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方法文章

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

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DOI：

10.3791/55345

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2019年1月7日

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。

摘要

免疫突触是T细胞与抗原呈递细胞（APCs）之间进行通讯的区域。T细胞将表面受体和蛋白质极化至免疫突触，以确保稳定的结合和信号交换。传统共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）或超分辨率显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动采集图像并进行耗时的定量分析，因此对稀有事件的成像具有挑战性。本文中，我们描述了一种可实现数万个细胞形态学分析的工作流程。免疫突触的形成发生于全白细胞制备物中的原代人T细胞与 金黄色葡萄球菌 载有肠毒素B（SEB）的Raji细胞作为抗原呈递细胞（APCs）。图像采集采用成像流式细胞术（也称为In-Flow显微镜），该技术结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特性。文中提供了完整的设门策略，用于识别T细胞与抗原呈递细胞的结合体并分析免疫突触。由于该工作流程可在未纯化的全白细胞样本中分析免疫突触，因此仅需少量血液样本（即, 1 mL），可将其应用于患者样本。重要的是，可同时制备、测量和分析多个样本。

引言

T细胞是适应性免疫系统的主要调节者，通过主要组织相容性复合体（MHC）呈递的抗原肽被激活。T细胞的完全激活需要两个信号：一是通过抗原特异性的T细胞受体（TCR）/CD3复合物传递的能力信号，二是通过辅助受体传递的共刺激信号。这两个信号均通过T细胞与抗原呈递细胞（APC）的直接相互作用而产生。成熟的APC通过MHC-肽复合物为T细胞激活提供能力信号，并表达共刺激配体（例如, CD80 或 CD86）以确保T细胞活化的进程1共刺激的一个重要功能是重组肌动蛋白细胞骨架2,3,4静息T细胞中的皮层F-actin相对稳定。通过携带抗原的抗原提呈细胞（APCs）刺激T细胞，可引起肌动蛋白细胞骨架的显著重排。肌动蛋白动态变化（即, 快速的肌动蛋白聚合/解聚循环使T细胞能够产生用于运输蛋白质或细胞器等物质的作用力。此外，肌动蛋白细胞骨架对于T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间形成一种称为免疫突触的特殊接触区域至关重要。由于肌动蛋白细胞骨架在免疫突触中的重要作用，开发用于量化T细胞肌动蛋白细胞骨架变化的方法已成为必要。5,6,7,8,9.

通过肌动蛋白细胞骨架的协助，表面受体和信号蛋白在免疫突触内的超分子活化簇（SMACs）中被分隔开来。免疫突触的稳定性由受体与F-肌动蛋白束的结合来维持，这种结合增强了肌动蛋白细胞骨架的弹性。研究表明，免疫突触的形成对于适应性免疫应答的产生至关重要。免疫突触形成缺陷在体内的有害影响最早在患有Wiskott-Aldrich综合征（WAS）的患者中被发现，该疾病中肌动蛋白聚合以及随之而来的免疫突触形成均受到干扰10。WAS患者可能出现湿疹、严重反复感染、自身免疫性疾病以及黑色素瘤。尽管已有上述发现，目前尚不清楚健康个体与患有免疫缺陷或自身免疫性疾病的患者之间，其T细胞的免疫突触形成是否存在差异。

荧光显微镜技术，包括共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）以及超分辨率显微镜，已被用于揭示免疫突触的结构11,12,13,14。这些系统具有高分辨率，并可实现活细胞成像，从而能够获取免疫突触中肌动蛋白细胞骨架以及细胞表面或细胞内蛋白的精确时空信息。然而，许多研究结果仅基于对数十个T细胞的分析。此外，此类荧光显微镜实验必须使用纯化的T细胞。但对于许多研究问题而言，使用未纯化细胞的重要性远高于追求尽可能高的分辨率。这一点在分析患者来源的T细胞时尤为相关，因为捐献的血样量有限，且可能需要同时处理大量样本。

我们建立了可在人体系统中分析免疫突触内肌动蛋白细胞骨架的显微技术15,16,17。这些方法基于成像流式细胞术，也称为流内显微技术18。作为一种多光谱流式细胞术与荧光显微镜的结合技术，成像流式细胞术在分析异质性细胞群体（例如外周血中的泛白细胞）的形态学参数和蛋白质定位方面具有显著优势。我们此前提出了一种方法，能够直接利用全血样本中的人T细胞，定量分析T细胞与抗原呈递细胞（APC）形成的共轭结构中的F-肌动蛋白，而无需耗时且昂贵的细胞纯化步骤17。本文所展示的技术涵盖了从采集血液样本到定量免疫突触中F-肌动蛋白的完整实验流程。

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方案

1. 全白细胞的制备

  1. 使用肝素化注射器从健康供体（或患者）抽取 1 mL 外周血。确保已获得相关伦理委员会对献血的批准。
  2. 在 50 mL 离心管中，将 1 mL 人外周血与 30 mL ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3 和 0.1 mM EDTA，pH 7.0）混合，并在室温下孵育 8 分钟。
  3. 用 PBS 注满离心管，以 300 x g 离心 6 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 30 mL ACK 裂解缓冲液中。
  4. 重复步骤 1.2 和 1.3，直至上清液澄清。最后用 PBS 洗涤细胞，在室温下以 300 x g 离心 6 分钟，将细胞沉淀重悬于 2 mL 培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。

2. 用 SEB 负载 Raji 细胞

  1. 准备两个15 mL Falcon离心管，每管中加入1.5 × 106个Raji细胞。离心细胞（300 × g，6分钟，室温），弃去上清液。
  2. 用残留的培养基（约50–100 µL）重悬细胞，加入1.9 µL（1.9 µg）SEB，室温孵育15分钟。加入5 mL培养基，离心细胞（300 × g，6分钟，室温），然后将细胞沉淀重悬于培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，调整细胞密度为1 × 106 个细胞/mL。

3. 免疫突触的诱导与染色方案

  1. 移液器 500 µL 将SEB负载的Raji细胞加入FACS管中的制备过程 500 µL 将未加载的Raji细胞转移至另一FACS管中。加入 650 µL 将全白细胞加入各管中，离心收集细胞（300 × g，室温离心10分钟）。弃去上清液，将沉淀重悬于 150 µL 培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中。37°C 培养 37 °C （通常为 45 分钟）。
  2. 轻轻涡旋细胞（1000 rpm，10 s），并在涡旋过程中加入1.5 mL多聚甲醛（1.5%）以固定细胞。加入1 mL PBS + 1% BSA终止固定。离心收集细胞（300 × g 室温孵育10分钟后，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 1% BSA中。
  3. 沉淀（300 × g 室温下孵育10分钟）并将细胞重悬于 100 µL 加入 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷，室温孵育 15 分钟以透化细胞（96 孔板，U 型孔）。
  4. 用 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷溶液洗涤细胞，离心（300 x g 在室温下孵育10分钟）后，将细胞沉淀重悬于 50 µL 含荧光标记抗体或化合物的 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷溶液（CD3-PE-TxRed（1:30）、鬼笔环肽-AF647（1:150）和 DAPI（1:3,000））
  5. 在室温避光条件下孵育细胞 30 分钟。加入 1 mL PBS + 1% BSA + 0.1% saponin 重悬细胞，洗涤 3 次。300 x g 离心 g 室温下孵育10分钟。将细胞重新悬浮于 60 µL 用于成像流式细胞术的 PBS

4. 使用流式细胞仪进行图像采集

注意：以下图像采集程序和数据分析基于使用 ImageStream（IS100）、INSPIRE 和 IDEAS 等软件的成像流式细胞术。然而，也可使用其他流式细胞仪和分析软件。

  1. 在连接成像流式细胞仪的计算机上打开分析软件，点击仪器菜单中的“初始化流路系统”。当提示时，将微珠加入右侧进样口。
  2. 从“文件”菜单中加载默认模板，然后点击“运行/设置”。在“视图”下拉菜单中选择“微珠”。
  3. 如果明场照明光源的指示值低于200，则点击“设置强度”以调节明场照明光源。
  4. 在“辅助”选项卡中点击“全部启动”，运行校准和测试程序。
  5. 点击“冲洗/锁定/加载”，并在提示时将样本加入左侧进样口。将细胞加载到流式细胞仪后，打开“细胞分类器”并按以下参数进行调整：每个通道的峰值强度上限设为1,022；通道2（DAPI）和通道5（CD3-Pe-TxR）的峰值强度下限设为50；通道1（侧向散射）的面积下限设为50，上限设为1,500。
  6. 在“设置”选项卡中，将激发激光功率调整为405 nm（15 mW）、488 nm（200 mW）和647 nm（90 mW）。
  7. 在“视图”下拉菜单中切换“细胞”和“微珠”视图，以评估细胞分类器和激光功率的设置效果。
    注意：通过调整细胞分类器参数和/或激发激光功率，确保所有单个细胞及成对细胞均出现在“细胞”视图中，而细胞团块、碎片以及存在饱和像素的图像均出现在“碎片”视图中。
  8. 在“设置”选项卡中定义样本名称及需采集的图像数量（样本为15,000–25,000张，补偿对照为500张）。点击“运行/设置”以开始数据采集。

5. 数据分析

  1. 将原始图像文件（.rif）传输至数据分析计算机，并打开分析软件。
  2. 根据“补偿”下拉菜单中的说明生成补偿矩阵。将补偿矩阵保存为 comp_Date.ctm。
  3. 打开一个原始图像文件（.rif），在弹出的窗口中应用 comp_Date.ctm，生成补偿后的图像文件（.cif）和默认的数据分析文件（.daf）。
  4. 打开补偿后的图像文件。将图像转换为彩色模式，并调整图像库属性工具栏中的查找表，以获得最佳的可见颜色效果。使用图像库属性工具栏中的“复合”选项卡生成RGB合并图像。
  5. 从“分析”下拉菜单中打开掩膜管理器（Mask Manager）。创建用于定义T细胞和免疫突触的掩膜，步骤如下：
    1. 选择T细胞掩膜：“(Fill(Threshold_Ch05, 60)”；选择谷值掩膜：“Valley(Ch02,3)”；选择T细胞突触掩膜：“T-cell mask AND Valley(M02,Ch02, 3)”。
  6. 从“分析”下拉菜单中打开特征管理器（Feature Manager）。计算以下特征：
    1. 对于T细胞中总的CD3表达量，选择“Intensity_T-cells_Ch5”；对于T细胞中F-actin的总量，选择“Intensity_T-cells_Ch6”；对于免疫突触中CD3的表达量，选择“Intensity_T-cell synapse_Ch5”；对于免疫突触中F-actin的量，选择“Intensity_T-cell synapse_Ch6”。
    2. 为计算T细胞面积，选择“Area_T-cells”；为计算T细胞免疫突触面积，选择“Area_T-cell synapse”。
  7. 在特征管理器中使用以下公式计算免疫突触中F-actin和CD3的富集程度：
    F-actin和CD3富集公式，T细胞突触强度分析的计算方法
  8. 使用分析区域中的直方图和点图应用以下设门策略（更多细节参见参考文献17和19）：
    1. 通过绘制“Gradient RMS_M2_Ch2”的直方图排除失焦细胞；将阈值设为15。
    2. 绘制SSC与CD3强度的点图。对CD3阳性事件设置门控。
    3. 绘制M02（DAPI染色）的“长宽比”与M02（DAPI染色）面积的关系图。根据T细胞单细胞和细胞对进行门控。根据之前所述方法17,19，利用突触掩膜的面积校正真实的细胞对。
    4. 确定T细胞单细胞以及T细胞/APC细胞对中T细胞的F-actin含量，以及免疫突触中F-actin所占百分比。

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结果

本文所述方法的一个主要目标是量化蛋白质富集（例如, F-肌动蛋白）在来自小体积（1 mL）人全血样本的未纯化泛白细胞中，由替代性抗原呈递细胞（Raji细胞）与T细胞之间形成的免疫突触中的分布。截图显示于 图1 概述了该方法的关键门控策略。左侧显示图像库，右侧显示分析区域（图1）。图像图库展示了“焦点”门控。图中所示主要为粒细胞和两对T细胞/抗原呈递细胞（APC）。在编号为30272的细胞对中，F-actin和CD3富集明显。用于定量此类富集细胞对数量的设门策略见分析区域，并在本方案（见步骤5.8）或其他文献中有详细描述。17,19分析区域中的最后一个散点图显示了免疫突触中CD3（x轴）和F-actin（y轴）的蛋白含量（蛋白百分比）。若超过30%的蛋白位于免疫突触掩膜范围内，则认为该蛋白在免疫突触中存在富集20. 用于展示富...

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讨论

本文所展示的工作流程可实现对人T细胞（离体）与抗原呈递细胞（APCs）之间免疫突触的定量分析。值得注意的是，本研究采用红细胞裂解后的全白细胞作为T细胞来源，从而无需进行T细胞纯化步骤。B细胞淋巴瘤细胞系Raji被用作替代性抗原呈递细胞。这一策略具有显著优势，因其允许在不同供血者之间对免疫突触的T细胞侧进行比较。此外，自体树突状细胞（DCs）难以直接从外周人血中获取，而单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）的制备需耗时数天，限制了其在临床研究中的应用。然而，本文所介绍的成像流式细胞术及分析策略亦可应用于其他类型的抗原呈递细胞（例如, 转分化中性粒细胞20此外，研究证明了CD4 T细胞与离体DCs之间的免疫突触9 或B细胞21 可利用成像流式细胞术对小鼠进行评估。因此，该方法可进一步拓展用于评估抗原呈递细胞功能，而不仅限于免疫突触中的T细胞侧。

该方法最关键的步骤是将泛白细胞与抗原呈递细胞在小体积中充分混合，并采用正确的设门策...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为 SFB-938-M 和 SA 393/3-4。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
聚苯乙烯圆底管Falcon#3520545 mL
培养瓶Thermo Scientific#178883
杜氏磷酸盐缓冲液SigmaD8662
牛血清白蛋白Roth#8076.3
皂苷SigmaS7900
多聚甲醛Sigma Aldrich#16005
FACS 洗涤皂苷缓冲液PBS 1% BSA 0.15 Saponin
反应管Sarstedt72.699.0020.5 mL
Speed BeadAmnis#400041
微量振荡器 MS1IKA Works MS1
微孔板Greiner Bio One#65010196U
肠毒素 SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
鬼笔环肽-AF647Molecular ProbesA222871:150
IS100Amnis成像流式细胞仪
IDEASAmnis软件
INSPIREAmnis软件

参考文献

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T细胞与抗原提呈细胞的结合物CD3表达分析F-肌动蛋白富集全白细胞制备SEB负载的Raji细胞流式设门策略蛋白质定量人血液样本
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