本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。
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本文内容
摘要
摘要
免疫突触是T细胞与抗原呈递细胞（APCs）之间进行通讯的区域。T细胞将表面受体和蛋白质极化至免疫突触，以确保稳定的结合和信号交换。传统共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）或超分辨率显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动采集图像并进行耗时的定量分析，因此对稀有事件的成像具有挑战性。本文中，我们描述了一种可实现数万个细胞形态学分析的工作流程。免疫突触的形成发生于全白细胞制备物中的原代人T细胞与 金黄色葡萄球菌 载有肠毒素B（SEB）的Raji细胞作为抗原呈递细胞（APCs）。图像采集采用成像流式细胞术（也称为In-Flow显微镜），该技术结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特性。文中提供了完整的设门策略，用于识别T细胞与抗原呈递细胞的结合体并分析免疫突触。由于该工作流程可在未纯化的全白细胞样本中分析免疫突触，因此仅需少量血液样本（即, 1 mL），可将其应用于患者样本。重要的是，可同时制备、测量和分析多个样本。
引言
T细胞是适应性免疫系统的主要调节者，通过主要组织相容性复合体（MHC）呈递的抗原肽被激活。T细胞的完全激活需要两个信号：一是通过抗原特异性的T细胞受体（TCR）/CD3复合物传递的能力信号，二是通过辅助受体传递的共刺激信号。这两个信号均通过T细胞与抗原呈递细胞（APC）的直接相互作用而产生。成熟的APC通过MHC-肽复合物为T细胞激活提供能力信号，并表达共刺激配体（例如, CD80 或 CD86）以确保T细胞活化的进程1共刺激的一个重要功能是重组肌动蛋白细胞骨架2,3,4静息T细胞中的皮层F-actin相对稳定。通过携带抗原的抗原提呈细胞（APCs）刺激T细胞，可引起肌动蛋白细胞骨架的显著重排。肌动蛋白动态变化（即, 快速的肌动蛋白聚合/解聚循环使T细胞能够产生用于运输蛋白质或细胞器等物质的作用力。此外，肌动蛋白细胞骨架对于T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间形成一种称为免疫突触的特殊接触区域至关重要。由于肌动蛋白细胞骨架在免疫突触中的重要作用，开发用于量化T细胞肌动蛋白细胞骨架变化的方法已成为必要。5,6,
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方案
1. 全白细胞的制备
- 使用肝素化注射器从健康供体（或患者）抽取 1 mL 外周血。确保已获得相关伦理委员会对献血的批准。
- 在 50 mL 离心管中，将 1 mL 人外周血与 30 mL ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3 和 0.1 mM EDTA，pH 7.0）混合，并在室温下孵育 8 分钟。
- 用 PBS 注满离心管，以 300 x g 离心 6 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 30 mL ACK 裂解缓冲液中。
- 重复步骤 1.2 和 1.3，直至上清液澄清。最后用 PBS 洗涤细胞，在室温下以 300 x g 离心 6 分钟，将细胞沉淀重悬于 2 mL 培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
2. 用 SEB 负载 Raji 细胞
- 准备两个15 mL Falcon离心管，每管中加入1.5 × 106个Raji细胞。离心细胞（300 × g，6分钟，室温），弃去上清液。
- 用残留的培养基（约50–100 µL）重悬细胞，加入1.9 µL（1.9 µg）SEB，室温孵育15分钟。加入5 mL培养基，离心细胞（300 × g
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结果
本文所述方法的一个主要目标是量化蛋白质富集（例如, F-肌动蛋白）在来自小体积（1 mL）人全血样本的未纯化泛白细胞中，由替代性抗原呈递细胞（Raji细胞）与T细胞之间形成的免疫突触中的分布。截图显示于 图1 概述了该方法的关键门控策略。左侧显示图像库，右侧显示分析区域（图1）。图像图库展示了“焦点”门控。图中所示主要为粒细胞和两对T细胞/抗原呈递细胞（APC）。在编号为30272的细胞对中，F-actin和CD3富集明显。用于定量此类富集细胞对数量的设门策略见分析区域，并在本方案（见步骤5.8）或其他文献中有详细描述。17,19分析区域中的最后一个散点图显示了免疫突触中CD3（x轴）和F-actin（y轴）的蛋白含量（蛋白百分比）。若超过30%的蛋白位于免疫突触掩膜范围内，则认为该蛋白在免疫突触中存在富集20. 用于展示富.......
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讨论
本文所展示的工作流程可实现对人T细胞（离体）与抗原呈递细胞（APCs）之间免疫突触的定量分析。值得注意的是，本研究采用红细胞裂解后的全白细胞作为T细胞来源，从而无需进行T细胞纯化步骤。B细胞淋巴瘤细胞系Raji被用作替代性抗原呈递细胞。这一策略具有显著优势，因其允许在不同供血者之间对免疫突触的T细胞侧进行比较。此外，自体树突状细胞（DCs）难以直接从外周人血中获取，而单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）的制备需耗时数天，限制了其在临床研究中的应用。然而，本文所介绍的成像流式细胞术及分析策略亦可应用于其他类型的抗原呈递细胞（例如, 转分化中性粒细胞20此外，研究证明了CD4 T细胞与离体DCs之间的免疫突触9 或B细胞21 可利用成像流式细胞术对小鼠进行评估。因此，该方法可进一步拓展用于评估抗原呈递细胞功能，而不仅限于免疫突触中的T细胞侧。
该方法最关键的步骤是将泛白细胞与抗原呈递细胞在小体积中充分混合，并采用正确的设门策.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为 SFB-938-M 和 SA 393/3-4。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | #352054 | 5 mL |
| 培养瓶 | Thermo Scientific | #178883 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma | D8662 | |
| 牛血清白蛋白 | Roth | #8076.3 | |
| 皂苷 | Sigma | S7900 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS 洗涤皂苷缓冲液 | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| 反应管 | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| 微量振荡器 MS1 | IKA Works | MS1 | |
| 微孔板 | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| 肠毒素 SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| 鬼笔环肽-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | 成像流式细胞仪 | |
| IDEAS | Amnis | 软件 | |
| INSPIRE | Amnis | 软件 |
参考文献
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journ....
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重印与许可
