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用于生物医学应用的仿生纳米羟基磷灰石快速混合法制备

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DOI：

10.3791/55343

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2017年2月23日

 ,  ,  , 
1Bioengineering and Healthcare Technologies, School of Clinical Dentistry, University of Sheffield

本文内容

摘要

本文介绍了一种快速制备高质量仿生纳米羟基磷灰石的新方法。该生物材料在骨科、颅面外科和牙科等临床应用领域的多种创新医疗器械制造中具有重要意义。

摘要

羟基磷灰石（HA）因其良好的生物相容性和骨传导性，已被广泛用作医用陶瓷材料。近年来，人们对仿生纳米级羟基磷灰石（nHA）的应用产生了浓厚兴趣。然而，已知生物磷灰石具有钙缺乏、碳酸根取代的特征，并呈现纳米级片状形貌。由于仿生nHA在矿物组成上与骨组织和牙釉质相似，因此有望促进最佳的骨组织再生。目前在实验室和商业化生产中制备nHA的许多方法通常涉及耗时较长的工艺和复杂的设备。因此，本研究旨在开发一种快速且可靠的高质量仿生nHA制备方法。所开发的快速混合法基于氢氧化钙与磷酸之间的酸碱反应。简而言之，将磷酸溶液倒入氢氧化钙溶液中，随后进行搅拌、洗涤和干燥。部分产物在1,000 °C下烧结2小时，以考察其高温稳定性。X射线衍射分析表明成功形成了HA，并在高温处理后发生热分解生成β-磷酸三钙，这是钙缺乏型HA的典型特征。傅里叶变换红外光谱显示沉淀产物中存在碳酸根基团。nHA颗粒的长径比较低，尺寸约为50 × 30 nm，接近生物磷灰石的尺寸。该材料亦呈钙缺乏状态，Ca:P摩尔比为1.63，与生物磷灰石类似，低于化学计量比HA的1.67。因此，这一新方法是一种可靠且更为便捷的仿生nHA制备工艺，避免了长时间滴定和复杂设备的需求。所得仿生HA产品适用于多种医疗及消费健康领域。

引言

为了提高患者的生活质量并减轻全球人口老龄化带来的医疗负担，临床上迫切需要具有增强功能的先进生物材料。多年来，由于羟基磷灰石具有良好的生物相容性，已被广泛应用于医学领域。近年来，人们对纳米级羟基磷灰石（nHA）的应用兴趣日益增加，尤其是在医学和牙科领域的矿化组织再生中。骨骼和牙釉质中的天然矿物是缺钙、多元素取代的纳米级羟基磷灰石。据估计，生物nHA片状晶体的尺寸约为50 nm × 30 nm × 2 nm1，而在未成熟骨组织中还存在更小的结构2。相比之下，牙釉质中的矿物在长度和宽度上均比骨组织中的矿物大10至100倍3,4。合成的nHA或许更应被称为“仿生”而非“仿真的”，因为我们旨在将对天然材料特性的观察转化为性能更优的医疗技术。有研究指出，由于仿生nHA与天然存在的矿物更为相似，因此在骨和牙组织再生应用中可能更具优势5。

已有多种方法被报道用于制备纳米羟基磷灰石（nHA），包括水热法6、喷雾干燥法7和溶胶-凝胶法8。其中，湿法沉淀法被认为是制备nHA相对简便的方法。已发表的nHA湿法沉淀工艺通常在混合钙源和磷源化学前驱体时包含滴定步骤9,10,11,12,13,14。然而，这些方法存在若干缺点，包括过程耗时且复杂，在某些情况下还需使用昂贵的设备。商业化生产可能更为复杂，专利中描述了用于制造高质量医用级nHA的复杂反应器15。尽管如此，氢氧化钙与磷酸之间的中和反应仍具优势，因其不产生有毒化学副产物。

已有研究报道了缓慢滴定反应中工艺条件与nHA产物形貌之间的关系。具体而言，在使用氢氧化钙和磷酸的滴定方法中，较高的反应温度似乎有利于制备低长径比的颗粒13。Gentile et al.16 在该领域进行了显著拓展，系统阐明了多种制备方法中温度及其他工艺条件对nHA产品质量的影响。他得出结论：Prakash13 提出的湿化学沉淀法可制得质量最高的nHA产物，但需注意的是，该结果依赖于技术上较难控制且耗时较长的混合过程。原始的Prakash滴定步骤耗时超过一小时。然而，对于更大批次的制备，可能需要更长的滴定时间。

综上所述，尽管包括温度在内的多种因素的影响目前已得到广泛研究，但几乎无人关注如何降低基于滴定方法的复杂性及其所需的相关时间。因此，本研究旨在探讨采用快速混合方法制备仿生纳米羟基磷灰石（nHA）的效果，并对所得材料进行全面表征。若成功实现，这种简化的快速混合方法将为实验室研究人员和工业界带来显著益处，可在不牺牲质量的前提下大幅降低生产成本。

方案

纳米羟基磷灰石合成示意图；磁力搅拌、烧结；化学处理步骤。
图1. 生物仿生纳米羟基磷灰石快速混合制备的示意图。将磷酸溶液倒入氢氧化钙悬浮液中。悬浮液静置过夜后，纳米羟基磷灰石（nHA）用去离子水洗涤，随后在60至80°C下干燥。然后将nHA在玛瑙研钵中研磨，并进行烧结以研究其热稳定性。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 纳米级羟基磷灰石的快速混合法制备

  1. 制备钙和磷溶液，以钙磷摩尔比为1.67的比例制备5 g纳米级羟基磷灰石。
    1. 将3.705 g氢氧化钙加入500 mL去离子水中，并在磁力搅拌器上以400 rpm的速度搅拌1小时。
    2. 在另一个烧杯中，将3.459 g磷酸（85%）溶于250 mL去离子水中。
  2. 以约100 mL/s的速度将磷溶液倒入正在搅拌的氢氧化钙悬浮液中。用Parafilm（Bemis, USA）封住烧杯口。
  3. 让悬浮液在400 rpm下继续搅拌1小时。
  4. 将烧杯从搅拌器上取下，静置过夜。
  5. 通过倾倒上清液并加入500 mL去离子水，在400 rpm下搅拌1分钟来洗涤悬浮液。总共重复此步骤三次，每次洗涤间隔2小时。
  6. 让nHA悬浮液静置过夜沉淀。
  7. 倒去澄清的上清液，将沉淀的nHA悬浮液置于设定温度为60至80 °C的干燥烘箱中。
  8. 干燥后，将干燥的nHA放入玛瑙研钵中研磨至细粉状。
  9. 取2.5 g制得的nHA粉末放入氧化铝坩埚中，以10 °C/min的升温速率在1,000 °C下烧结2小时。热处理完成后，让nHA在炉内自然冷却。
  10. 将粉末储存在真空干燥器中。

2. 纳米级羟基磷灰石的表征

  1. 透射模式衍射仪的X射线衍射（XRD）
    1. 取少量（即 小于 200 µL聚乙烯醇（PVA）胶水在醋酸纤维膜上的用量及与少量（即 少于100 mg的nHA粉末。
    2. 用热风枪吹至干燥。
    3. 将样品装入样品架，并置于透射模式X射线衍射仪中，使用Cu Kα 辐射
    4. 使用衍射仪参数：40 kV、35 mA，2θ 范围为 10-70°.
    5. 分析所得的XRD图谱。
    6. 使用以下XRD卡片进行物相鉴定：羟基磷灰石：9-432。β-磷酸三钙：04-014-2292。
  2. 透射电子显微镜（TEM）
    1. 取少量粉末（即 将少于10 mg的样品置于离心管中，加入约3 mL乙醇。
    2. 超声处理样品15至30分钟，直至观察到均匀的悬浮液。
    3. 移液少量溶液（即 将少于1 mL的样品滴加到带有碳膜的400目铜网上，自然干燥。
    4. 在80 kV加速电压下对样品进行成像。
  3. 谢菲尔德哈勒姆大学材料与工程研究院（MERI）提供的X射线荧光（XRF）服务
    1. 将0.8 g nHA粉末与8 g四硼酸锂混合。
    2. 在设定为指定温度的炉中，使用铂金合金坩埚熔融混合物 1,200 °C.
    3. 使用XRF光谱仪分析所得样品，以确定样品的元素组成。
  4. 衰减全反射模式傅里叶变换红外光谱法（FTIR-ATR）
    1. 进行64次背景扫描，范围为4,000 - 500 cm⁻¹-1 分辨率为 4 cm-1.
    2. 取少量（即 将少于100 mg的nHA粉末置于衰减全反射模式适配器的钻石表面，用螺帽压紧使其与钻石表面充分接触。
    3. 进行32次扫描，范围为4,000 - 500 cm⁻¹-1 分辨率为 4 cm-1 扣除背景扫描后的样品扫描结果。

结果

XRD图谱（图2) 显示沉淀出纯羟基磷灰石（HA）相，衍射峰较宽，表明结晶粒径相对较小和/或具有非晶态特性。经高温烧结后，检测到β-磷酸三钙（β-TCP）的存在，同时以HA为主晶相。衍射峰变尖锐， 即 半高宽减小表明烧结后晶粒尺寸增大。

X射线衍射图谱，烧结与未烧结样品；衍射峰；材料分析；图表。
图2. 产物的晶相分析。未烧结的纳米羟基磷灰石（nHA）粉末与在1,000 °C下烧结2小时后的nHA粉末的X射线衍射（XRD）图谱。峰标示：▼ 羟基磷灰石峰，■ β-磷酸三钙峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

傅里叶变换红外-衰减全反射光谱（FTIR-ATR）（图3）通过特征性的磷酸盐和羟基吸收峰证实了羟基磷灰石（HA）相的形成17,18。具体峰位归属如下：3,750 cm-1（OH- 伸缩振动 νOH）；1,086 和 1,022 cm-1（PO43- ν3）；962 cm-1（PO43- ν1）；630 cm-1（OH- 摇摆振动 δOH）；600 和 570 cm-1（PO43- ν4）。在未烧结样品中，额外的吸收峰归属如下：约 3,400 cm-1 处的宽峰（吸附水分子）；1,455 和 1,410 cm-1（CO32- ν3）；880 cm-1（CO32- ν2）。未烧结粉末中观察到的吸附水和碳酸根基团在高温烧结过程中被去除。烧结过程还使羟基和磷酸盐吸收峰变得更加尖锐，表现为峰与谷之间的距离增大。

红外光谱图，烧结与未烧结样品；吸收峰：OH⁻, PO₄³⁻, CO₃²⁻。
图3. 产物的红外光谱。未烧结纳米羟基磷灰石（nHA）粉末与在1,000 °C下烧结2小时的nHA粉末的衰减全反射模式傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）。请点击此处查看该图的放大版本。

透射电子显微镜（TEM）图像（图4）显示形成了尺寸约为50 nm × 30 nm的纳米级颗粒。这些颗粒的长宽比（颗粒长度/颗粒宽度）较低，约为1.7。该纳米级产物的尺寸和形状与生物磷灰石相似1。

纳米颗粒形成、透射电镜图像、200 nm 和 100 nm 尺寸对比、材料分析。
图 4. 产物的纳米级形貌。 采用快速混合法制备的纳米羟基磷灰石（nHA）在两种放大倍数下的透射电子显微图像（TEM）。请点击此处查看该图的高清版本。

通过XRF对nHA粉末进行定量化学分析（表1），计算得出钙:磷比为1.63，略低于化学计量比的羟基磷灰石（其钙:磷比为1.67）。XRF结果还显示，nHA产物纯度很高，仅检测到痕量的其他元素。

化合物质量百分比 %
CaO51.52
P2O539.89
MgO0.46
Na2O0.13
Y2O30.07
Al2O30.03
SiO20.03
Mn3O40.03
SrO0.02
TiO20.01

表1. 产物的定量化学分析。 未烧结的nHA粉末的X射线荧光（XRF）分析结果显示其重量纯度>99%。

讨论

天然磷灰石由纳米级的非化学计量型含碳酸根羟基磷灰石颗粒组成，其近似化学式为 Ca10-x-y[(HPO4)(PO4)]6-x(CO3)y(OH)2-x。据报道，制备化学组成与天然矿物相近的生物材料可促进最佳的生物学反应。例如，仿生性缺钙含碳酸根纳米羟基磷灰石的研究表明，其刺激小鼠前成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的能力优于传统的纳米羟基磷灰石19。

本研究中，羟基磷灰石（HA）在 1,000 °C 出现部分热分解现象（图 2），表明形成了缺钙型羟基磷灰石。XRF 数据得到的钙磷比（Ca:P）低于化学计量比（1.63），进一步支持了这一结论（表 1）。已知较低的 Ca:P 比与热稳定性降低相关20,21,22,23。在本方法中，快速加入磷酸溶液使反应悬浮液的 pH 值迅速下降，从而生成 HPO4 离子。HPO4 基团的存在促进了缺钙型羟基磷灰石的沉淀，其分子式为：Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x，其中 0<x<1。

因此，磷酸的快速加入对该反应的沉淀动力学具有显著影响。如前所述，在室温下进行的氢氧化钙与磷酸之间的滴定反应 tends to 产生高长径比的颗粒13。对于涉及这些反应物的滴定反应，必须采用较高的反应温度才能生成长径比较低、更接近生物磷灰石结构的颗粒13。当晶体成核速率慢于晶体生长速率时，会形成高长径比的颗粒24。在本研究开发的新方法中，磷酸溶液的快速加入可能提供了更多的成核位点，从而导致大量小型圆形颗粒的生成，而非数量较少但长径比较大的颗粒。由于作者尚未系统研究将磷酸缓慢倒入氢氧化钙悬浮液中的影响，为获得一致的实验结果，建议磷酸的加入速率应与视频中所示速率相当（约 100 mL/s）。

在本方法的开发过程中，作者基于Prakash的方法对纳米羟基磷灰石（nHA）制备工艺进行了多项渐进式改进研究 等.13 包括对采用缓慢滴定法与快速加入磷酸溶液所制备产物的比较25研究发现，将磷酸缓慢滴加到氢氧化钙悬浮液中会导致产物中残留氢氧化钙。我们推测，磷酸快速加入引起的pH变化促进了氢氧化钙的溶解，从而有利于反应物成功转化为羟基磷灰石。比较在室温和较高温度（60 °C）下采用快速混合方法制备的产物发现，反应完成后较高温度下的产物具有更高的电导率。这表明存在残留的氢氧化钙，可能归因于温度升高时氢氧化钙的溶解度降低。残留氢氧化钙的存在是不利的，因为该化合物的碱性可能影响生物相容性。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测到与羟基磷灰石（HA）相关的特征性磷酸根和羟基官能团活性（图3）。值得注意的是，烧结产物的谱图显示出更尖锐的磷酸根和羟基峰。这些变化与产物结晶度的提高相关26,27。未烧结样品的谱图提供了B型碳酸根取代的证据，即碳酸根离子取代了磷酸根基团。这与A型取代不同，后者是碳酸根离子取代羟基基团17。已有报道指出，生物磷灰石中存在B型碳酸根取代3。然而，Tampieri et al. 报道称，尽管B型取代在年轻骨骼中占主导地位，但在年长个体的骨骼中A型碳酸根取代的比例逐渐增加28。研究发现，碳酸根取代会降低纳米羟基磷灰石（nHA）的结晶度和热稳定性，同时提高其溶解度。这些变化被认为有助于增强含碳酸根取代的HA的生物活性29。此外，已知生物HA还含有X射线荧光分析（XRF）中检测到的其他一些元素（表1），例如镁、钠和锶30。这些元素的存在也可能促进生物功效的提升。未来的研究应致力于制备这些纳米尺度的取代型磷灰石，以及具有更高生物功能性的材料，例如银掺杂的nHA31。为了制备取代型nHA，可在引入目标元素的同时相应减少拟被取代元素的含量，例如在进行锶、镁或锌取代时减少钙化合物的用量32。另一种方法则是添加元素以实现“掺杂”，使离子存在于nHA表面，而不一定将其整合进HA晶体晶格中31。对于本方法的这些改进，可以配制混合溶液（如氢氧化钙与硝酸银），并以与本文所述相同的方式进行反应。

综上所述，本文报道了一种制备仿生纳米羟基磷灰石（nHA）的新型快速且显著改进的方法。该方法中，化学试剂的快速混合耗时不到5秒，与通常需要数小时仔细监测的滴定反应相比，时间显著缩短。由于该方法相对简单且成本较低，相较于目前工业上使用的nHA制造方法具有巨大的生物材料开发应用潜力；现有商业系统的内在复杂性导致研发周期长且生产成本大幅增加。特别是，与连续流动工艺或水热技术相比，这种新方法因设备启动投资要求显著降低而更具优势。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）与Ceramisys有限公司联合资助的CASE研究生奖学金项目支持，并关联于EPSRC医疗设备创新制造中心（MeDe Innovation）[资助编号 EP/K029592/1]。作者还感谢谢菲尔德哈勒姆大学的Robert Burton进行XRF分析。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氢氧化钙（纯度 ≥ 96%）Sigma Aldrich UK31219应始终遵循良好的实验室规范，包括使用适当的个人防护装备。
磷酸（85%）Sigma Aldrich UK345245操作该产品时应佩戴安全护目镜和面罩（详见 Sigma Aldrich 提供的安全数据表以获取更多信息）。
STOE IP X射线衍射仪Phillips
国际衍射数据中心（ICDD）PDF4+ 数据库International Centre for Diffraction Data
300目载网上带孔碳膜Agar ScientificS147-3H 
Tecnai G2 Spirit 透射电子显微镜FEI
四硼酸锂ICPH, Malzéville, France
PW2440 X射线荧光光谱仪 Philips
ThermoScientific Nikolett 光谱仪Unicam Ltd

参考文献

  1. Pasteris, J. D., Wopenka, B., Valsami-Jones, E. Bone and tooth mineralization: why apatite? Elements. 4 (2), 97-104 (2008).
  2. Carter, D. H., Hatton, P. V., Aaron, J. E. The ultrastructure of slam-frozen bone mineral. Histochem. J. 29 (10), 783-793 (1997).
  3. Wopenka, B., Pasteris, J. D. A mineralogical perspective on the apatite in bone. Mater. Sci. Eng. 25 (2), 131-143 (2005).
  4. Boskey, A. L. Mineralization of bones and teeth. Elements. 3 (6), 385-391 (2007).
  5. Fox, K., Tran, P. A., Nhiem, T. Recent Advances in Research Applications of Nanophase Hydroxyapatite. ChemPhysChem. 13 (10), 2495-2506 (2012).
  6. Neira, I. S., et al. An Effective Morphology Control of Hydroxyapatite Crystals via Hydrothermal Synthesis. Cryst. Growth. Des. 9 (1), 466-474 (2009).
  7. Luo, P., Nieh, T. G. Synthesis of ultrafine hydroxyapatite particles by a spray dry method. Mater. Sci. Eng. C. 3 (2), 75-78 (1995).
  8. Wang, F., Li, M. S., Lu, Y. P., Qi, Y. X. A simple sol-gel technique for preparing hydroxyapatite nanopowders. Mater. Lett. 59 (8-9), 916-919 (2005).
  9. Cai, Y., et al. Role of hydroxyapatite nanoparticle size in bone cell proliferation. J. Mater. Chem. 17 (36), 3780-3787 (2007).
  10. Catros, S., et al. Physico-chemical and biological properties of a nano-hydroxyapatite powder synthesized at room temperature. IRBM. 31 (4), 226-233 (2010).
  11. Kumar, R., Prakash, K. H., Cheang, P., Khor, K. A. Temperature driven morphological changes of chemically precipitated hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 20 (13), 5196-5200 (2004).
  12. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta. Biomater. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  13. Prakash, K. H., Kumar, R., Ooi, C. P., Cheang, P., Khor, K. A. Apparent solubility of hydroxyapatite in aqueous medium and its influence on the morphology of nanocrystallites with precipitation temperature. Langmuir. 22 (26), 11002-11008 (2006).
  14. Bianco, A., Cacciotti, I., Lombardi, M., Montanaro, L., Gusmano, G. Thermal stability and sintering behaviour of hydroxyapatite nanopowders. J. Therm. Anal. Calorim. 88 (1), 237-243 (2007).
  15. Brito Lopes, J. C., et al. Production method for calcium phosphate nano-particles with high purity and their use. WO2008/007992A2. , (2008).
  16. Gentile, P., Wilcock, C. J., Miller, C. A., Moorehead, R., Hatton, P. V. Process optimisation to control the physico-chemical characteristics of biomimetic nanoscale hydroxyapatites prepared using wet chemical precipitation. Materials. 8 (5), 2297-2310 (2015).
  17. Gibson, I. R., Bonfield, W. Novel synthesis and characterization of an AB-type carbonate-substituted hydroxyapatite. J. Biomed. Mater. Res. 59 (4), 697-708 (2002).
  18. Koutsopoulos, S. Synthesis and characterization of hydroxyapatite crystals: a review study on the analytical methods. J. Biomed. Mater. Res. 62 (4), 600-612 (2002).
  19. Deng, Y., Sun, Y., Chen, X., Zhu, P., Wei, S. Biomimetic synthesis and biocompatibility evaluation of carbonated apatites template-mediated by heparin. Mater. Sci. Eng. C.-Mater. Biol. Appl. 33 (5), 2905-2913 (2013).
  20. Gibson, I. R., Rehman, I., Best, S. M., Bonfield, W. Characterization of the transformation from calcium-deficient apatite to beta-tricalcium phosphate. J. Mater. Sci.-Mater. M. 11 (9), 533-539 (2000).
  21. Siddharthan, A., Seshadri, S. K., Kumar, T. S. S. Microwave accelerated synthesis of nanosized calcium deficient hydroxyapatite. J. Mater. Sci.-Mater. M. 15 (12), 1279-1284 (2004).
  22. Yubao, L., Klein, C., Dewijn, J., Vandemeer, S., Degroot, K. Shape change and phase-transition of needle-like nonstoichiometric apatite crystals. J. Mater. Sci.-Mater. M. 5 (5), 263-268 (1994).
  23. Prieto Valdes, J. J., Ortiz Lopez, J., Rueda Morales, G., Pacheco Malagon, G., Prieto Gortcheva, V. Fibrous growth of tricalcium phosphate ceramics. J. Mater. Sci.-Mater. M. 8 (5), 297-301 (1997).
  24. Bouyer, E., Gitzhofer, F., Boulos, M. I. Morphological study of hydroxyapatite nanocrystal suspension. J. Mater. Sci.-Mater. M. 11 (8), 523-531 (2000).
  25. Wilcock, C. J. The development of nanostructured calcium phosphate biomaterials for bone tissue regeneration PhD thesis. , University of Sheffield. (2015).
  26. Khalid, M., et al. Effect of surfactant and heat treatment on morphology, surface area and crystallinity in hydroxyapatite nanocrystals. Ceram. Int. 39 (1), 39-50 (2013).
  27. Reyes-Gasga, J., et al. XRD and FTIR crystallinity indices in sound human tooth enamel and synthetic hydroxyapatite. Mater. Sci. Eng. C.-Mater. Biol. Appl. 33 (8), 4568-4574 (2013).
  28. Tampieri, A., Celotti, G., Landi, E. From biomimetic apatites to biologically inspired composites. Anal. Bioanal. Chem. 381 (3), 568-576 (2005).
  29. Boanini, E., Gazzano, M., Bigi, A. Ionic substitutions in calcium phosphates synthesized at low temperature. Acta. Biomater. 6 (6), 1882-1894 (2010).
  30. Elliott, J. C. Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates. , 2 edn, Elsevier. 260(1994).
  31. Wilcock, C. J., et al. Preparation and Antibacterial Properties of Silver-doped Nanoscale Hydroxyapatite Pastes for Bone Repair and Augmentation. J. Biomed. Nanotechnol. , in press (2017).
  32. Cox, S. C., Jamshidi, P., Grover, L. M., Mallick, K. K. Preparation and characterisation of nanophase Sr, Mg, and Zn substituted hydroxyapatite by aqueous precipitation. Mater. Sci. Eng. C. 35, 106-114 (2014).

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