方法文章

多聚体-PAGE：一种用于捕获和解析生物样品中蛋白质复合物的方法

10.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55341

⸱

2017年5月5日

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用胺反应性蛋白质交联剂结合新型二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）系统，从未经修饰的组织裂解液中稳定并分离天然蛋白质复合物的方法。

摘要

目前已有多种成熟的方法用于纯化和研究单一蛋白质和多肽。然而，大多数细胞功能是由相互作用的蛋白质复合物网络来执行的，这些复合物通常难以研究，因为它们之间的结合是非共价的，容易受到纯化技术的干扰。本文描述了一种利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从未经修饰的组织中稳定并分离天然蛋白质复合物的方法。将组织裂解液加样至非变性的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶上，施加电流使蛋白质在凝胶中迁移一段短距离。随后切下含有迁移后蛋白质的凝胶条，并与胺反应性交联试剂二硫双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（dithiobis(succinimidyl propionate)）孵育，从而共价稳定蛋白质复合物。接着将含有交联复合物的凝胶条嵌入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，实现复合物的完全分离。该方法依赖于大多数分子生物学家所熟悉的实验技术和材料，因此成本低廉且易于掌握。尽管该方法在充分分离极大分子量复合物方面存在局限性，且尚未在所有体系中均获得成功，但它已成功捕获了多种已被深入研究的复合物，预计可广泛适用于多种感兴趣的生物体系。

引言

正常的细胞功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用1,2。因此，人类疾病通常伴随着各种蛋白质复合物组装和行为的异常3。因此，表征此类相互作用的能力至关重要。目前检测这些相互作用的方法需要纯化目标蛋白质，通常随后通过下拉法捕获其相互作用的伴侣蛋白。传统的纯化方法包括差速离心、沉淀和/或色谱法4。这些方法耗时较长，需针对每种目标蛋白质进行条件优化，且常常导致产率较低。现代纯化技术涉及将肽标签与目标蛋白质融合，随后通过免疫沉淀或使用负载有与捕获分子结合的微珠的柱子进行提取5,6。尽管该方法可广泛应用于多种蛋白质，但它需要对目标蛋白的序列进行修饰，可能导致其与常规结合伴侣之间的亲和力发生变化。由于某些蛋白质-蛋白质相互作用具有高度敏感性，该方法可能不适用于许多情况。此外，用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用图谱的下拉实验可能无法准确反映细胞内的真实情况，原因在于其自由度受限以及诱饵蛋白的表达水平非生理状态。

理想情况下，蛋白质复合物可在其天然状态下被检测，而无需进行纯化或免疫共沉淀。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）作为一种变性程度较低的方法被开发出来，用以替代十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），可实现从生物样品中分离部分蛋白质及其复合物7。然而，BN-PAGE 中蛋白质的迁移行为受多种因素影响，包括分子大小、电荷、三维结构以及与其他分子的结合状态。这些因素的相互作用常导致蛋白质共迁移、形成聚集体以及蛋白条带分辨率差等问题。二维天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可解决其中部分但并非全部问题8。

为避免与天然分离相关的复杂性，一些研究者使用胺反应性交联试剂（如二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP））来捕获组织裂解液中的蛋白质复合物4。经此类处理的裂解液随后可进行变性，并通过SDS-PAGE分离，同时保留蛋白质复合物的天然大小和组成。然而，由于交联试剂的反应依赖于分子间的空间 proximity，而组织裂解液中的蛋白质具有多种自由度并可能发生随机相互作用，非特异性背景交联可能较高，尤其是在高浓度样品中。这可能导致结果难以解释。

本文演示了一种称为多聚体-聚丙烯酰胺凝胶电泳（multimer-PAGE）的BN-PAGE/SDS-PAGE杂交方法，用于在复杂混合物中分离和检测蛋白质复合物。首先，将细胞裂解液通过BN-PAGE加载至聚丙烯酰胺凝胶中。含有裂解液的凝胶随后与交联试剂DSP反应。蛋白质在凝胶中呈伪固定化并略微分离，从而显著降低非特异性反应的可能性，即减少了交联剂的背景反应性。交联完成后，将凝胶条带切下，并通过SDS-PAGE进一步分离。所得凝胶可采用任何常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相关的分析方法进行检测。该方法能够在未经修饰的组织裂解液中分离和检测天然状态的蛋白质复合物，无需额外的纯化或免疫共沉淀步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 组织制备

  1. 配制 10 mL 的 4× BN-PAGE 样品缓冲液（200 mM 双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷（Bis-Tris）、200 mM NaCl、40% w/v 甘油、0.004% 丽春红 S、pH 7.2）。
    注意：该储备液可预先配制，并于 4 °C 保存。
  2. 将 250 µL 的 4× 样品缓冲液加入含 1× 商品化蛋白酶抑制剂混合液的 750 µL dH2O 中进行稀释。涡旋混匀后置于冰上冷却。
  3. 取 20 mg 目标组织，用 1 mL 冰冷的 1× BN-PAGE 样品缓冲液，使用干净的 Dounce 匀浆器匀浆 30 次。
    注意：本演示实验中，目标组织为大鼠全脑组织。匀浆后，样品可用温和去垢剂（如 2% 洋地黄皂苷）处理，以溶解膜蛋白并使其适用于电泳。
  4. 将匀浆液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 14,000 × g 离心 30 分钟，以沉淀不溶性细胞成分。离心后，将上清液小心倾入置于冰上的洁净离心管中。
  5. 按照制造商说明，使用二辛可宁酸（BCA）或其他类似的蛋白质定量检测方法测定上清液中的蛋白质浓度。
  6. 如果匀浆样品中含有去垢剂，则加入适量的 5% 考马斯亮蓝 G-250 水溶液，使匀浆液中最终考马斯亮蓝浓度达到 0.25%。

2. BN-PAGE

  1. 将25 mL 20倍浓缩的天然蓝色（BN）电泳缓冲液原液（1.0 M Bis-Tris，1.0 M tricine，pH 6.8）加入含0.002% 考马斯亮蓝的475 mL去离子水（dH2O）中，配制成500 mL的1倍工作浓度运行缓冲液。
    1. 如果样品含有去垢剂，则改为配制250 mL含0.02% 考马斯亮蓝的1倍运行缓冲液和另外250 mL不含染料的1倍运行缓冲液。
  2. 将缓冲液冷却至4 °C。
  3. 根据制造商说明，清洗并组装聚丙烯酰胺凝胶灌注夹具。
  4. 按照标准配方7灌注BN聚丙烯酰胺凝胶（3% T浓缩胶层，6% T分离胶层），并插入加样梳。
  5. 待凝胶聚合完成后，用去离子水（dH2O）冲洗夹具，并根据制造商说明组装电泳装置。
  6. 移除加样梳，并用1倍BN-PAGE运行缓冲液填充加样孔。在上样完成前，避免将内槽完全注满缓冲液。
    1. 如果样品含有去垢剂，则使用含0.02% 考马斯亮蓝的缓冲液填充加样孔。
      注意：步骤2.7–2.9应在4 °C下操作。
  7. 使用凝胶加样枪头，向目标加样孔中加入含有20 µg蛋白质的匀浆液。向未使用的加样孔中加入等体积的1倍BN-PAGE上样缓冲液。
    注意：根据BCA测定结果确定的蛋白浓度，计算需加入加样孔的匀浆液体积。
  8. 上样完成后，向内槽加入1倍BN-PAGE运行缓冲液，确保凝胶完全浸没于缓冲液中。随后，向外部槽中加入1倍运行缓冲液至制造商指定液面高度。
    1. 如果样品含有去垢剂，内槽使用含0.02% 考马斯亮蓝的1倍运行缓冲液，外槽使用无染料的1倍运行缓冲液。
  9. 连接电极至电源，以150 V电压进行电泳，直至染料条带迁移至分离胶层约2 cm处。停止电泳并断开电源。

3. 交联

注意：步骤 3.1-3.6 需在 4 °C 下进行。

  1. 拆卸电泳装置，分离凝胶夹心的玻璃板。移除并弃去浓缩胶层。
  2. 在染料前沿的下边缘下方小心地切割凝胶。注意切口应尽可能平滑且笔直，然后弃去未使用的凝胶部分。这样将留下一条约 2 cm 宽的聚丙烯酰胺凝胶水平条带，其中包含匀浆样品中的全部蛋白质。
  3. 修剪掉凝胶条带边缘未使用的部分。
  4. 小心地将凝胶条放入盛有 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的小容器中，通过温和振荡混合 30 分钟，以达到平衡。
  5. 平衡后，倒掉 PBS 并更换为另 10 mL 新鲜 PBS。加入 500 µL 溶于二甲基亚砜中的 25 mM DSP，继续按上述方式（步骤 3.4）混合 30 分钟。
  6. 倒掉 DSP 溶液。加入 10 mL 含 2% 十二烷基硫酸钠（SDS）的 0.375 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 8.8，以淬灭未反应的 DSP。继续振荡 15 分钟。

4. SDS-PAGE

  1. 在凝胶条淬灭的同时，根据标准方法制备SDS-PAGE凝胶溶液9不要添加聚合试剂。
  2. 淬灭后，将ΒΝ凝胶条恢复至室温，并将其装入新的凝胶板中。
    1. 小心地拿起凝胶，将其放置在干净的凝胶盒间隔板上。
    2. 将胶条方向调整至染料前沿的底部最靠近新胶盒的顶部即，在BN-PAGE中迁移距离最远的一侧应靠近新胶盒的顶部；需将胶条相对于其先前方向翻转。参见 图3.
    3. 将试纸条放置到位，使其上边缘与盖板上边缘的位置平齐（即，它将位于新凝胶的顶部）。确保染料前沿与玻璃板的水平边缘平行。
    4. 将切除的条带一侧紧贴其中一个间隔壁，另一侧留出空间用于倒入凝胶以及上样蛋白标准品或蛋白ladder。
    5. 如果凝胶条的底边存在任何参差不齐或不平整的区域，应小心将其剪除。若不切除，这些区域在灌胶过程中会截留气泡。
    6. 当胶条位置正确后，将盖板覆盖在间隔板上，轻轻按压以排出任何滞留的气泡。
    7. 根据制造商说明继续组装凝胶灌注装置。
  3. 将聚合试剂加入分离胶缓冲液中，用血清移液管将其注入已准备好的胶板中。加胶至比切除的BN-PAGE胶条低约2 cm处，以预留浓缩胶层的空间。
  4. 在灌注的凝胶上层加入100 µL正丁醇，静置30分钟以使分离胶充分聚合。随后倾去正丁醇。
  5. 向浓缩胶溶液中加入聚合试剂。使用刻度移液管将浓缩胶溶液倒入凝胶板中，直至填满凝胶板内所有剩余空间。
    1. 倾倒浓缩胶时倾斜胶板，使其充满胶条下方的空间，避免产生气泡。
    2. 当浓缩胶缓冲液填充凝胶条下方的空隙时，逐渐将凝胶板恢复至水平位置。
    3. 继续用浓缩胶缓冲液填充切下的胶条旁边的空隙，直至接近溢出。
  6. 让浓缩胶室温静置聚合30分钟。
    注意：在凝胶聚合的同时配制 10× SDS-PAGE 电泳缓冲液（250 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、1.9 M 甘氨酸、1% SDS）。该缓冲液也可提前配制并室温保存。
  7. 将50 mL 10X SDS-PAGE电泳缓冲液储备液稀释至450 mL dH₂O中2O 以配制 1x 工作缓冲液。
  8. 凝胶浓缩层聚合后，将凝胶板从灌胶装置中取出，用去离子水冲洗2O，并根据制造商说明组装电泳装置。
  9. 用1× SDS-PAGE电泳运行缓冲液完全填充内室，然后将外室加液至制造商指定的液面高度。
  10. 在切除的胶条旁边加样孔中加入分子量标记物或适当的蛋白质标准品。
  11. 将电极连接至电源，以120 V电压进行电泳。当考马斯亮蓝染料跑出凝胶时，停止电泳并断开电源。
  12. 使用标准的电转印和抗体结合蛋白检测方法分析凝胶10.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在本演示实验中，对大鼠全脑裂解液进行了多聚体PAGE电泳。分离后的蛋白质被转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，随后使用针对已知可形成复合物的蛋白质的抗体进行探针检测。图1通过两种方式验证了该实验方案的有效性。首先，我们证明了交联的蛋白质可通过添加还原剂进行切割，表明所观察到的高分子量条带是由交联试剂形成的，而非实验方案中其他组分所致（图1A）。其次，我们证明了交联反应对去垢剂的添加敏感（图1B），表明交联特异性地针对复合物中的蛋白质，且在凝胶中因空间邻近而产生的非特异性反应被最小化。图2表明该方法无法捕获呼吸链复合物II，但总体上适用于捕获可溶性及膜结合型蛋白复合物。

figure-results-1
图...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

蛋白质相互作用对生物体执行的每一项任务都至关重要，因此成为深入研究和广泛关注的课题。Multimer-PAGE 是一种用于捕获、分离和分析多种蛋白质复合物的新型方法。我们此前已证明该方法适用于研究与疾病相关的蛋白 α-突触核蛋白的寡聚化过程11。然而，如图2所示，该方法可广泛应用于多种蛋白质复合物的研究。与其他研究蛋白质复合物的方法相比，Multimer-PAGE 具有操作简便、耗时短的优势。从组织样本到完成 SDS 凝胶电泳分离的整个过程大约仅需 8 小时。由于检测可通过常规 Western 印迹法完成，因此该方案可直接用于未经修饰的组织裂解液，其检测灵敏度远高于pull-down实验。此外，大多数设备齐全的分子生物学实验室均可在几乎无需额外投入的情况下开展该技术。正如后文所述，Multimer-PAGE 的主要挑战通常在于针对每一种研究的蛋白质复合物进行方法的故障排查与优化。

尽管多聚体PAGE技术对大多数分子生物学家而言是可及的，但其成功与否取决于研究人员的技术水平和经验。关键步骤在于，必须小心...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

由美国国立卫生研究院/国家药物滥用研究所（NIH/NIDA DA034783）资助。感谢Bryan A. Killinger在多聚体PAGE实验中的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
ε-氨基己酸SigmaA2504
丙烯酰胺Acros Organics164855000有毒。
丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1（40%T 储存液）BioRad161-0148有毒。
过硫酸铵SigmaA3678
山羊抗兔 IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
双辛可宁酸蛋白定量试剂盒Thermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
牛血清白蛋白SigmaA9647
丁醇Fisher ScientificA399-1
化学发光底物试剂盒ThermoFisher24078
考马斯亮蓝 G-250Sigma-AldrichB0770
皂苷SigmaD141有毒。
二甲基亚砜Fisher ScientificD128-1
二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)Thermo Scientific22585
脱脂奶粉LabScientificM0841
甘油SigmaG9012
甘氨酸Fisher ScientificBP381-5
Halt 蛋白酶抑制剂混合物Thermofisher78430
盐酸Fisher ScientificA144SI-212用于滴定。腐蚀性。
甲醇Fisher ScientificA412-4用于 PVDF 膜活化。有毒。
兔源单克隆抗 α-突触核蛋白 IgGSanta Cruz Biotechnologysc-7011-R
N,N,N',N'-四甲基乙二胺SigmaT9281
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺Acros Organics16479有毒。
NP40Boston BioproductsP-872
聚山梨酯 20（Tween-20）Fisher ScientificBP337-500
聚偏二氟乙烯转印膜Thermo Scientific88518
丽春红 SSigmaP3504
氯化钾Fisher ScientificP217-3
磷酸二氢钾SigmaP9791
蛋白酶抑制剂混合物Thermo Scientific88265
SDS 溶液（10% w/v）BioRad161-0416
氯化钠Fisher ScientificBP358-212
十二烷基硫酸钠SigmaL37771
磷酸二氢钠Fisher ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Tris 碱Fisher ScientificBP152-500
Tris-HCl（0.5 M 缓冲液，pH 6.8）BioRad161-0799
Tris-HCl（1.5 M 缓冲液，pH 8.8）BioRad161-0798
名称公司目录编号备注
仪器
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
ImageJ 软件NIH
Synergy H1 微孔板读数仪BioTek
Gel Former + 支架Biorad
Microfuge 22R 离心机Beckman Coulter
2 mL 玻璃匀浆器
涡旋混合器Fisher Scientific
超声组织匀浆器Fisher ScientificFB120220

参考文献

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  3. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
  4. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
  5. Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  7. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  8. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
  11. Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
  12. Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314(2013).
  13. Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
  14. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  15. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
  16. Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
  17. Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
  18. Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
  19. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PAGE SDS PAGE DSP

相关文章