影像性流式细胞仪对人体免疫突触的定性和定量分析

Summary

在这里, 我们描述了一个完整的工作流程, 用于定性和定量分析免疫突触之间的原代人类 t 细胞和抗原呈现细胞。该方法基于成像流式细胞仪, 允许在相对较短的时间内采集和评估数千张细胞图像。

Abstract

免疫突触是 t 细胞与抗原表达细胞 (apc) 之间的交流区域。t 细胞将表面受体和蛋白质向免疫突触极化, 以确保稳定的结合和信号交换。经典共聚焦、tirf 或超分辨显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动图像采集和耗时的量化, 因此对罕见事件的成像具有挑战性。在这里, 我们描述了一个工作流, 它可以对数万个单元格进行形态分析。泛白细胞制剂中的原代人 t 细胞与负载为 apc的金黄色葡萄球菌肠毒素 b (seb) 之间诱导免疫突触。图像采集是通过成像流式细胞仪 (也称为流内显微镜) 进行的, 它结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特征。为识别 t 细胞 apc 夫妇和分析免疫突触提供了一种完整的门控策略。由于此工作流程允许分析未纯化的泛白细胞制剂中的免疫突触, 因此只需要少量血液 (即1毫升),因此它可以应用于患者的样本。重要的是, 可以同时制备、测量和分析多个样品。

Introduction

t 细胞是自适应免疫系统的主要调节剂, 并通过抗原肽激活, 这些肽是在主要组织相容性复合物 (mhc) 的背景下出现的。全 t 细胞激活需要两个信号, 即通过抗原特异性 t 细胞受体 (TCR)/CD3 复合体的能力信号和通过辅助受体的共刺激信号。这两个信号都是通过 t 细胞与抗原呈现细胞 (apc) 的直接相互作用产生的。成熟的 apc 通过 mhc-肽复合物提供 t 细胞活化的能力信号, 它们表达共刺激配体 (如 cd80 或 cd86), 以确保 t 细胞活化¹的进展.共刺激的一个重要功能是重新排列肌动蛋白细胞骨架^2,3,4。在静止 t 细胞中, 皮质 f-肌动蛋白相对静态。通过抗原性 apc 刺激 t 细胞导致肌动蛋白细胞骨架的深刻重排。肌动蛋白动力学 (即快速活性蛋白聚合/解聚合圈) 使 t 细胞产生的力量, 用于运输蛋白质或细胞器, 例如。此外, 肌动蛋白细胞骨架是重要的发展一个特殊的接触区之间的 t 细胞和 apc, 称为免疫突触。由于肌动蛋白细胞骨架对免疫突触的重要性, 因此有必要开发一些方法来量化 t 细胞 5^、6、

Protocol

1. 泛白细胞的制备

1. 在肝素化注射器中从健康捐献者 (或患者) 中提取1毫升外周血。确保献血得到负责伦理委员会的批准。
2. 将人外周血的1毫升与30毫升的 ack 裂解缓冲液 (150 mm nh4 cl_,1 mm khco₃和 0.1 mm edta, ph 7.0) 混合在一个 50 ml 管中, 在室温下孵育8分钟。
3. 在 300 x g的情况下将管道和离心机灌满 6分钟, 吸收上清液, 并将颗粒重新悬浮在30ml 的 ack 裂解缓冲液中。
4. 重复步骤1.2 和 1.3, 直到上清液清除。最后, 在 pbs 中清洗细胞, 在室温下以 300 x g 离心器 6分钟, 并在培养基 (rpmi1640 + 10% fcs) 中重新悬浮细胞颗粒。在37°c 下将细胞培养60分钟。

2. 用 seb 装载 raji 电池

1. 准备两个15毫升猎鹰管与 1.5 x¹⁰ 6 raji 细胞每管。向下旋转细胞 (300 x克,室温下 6分钟), 并丢弃上清液。
2. 将细胞重新悬浮在残留介质中 (约 50–100μl), 加入 1.9μl (1.9μg) seb, 在室温下孵育 15分钟, 加入5毫升培养基, 将细胞旋转 (300 x g

Results

这里描述的方法的一个主要目标是量化蛋白质丰富 (例如, f-肌动蛋白) 在免疫突触之间的代理 apc (raji 细胞) 和 t 细胞在未纯化的泛白细胞从低体积 (1 毫升) 人体血液样本中提取。图 1中的屏幕截图概述了此方法的关键门控策略。它在左侧显示图像库, 在右侧显示分析区域 (图 1)。图片库显示 "聚焦" 门。所描绘的图像主要是粒细胞和两对 t-clepc 夫妇。f-肌动蛋白和 cd3 在细胞对30272丰富。量化这种丰富的细胞对数量的门控策略显示在分析领域, 并在议定书 (见步骤 5.8) 或其他地方^{第17、19 中}描述。分析区域中的最后一个点图显示免疫突触中 cd3 (x 轴) 和 f-肌动蛋白 (y 轴) 的含量 (百分比)。如果超过30% 的蛋白质位于免疫突触面膜内, 则在免疫突触 20^中被认为是蛋白质丰富.......

Discussion

这里介绍的工作流程使人的 t 细胞 (体外) 和 apc 之间的免疫突触能够进行量化。值得注意的是, 红细胞裂解泛白细胞被用作 t 细胞源, 使 t 细胞纯化步骤成为可有可无的。b 细胞淋巴瘤细胞系拉吉作为代理 apc。这具有显著的优势, 因为它允许免疫突触 t 细胞侧的献血者进行比较。此外, 自体 dc 很难直接从人体外周血中获得。单核细胞衍生树突状细胞 (modc) 的产生需要几天时间, 这使得其在临床研究中的应用具有挑战性。然而, 成像流式细胞仪和这里介绍的分析策略可以应用于其他 apc (例如,跨分化中性粒细胞)²⁰。此外, 还证明 cd4 t 细胞与体外 ds9 或 b 细胞²¹之间的免疫突触可以用成像流式细胞仪对小鼠进行评估.因此, 除了免疫突触的 t 细胞侧之外, 这种方法还可以扩大到评估 apc 功能。

这种方法最关键的步骤是将泛白细胞和 apc 混合在一个小体积中, 并执行正确的门控策略, 以排除假阳性事.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
聚苯乙烯圆底管	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水	Sigma	D8662
牛血清白蛋白	Roth	#8076.3
皂苷	Sigma	S7900
多聚甲醛	Sigma Aldrich	#16005
FACS 洗涤皂苷		PBS 1% BSA 0.15 皂苷
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
快速珠	Amnis	#400041
迷你摇床 MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
肠毒素 SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1：3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1：30
鬼笔环肽-AF647	分子探针	A22287	1：150
IS100	Amnis		成像流式细胞仪
IDEAS	Amnis		软件
INSPIRE	Amnis		软件