多聚-PAGE:生物样品中的用于拍摄方法和解决蛋白复合体

Summary

一种用于稳定和使用胺反应性蛋白交联剂偶联到一种新颖的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的方法（PAGE）系统被呈现。

Abstract

有许多用于净化和研究单个蛋白质和肽发达的方法。然而，大多数的细胞功能是由相互作用的蛋白复合物的网络，这往往是难以调查，因为它们的结合是非共价的，并通过纯化技术容易扰动进行。这项工作描述了稳定剂和使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从未经修饰的组织分离天然蛋白质复合物的方法。组织裂解液加载到非变性蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶，然后施加电电流，直到蛋白质迁移的短距离到凝胶。然后将含有已迁移蛋白质凝胶条带切出，并与该胺反应性交联剂二硫代双（丙酸琥珀酰亚胺酯），其共价稳定的蛋白复合物一起温育。然后将含有交联复合物的凝胶条带浇注成十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，和叔他配合是完全分开的。该方法依赖于技术和最熟悉的分子生物学家的材料，这意味着它是价格低廉，简单易学。虽然在其充分分离非常大的复合能力是有限的，并没有受到普遍成功，该方法能够捕捉各种充分研究的复合物，并有可能适用于许多感兴趣的系统。

Introduction

正常细胞功能是依赖于蛋白质-蛋白质相互作用^1,2。其结果是，人类疾病通常是由在不同的蛋白质复合物³的组件和行为的扰动标记。表征这种相互作用的能力因此，至关重要。检测这些相互作用电流的装置需要的靶蛋白，通常随后通过相互作用配偶的下拉的纯化。常规纯化通过差速离心，沉淀和/或色谱法⁴来实现的。这些方法是耗时的，必须改变用于每个靶蛋白，并经常导致低的产率。现代纯化方法涉及肽标签融合到靶蛋白，随后通过免疫沉淀或萃取上装载有结合于捕获分子⁵珠粒柱^，"> 6，虽然这是可扩展到许多蛋白质，这需要目标的序列修饰，潜在地导致在亲和力差异，它们通常的结合配偶体的构建体。一些蛋白质-蛋白质相互作用的微妙特性意味着这种方法可能不适用许多方案。另外，用于映射蛋白质 - 蛋白质相互作用的下拉测定法可以不捕获准确蜂窝图片，由于受限制的自由度和诱饵蛋白的非天然的水平。

理想情况下，蛋白复合物能够在他们的原生状态进行检测，而不需要净化或下拉。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）被开发作为变性少替代十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并允许某些蛋白质和复合物从生物样品

Protocol

1.组织制备

1. 制备4×BN-PAGE样品缓冲液（200mM双（2-羟乙基）氨基 - 三（羟甲基）甲烷（的Bis-Tris），200mM的氯化钠，40％w / v的甘油，0.004％丽春红S，pH为7.2的10毫升）。
   注意:此储备溶液可以预先制成，并储存在4℃。
2. 稀释4倍的样品缓冲液的250μL750μL卫生署₂含有1x商业蛋白酶抑制剂混合物O操作。涡和冰中冷却。
3. 均质化20毫克目标组织的在用干净的Dounce匀浆的30个行程1个毫升1X冰冷BN-PAGE样品缓冲液中。
   注:对于这个演示实验中，目标组织是整个大鼠脑组织。均化后，样品可以用温和的去污剂如2％毛地黄皂苷处理以溶解和允许膜蛋白的电泳。
4. 转移匀浆到1.5mL微量离心管中，并离心以14,000×g离心30分钟以沉淀不溶细胞内容物。 AFTEř离心，倒出上清液到在冰上干净的管中。
5. 遵循制造商的说明书使用二辛可宁酸（BCA）或类似的蛋白定量测定法来测量上清液蛋白质浓度。
6. 如果匀浆样品（一个或多个）含有的洗涤剂，在水溶液中足以使匀浆溶液至0.25％考马斯添加5％考马斯蓝G-250的量。

2. BN-PAGE

1. 稀释25毫升20×蓝色天然（BN）电泳缓冲液的库存（1.0M的Bis-Tris，1.0M甘氨酸，pH6.8）中为4....

Results

在这个演示实验，多聚-PAGE是在整个大鼠脑裂解液进行。将所得的分离的蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后用针对已知能形成复合物的蛋白质的抗体进行探测。 图1示出了通过两种方式的协议的验证。首先，我们表明，交联的蛋白是可裂解通过加入还原剂的，这意味着所观察到的较高分子量的物质通过交联试剂形成，并且不是由于协议（ 图1A）的任何其它部件。第二，我们表明，交联是除了去污剂（ 图1B）的敏感，这意味着交联是特定于复合的蛋白质和，由于关闭凝胶上接近随机的反应性最小化。 图2表明，该方法未能捕捉RESPiratory复合物II，但除此之外，具有用于捕获可溶性和膜结合的复合物广泛的适用性。

Discussion

蛋白质 - 蛋白质相互作用是每个任务万物开展重要。正因为如此，他们是严格审查和研究的课题。多聚-PAGE是用于捕获，分离，和分析广泛的蛋白复合物的新方法。之前我们已经证实其适用于研究疾病相关蛋白α突触核蛋白¹¹ oligimerization。然而，它是可扩展到许多蛋白复合物，如在图2证实。当与学习蛋白复合物的其他方法，多聚-PAGE是因为它的简单和简洁的是有利的。从组织样本的时间完全分离SDS凝胶为约8小时。由于检测可以通过典型的免疫印迹来完成，该协议可以在未修饰的组织裂解液中进行，以检测限比用下拉实验相关联的那些低得多。此外，装备精良的大多数分子生物学拉博斋戒者将能够以很少的前期投资进行这项技术。如稍后讨论的，与多聚体PAGE相关联的大多数挑战来自于对所研究的每种蛋白质复合物的方法进行故障排除和优化。

尽管多分子生物学家可以访问多聚片段，但其成功取决于研究者的技能和经验。重要的是，必须小心地将BN凝胶条切割并重新投入新的SDS凝胶。重要的是使凝胶条定向，使电泳使蛋白质以平行条带迁移到SDS凝胶中。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>化学品
&ε;-氨基己酸	Sigma	A2504
丙烯酰胺	Acros 有机物	164855000	毒性。
丙烯酰胺/比沙克酰胺 37.5：1 （40%T 储备液）	BioRad	161-0148	毒性。
过硫酸铵	Sigma	A3678
来自山羊的抗兔 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
二辛可宁酸检测试剂盒	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
丁醇	Fisher Scientific	A399-1
化学发光底物试剂盒	ThermoFisher	24078
考马斯蓝 G-250	Sigma-Aldrich	B0770
洋地黄黄皂	Sigma	D141	有毒。
二甲基亚砜	Fisher Scientific	D128-1
二硫双双（琥珀酰亚胺丙酸酯）	Thermo Scientific	22585
干脱脂牛奶	LabScientific	M0841
甘油	Sigma	G9012
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-5
Halt 蛋白酶抑制剂混合物	Thermofisher	78430
盐酸	Fisher Scientific	A144SI-212	用于滴定。苛性。
甲醇	Fisher Scientific	A412-4	用于 PVDF 膜活化。有毒。
来自兔子的单克隆抗 &α;-突触核蛋白 IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺	Sigma	T9281
N，N'-亚甲基双丙烯酰胺	Acros Organics	16479	毒性。
NP40	波士顿生物制品	P-872
聚山梨醇酯 20 （吐温-20）	Fisher Scientific	BP337-500
聚偏二氟乙烯转印膜	Thermo Scientific	88518
丽春红 S	Sigma	P3504
氯化钾	Fisher Scientific	P217-3
磷酸钾二元	Sigma	P9791
蛋白酶抑制剂混合物	Thermo Scientific	88265
SDS 溶液（10% w/v）	BioRad	161-0416
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
十二烷基硫酸钠	Sigma	L37771
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl（0.5 M 缓冲液，pH 值 6.8）	BioRad	161-0799
Tris-HCl（1.5 M 缓冲液，pH 值 8.8）	BioRad	161-0798
名称	Company	货号	注释
仪器
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ 软件	NIH
Synergy H1 酶标仪	BioTek
凝胶形成器 + 支架	Biorad
Microfuge 22R 离心机	Beckman Coulter
2 mL dounce 均质器
涡旋混合器	Fisher Scientific
组织匀浆器	Fisher Scientific	FB120220