Coulter
2 mL 玻璃匀浆器
涡旋混合器	Fisher Scientific
超声组织匀浆器	Fisher Scientific	FB120220