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采用痕迹性眼睑经典条件反射评估胎儿酒精谱系障碍大鼠模型中的海马功能障碍

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DOI：

10.3791/55350

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2017年8月5日

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1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

本文内容

摘要

采用痕迹性瞬眼经典条件反射（ECC）来评估成年大鼠海马依赖性关联学习能力，这些大鼠在新生早期脑发育阶段曾接受高浓度（11.9% v/v）酒精处理。总体而言，ECC 方法是一种可靠的诊断工具，可用于多种心理和生物医学情境下脑功能障碍的检测。

摘要

在出生后第4至9天，对新生大鼠施用相对高浓度的乙醇（11.9% v/v），这一时期胎儿大脑经历快速的组织结构变化，类似于人类妊娠晚期大脑加速发育的阶段。这种胎儿酒精谱系障碍（FASDs）模型可导致严重的大脑损伤，模拟某些孕期酗酒母亲所表现出的暴饮行为的剂量和模式。我们描述了采用痕迹性眼睑经典条件反射（ECC）——一种高级形式的联想学习——来评估酒精暴露后成年子代中常见的长期海马功能障碍。在90日龄时，对啮齿动物进行手术，植入记录电极和刺激电极，分别用于测量左侧眼睑肌肉的肌电图（EMG）眨眼活动，并在左眼后方施加轻微电刺激。经过5天的恢复期后，动物接受了6次痕迹性ECC训练，以确定酒精暴露组与对照组大鼠在联想学习能力上的差异。痕迹性ECC是多种可能的ECC实验程序之一，可利用相同的设备和软件轻松调整，从而评估不同的神经系统。总体而言，ECC程序可作为诊断工具，用于检测不同脑系统及不同脑损伤条件下存在的神经病理变化。

引言

很难想象，在当今医疗条件改善、医疗服务可及性提高的时代，酒精滥用仍然是一个重大的全球公共卫生问题。不幸的是，已有研究表明，怀孕期间大量饮酒的孕妇可能生下患有严重脑损伤和终身性神经发育障碍的子女，这一点在胎儿酒精综合征（FAS）患者中尤为明显1,2,3。对于有明确孕期饮酒史的女性而言，其发育中的胎儿也容易受到少量酒精或不同饮酒模式的影响，这些因素会导致血液酒精浓度出现不同程度的变化。在这种情况下，尽管儿童可能不表现出与FAS患者同样严重的形态学或神经行为异常，但仍可能出现从轻度到重度不等的终身认知障碍和情绪障碍3,4。总体而言，FAS以及较轻程度的产前酒精相关损害共同构成了一系列被称为胎儿酒精谱系障碍（FASDs）的疾病。尽管FASDs完全可预防，但令人震惊的是，在酒精滥用较为普遍的人群中，它们仍是非遗传性神经和认知障碍的首要原因，影响约2%至5%的美国及法国、瑞典等欧洲国家的儿童。仅就美国FAS的发病率而言，其患病率为每1,000例活产婴儿中有2至7例5，这意味着FASDs的总体发病率远高于FAS本身。

针对胎儿酒精谱系障碍（FASDs）儿童开展的神经影像学研究显示，这些儿童存在脑部异常，例如胼胝体变薄6、前部小脑蚓部体积减小7以及海马体积缩小8。这些脑部异常是FASDs儿童长期存在神经认知功能障碍的部分基础。目前，母体饮酒所导致的脑部变化与特定神经认知损害特征（即类型、程度）之间的具体关联尚不明确。然而，作为研究起点，海马是探究其对产前酒精暴露易损性的理想脑区。事实上，FASDs儿童在依赖海马功能的行为方面表现出缺陷，例如空间学习能力9,10和延迟物体回忆能力11。

啮齿类动物FASD模型在阐明FASD患儿神经认知功能障碍的潜在机制方面已被证明具有重要价值。我们采用的一种成熟的暴饮暴露模型，是在出生后第4至9天向大鼠给予酒精。12,13，这一时期大脑会快速形成突触和树突接触，相当于人类胎儿第24周，并持续至第3阶段rd 孕早期、孕中期、孕晚期14,15,16,17该模型可诱导海马神经元显著丢失18,19 以及小脑等多个其他脑区中的神经元12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23，伴随认知功能在多个领域出现严重损害21,24,25早期酒精暴露对大鼠认知功能的干扰可通过多种方法进行评估，尤其是通过 眨眼经典条件反射 （ECC）。ECC 是一种已被使用超过一个世纪的范式，用于科学地探究学习的基本机制26,27 因此，该方法为深入理解胎儿酒精暴露所导致的不良神经认知后果提供了一种有效途径。它是一种高度灵活的实验范式，研究者可采用多种不同的经典条件反射（ECC）程序，并可在跨越系统发育梯度的多种哺乳动物物种（从小鼠到人类）以及不同脑发育阶段中进行研究。28,29,30,31此外，该范式中介导联想学习的基本神经回路得到了这些相同物种的实验和神经心理学研究报告的支持26,32,33,34,35,36,37.

本文展示了一种ECC形式，即痕迹性ECC（图1）。为了提供背景信息，本文将其与更为传统的延迟性ECC进行比较。ECC范式模仿了由诺贝尔奖得主生理学家伊万·巴甫洛夫（Ivan Pavlov）首次开展的、以狗为对象的经典条件反射实验。巴甫洛夫发现，某些刺激（如声音）本身不会自然引发唾液分泌，但当其先于并部分重叠食物呈现时，若这种声音-食物的偶联关系得以维持，则重复多次呈现后可增强唾液分泌反应。这便是延迟性ECC的一个例子，其核心理念在于两种刺激之间即时的时间邻近性可介导联想强度，从而使动物的学习条件达到最优。他还测试了其他形式的声音-食物偶联关系，例如在声音停止后留出一段“痕迹”间隔再给予食物。当这两种刺激的时间间隔足够长而不再连续时，狗在食物呈现前产生唾液分泌反应的能力显著下降。声音停止与食物呈现之间的这种时间不连续性，即为痕迹性ECC的一个实例。由于啮齿类动物不会因食物出现而自然分泌唾液，因此通常采用更具物种相关性的刺激（如轻度电击）来替代；它们也不会对声音自然产生防御性眨眼反应。在此背景下，啮齿类动物的ECC实验通常包括：以特定分贝水平呈现一个声音刺激，并以某种方式将其与施加于眼轮匝肌（orbicularis oculi）或颞肌（temporalis）的轻度电击配对，以诱发眨眼反应。其中，声音被视为条件刺激（CS），而电击则被视为非条件刺激（US）。在延迟性ECC中，首先呈现CS，该刺激持续一定时间；随后施加US。这两个刺激在时间上部分重叠，并最终同时终止；由US引发的眨眼反应被称为非条件反应（UR）。在此程序中，啮齿类动物学会在CS呈现后、但在US到来之前产生眨眼反应，以预判这一厌恶刺激的到来。这种习得的眨眼反应被称为条件反应（CR）。而在痕迹性ECC中，CS与US之间存在一段无任何刺激的时间间隔，称为痕迹间隔；与延迟性ECC不同，二者在时间上并不重叠。在此间隔期间，动物需完成对刺激之间关联性的处理。与延迟性ECC类似，当动物能够在CS终止后、但在US施加前稳定地产生眨眼反应时，即视为学习成功。经过一定阶段的习得训练（CS与US配对），学习曲线（即基于不同CR指标的测量结果）逐渐形成。损毁及神经影像学研究表明，成功完成延迟性ECC依赖于完整的小脑-脑干神经回路38,39,40，而痕迹性ECC是一种更高级的认知任务，需要海马41,42,43,44及其他皮层结构45,46的额外神经参与。由于成功获得痕迹性条件反应需要精确的时间控制能力，因此该任务的学习难度更高（即使是正常受试者也较难掌握）。

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图 1：痕迹性眨眼经典条件反射。 图中显示了一个代表未插管对照组（UC组）成年大鼠的实际波形。首先呈现声音条件刺激（CS）（85 dB，2.8 kHz），持续时间为380 ms。随后是500 ms的痕迹间隔期，期间无任何刺激。之后给予电击非条件刺激（US）（1.6 mA），持续100 ms。在此任务中，当经过多次训练后，在条件反应（CR）时间窗（总CR期）内眨眼的频率（%）或幅度（伏特）增加时，即表明学习成功。特别是，海马体完整的啮齿类动物通常会在电击US出现前（在200 ms时间窗内）产生更多时间精准的CR（适应性CR）。同时也会测量声音CS开始后前80 ms内的惊跳反应（SRs）以及非条件反应（URs）。在训练良好的啮齿类动物中，非关联性的SR通常较低或不存在，而UR则预期具有较高的频率和幅度。该任务要求啮齿类动物学会在CS结束与US开始之间（即痕迹间隔期）建立联系，因此与延迟型ECC相比，其习得难度 inherently 更高。请点击此处查看该图的放大版本。

本文展示了以类似暴饮方式在新生儿期暴露于酒精所导致的不良功能后果，通过一种痕迹条件化眨眼反射（trace ECC）程序进行评估。该程序提供一个85 dB的音调条件刺激（CS，2.8 kHz），持续380 ms，随后给予一个1.6 mA的电击非条件刺激（US），持续100 ms，两种刺激之间间隔500 ms的痕迹期。我们已在先前的研究中报道过该行为检测方法的应用价值，用于评估胆碱干预和铁补充在缓解新生儿期酒精暴露影响中的作用18,47。事实上，痕迹ECC可作为一种诊断工具，用于评估新生儿期酒精暴露引起的海马病理改变。与延迟ECC相比，其优势在于对海马功能障碍的检测更为敏感，而海马功能受损正是胎儿酒精谱系障碍（FASDs）患者中的典型特征。

ECC 的应用演示远远超出了胎儿酒精谱系障碍研究领域。ECC 的多种变体（例如、延迟、痕迹、复合、逆转）可用于阐明发育过程中学习能力的个体发生差异、正常哺乳动物联想学习的神经生物学基础，以及不同脑系统在面对多种挑战时的脆弱性，包括但不限于致畸物、环境毒素、创伤性脑损伤、神经退行性疾病和精神疾病。

方案

注意：所有实验程序均经东卡罗来纳大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循其规定执行。Long-Evans 大鼠由雌性与雄性种鼠交配繁殖获得。三个处理组（见 1.1）的幼鼠均来自同一母鼠的同窝后代。共繁殖了五窝幼鼠，每窝在出生后第 3 天（PD 3）筛选保留 8 只幼鼠。每窝剩余的两只幼鼠被分配至不同的实验组。研究中同时包含雄性和雌性子代（每个暴露组各一只）。本研究共检测了 N = 27 只成年子代大鼠；其中 3 只因 ECC 训练第 1 天时 3T 导线损坏且无法修复而被剔除（见 3.1.1）。

1. 实验分组、材料与溶液的准备

  1. 在出生后第3天，将幼鼠从母鼠身边取出，并置于恒温水循环加热垫上以保持温暖。采用随机分组方法将幼鼠分为三组：（1）酒精灌胃组（AI）；（2）假灌胃对照组（SI）；（3）非灌胃对照组（UC）。按照编号方案，使用30G × 1/2英寸针头以无毒墨水对幼鼠足部进行纹身标记，以完成经批准的个体识别操作。完成纹身后，将幼鼠放回母鼠身边。
  2. 使用聚乙烯（PE）50号和10号管材制备一根或多根经口胃插管。该导管的总长度可根据使用者需求进行调整。
    1. 使用显微解剖剪剪取一段3英寸的PE-50导管和一段6英寸的PE-10导管。
    2. 将PE-50导管小心连接至一支无菌的22 G × 1英寸皮下注射针头上。
    3. 将PE-10导管的一端插入PE-50导管的开口端。可能需要将PE-10导管末端斜向剪切，以便将其导入PE-50导管中。
    4. 剪取一小段PE-50导管（约2-3 mm），套在PE-10导管的开口端，作为可视的限位标记。
    5. 将完整的经口胃管插管装置保存于新鲜的70%异丙醇中以维持无菌状态。
  3. 在50 mL瓶中进行无菌操作以制备牛奶储备液。该牛奶储备液基于West等（1984年）首次建立的饲料配方。48. 将瓶子储存在 -18 °C 直至使用时。使用前用温水解冻两瓶牛奶。
    1. 使用无菌注射器吸取 7.16 mL 的 95% 乙醇（USP），加入一个 50 mL 的牛奶瓶中。此操作可制备成体积分数为 11.9% 的酒精溶液，用于当天前两次喂养幼鼠（见 2.1.1）；酒精的总日剂量为 5.25 g/kg/天。该方案旨在将酒精以每克体重每次喂养 0.0278 mL 的体积，溶于营养强化牛奶溶液中给予。
      注意：此用量可根据每窝仔鼠数量及3-4天内的预期使用量进行调整。添加的酒精量也需相应调整，以配制11.9%（v/v）的溶液。
    2. 充分振荡此瓶，并相应标记即11.9% v/v 乙醇牛奶溶液
    3. 相应地标记第二瓶牛奶（未添加酒精）例如，仅母乳）并根据2.1.1节所述用于补充喂养。
    4. 将两瓶牛奶均存放于冰箱中。

2. 新生儿期酒精暴露（出生后第4-9天）

  1. 从出生后第4天（PD 4）开始，每天对AI和SI幼鼠进行共4次灌胃，每次间隔2小时。由于AI幼鼠接受的是实际溶液灌胃，因此每次灌胃均视为一次喂养。
    1. 在当天前两次喂养期间，使用11.9% v/v乙醇牛奶溶液对AI幼鼠进行灌胃；在后两次喂养期间则使用纯牛奶溶液灌胃，以补充其生长所需。
    2. 对SI幼鼠每2小时进行一次灌胃操作，共4次，但不注入任何溶液，以确保其与AI幼鼠经历相同时长的PE-10导管暴露。UC组幼鼠不接受任何灌胃处理。
  2. 将幼鼠从母鼠身边取出，放置于温控水浴加热垫上以保持体温。称量每只幼鼠的体重（单位：g），并记录数据。参考预先制定的喂养图表，确定每只AI幼鼠的灌胃体积，并在记录表中注明。
    1. 将11.9% v/v乙醇牛奶溶液置于温水中水浴加热，并充分摇匀。
    2. 经胃灌胃操作步骤：
      1. 用温水充分冲洗之前保存在70%异丙醇中的经胃灌胃导管。
      2. 使用无菌1 mL注射器抽取所需体积的溶液。
      3. 将灌胃导管尖端（PE-10端）浸入新鲜玉米油中（以利于插入）。
      4. 测量PE-10导管从幼鼠口腔至胃部的长度，并调整PE-50止挡器，以标记插入的终止位置。
      5. 小心将PE-10导管插入幼鼠口腔，沿食道向下推进，轻微穿过胃食管括约肌，进入胃内。观察幼鼠状态，固定其身体，缓慢推动注射器活塞以注入溶液。
        注意：为避免导管误入气管，应首先使导管弯曲并接触软腭，再向前推进。利用软腭作为引导，导管会自然偏转并进入食道。若导管尖端明显向腹侧偏移，则可能进入气管。若无法确定导管位置，应立即拔出导管，停止操作；下次尝试时重新正确插入。
      6. 小心拔出PE-10导管，检查幼鼠是否有溶液反流、出血或物理损伤。若无异常，将其放回同窝幼鼠中。整个灌胃过程每只幼鼠耗时约少于1分钟，每窝4只接受灌胃处理的幼鼠（2只AI，2只SI）总耗时约4分钟。
      7. SI幼鼠的经胃灌胃操作：采用与AI幼鼠相同的PE-10导管插入流程，但不注入任何溶液，操作持续时间相同（1分钟）。
      8. 完成同窝最后一只幼鼠的操作后，立即将所有幼鼠送回母鼠身边。将母鼠送回动物房，等待下一次喂养（2小时后）。
      9. 用温热的无菌水冲洗经胃灌胃导管，并将其重新置于70%异丙醇中保存。每次喂养前均需用清水充分冲洗导管。
      10. 重复步骤2.2（除称重外）至2.2.2.9进行第二次喂养操作。在最后两次喂养中，使用步骤2.2中确定的相同灌胃体积，对AI幼鼠给予纯牛奶溶液进行灌胃。
  3. 定期称量大鼠体重，例如在出生后第15天（PD 15，睁眼期）、第21天（PD 21，断奶期）、第30天、第60天和第90天（手术期），以获得具有代表性的生长曲线。

3. 电极的制备与修饰

  1. 为每只大鼠制作一个肌电图（EMG）“前置放大器”（图2）。该前置放大器可通过眨眼系统记录眨眼反应（图4）。
    1. 构建一个前置放大器，包含两根长度各为5 cm的3T规格聚四氟乙烯（PTFE）涂层不锈钢丝、一根长度为5 cm的10T规格PTFE涂层不锈钢丝、三个公端接点插针，以及一个被裁剪为3个孔的微型条状插座绝缘体（见3.1.4）。
    2. 使用带锯齿的高精度镊子夹住10T导线的中部，再用光滑的高精度镊子向两端剥离PTFE涂层，以去除该导线上的PTFE涂层。确保该导线上的所有涂层残留物均已被彻底清除。
      1. 使用带锯齿平台的牙科钳将10T导线的一端压接至一个接点插针上；该导线将作为接地线。用光滑的高精度镊子夹住一根3T导线的一端，距离末端1至1.5 mm处。剥离该处1至1.5 mm的PTFE涂层，其余部分保持涂层完整。将一个接点插针压接至3T导线裸露的末端。
      2. 对第二根3T导线执行相同操作。这两根导线将作为肌电图记录电极的正极和负极引线。
    3. 对所有导线进行拉力测试，以确保其牢固连接于插针上。操作时需小心，避免弯曲或损坏导线。
    4. 使用剥线钳的切割刀片将一段插座绝缘体条裁剪至3.5个孔（切去第四个孔的中间部分），必要时进一步修整为仅保留3个完整孔，并将两侧打磨平整。这有助于确保提供3个完整的孔位。将导线-插针组件插入微型条状插座的三个孔中，直至压接端与绝缘体段的底边齐平。10T组件必须位于微型条状插座的一个外侧孔中，而非中间孔。
  2. 改装双极刺激电极（图2）。
    1. 为每只大鼠配备一个双极刺激电极。该电极通过刺激隔离器（见眨眼系统）施加少量电流，作为经典眨眼条件反射（ECC）中的电击非条件刺激（US）。这些电极由制造商提供，呈绞合形式并带有屏蔽层。
    2. 将两根金属引线松开2至3圈，形成V形（间距5 mm），然后使用光滑的高精度镊子尽可能将每个“叉臂”拉直。用剃刀刀片在每个叉臂尖端周围刮除1 mm的屏蔽层。检查每个叉臂是否存在不规则或弯曲，并在不额外刮除屏蔽层的前提下进行校正。
  3. 使用95%乙醇清洗肌电图前置放大器和双极电极，以去除制造过程中残留的油污和其他异物。清洗后使其干燥，然后进行高压灭菌处理。

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图 2：肌电图（EMG）记录电极与双极电极。 制作完成的EMG前置放大器头端（右侧，橙色）由三个公接插针、两根3T规格的聚四氟乙烯（PTFE）涂层导线、一根10T规格的聚四氟乙烯（PTFE）涂层导线以及一个经改装的微型条带构成。这三根导线长度均约为5 cm，并通过压接方式连接至插针。制作完成的双极电极（右侧，白色）已解旋并重新拉直，塑造成V形（分叉长度为5 mm）。两个电极尖端的屏蔽层已被去除。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 眼睑手术操作（出生后第90天）

  1. 材料准备（详见材料部分以获取详细的供应信息）、动物、手术及非手术区域：
    1. 高压灭菌手术器械和耗材——括号（ ）内的数字表示每只成年大鼠或每次测量所需的大致数量：手术器械（每4只大鼠1套，经ECU IACUC批准）、纱布垫（3–4块）、棉签（5–6根）、20 × 20 包布（每台手术4块）、瓷坩埚（1个）、不锈钢微型刮匙（1把）、0.9%生理盐水（1个冲洗瓶）、培养皿（1个）以及0-80不锈钢螺钉（每只大鼠3枚）。
    2. 其他所需无菌用品：10号手术刀片（每4只大鼠1片）、手术单（每只大鼠1张）、兽用眼科软膏、聚维酮碘（1个冲洗瓶）、26G × 3/8" 皮下注射针头（2个）、带#55钻头的镀镍手摇钻、镀镍平头钟表匠螺丝刀（1.8–2 mm刀片）。
    3. 使用经批准的科研/医用级消毒剂准备一个无菌区域，用于放置所有外科手术器械和用品。当该区域准备好后，将材料放置于此处。
    4. 使用经批准的科研/医用级消毒剂准备无菌手术区域。该区域包含一个温度可控的加热垫、配备大鼠麻醉面罩的立体定位仪、玻璃珠灭菌器和异氟烷气体挥发器（用于麻醉）。挥发器配有通向麻醉面罩和诱导室的管道，其中诱导室位于另一独立区域，用于非无菌的动物准备操作；每条管道均由独立的阀门控制。
    5. 彻底清洁双手和手臂 使用抗菌肥皂。在不接触内部的前提下，预先打开所有以灭菌袋或灭菌包布包装的物品。采用无菌操作程序佩戴无菌手套，并将所有相关物品转移至手术区域。将钻头在手摇钻上调节至适当深度（约 2 mm），并准备好螺丝刀。在手术开始前，用无菌包布覆盖无菌物品。
    6. 准备一个非无菌操作区域，配备电子天平、电动毛发修剪器、无菌1 mL注射器（配26G × 3/8 in针头，每只大鼠使用1支）、手术记录本，以及丁丙诺啡（浓度0.03 mg/mL），按0.1 mL/100克体重给药。
      警告：丁丙诺啡属于美国药品执法局（DEA）管制的三类半合成阿片类药物，必须妥善锁存并做好使用记录。
    7. 检查异氟烷挥发罐的气体水平，若过低则补充适量气体。暂时保持气体流量和混合气体调节旋钮处于关闭状态。打开氧气2 储气罐并检查所有手术所需的气体是否充足。
    8. 称量每只大鼠并记录其体重于手术日志中。根据丁丙诺啡注射剂量表确定合适的注射体积。
    9. 打开通向诱导室的蒸发器阀门，保持通向手术面罩的阀门关闭。将混合气体浓度调至3，流速调至3（即3%异氟烷与100%氧气）2 作为载气，流速为 3 L/min。
    10. 将大鼠放入诱导室，使其达到适当的麻醉深度（呼吸缓慢，无足底反射，无眨眼反射）。一旦大鼠达到麻醉状态，将其从诱导室中取出。
    11. 使用毛发修剪器剃除头部毛发，充分暴露手术切口部位及左眼眼睑处的皮肤。如有必要，可将其放回诱导室，再次达到麻醉状态后再继续剃毛操作。
    12. 用异丙醇和聚维酮碘交替擦拭暴露的皮肤三次进行消毒。必要时，在转移至手术台前，将其重新放回诱导室，再次达到麻醉平面。
  2. 外科手术
    1. 打开麻醉面罩的蒸发器阀门，关闭诱导室的阀门。将混合气体浓度调整为2.5，流速调整为2（即2.5%异氟烷与100%氧气）2 以2 L/min的流速通入载气。将大鼠转移至立体定位仪，按照标准操作程序将其头部固定于门齿杆和耳杆上（参见Geiger等，2008）49 （例如）。
    2. 给大鼠皮下注射布托啡诺（SC），并将未盖帽的针头小心丢弃至锐器容器中。将无菌手术巾覆盖在大鼠身上，仅暴露手术区域，使其与身体其他部位隔离。
    3. 佩戴手术口罩、手术帽、手术服、护目镜以及机构动物护理与使用委员会（IACUC）要求的其他个人防护装备。使用抗菌皂彻底清洗并刷洗手部和前臂。采用无菌操作程序佩戴无菌手套。
    4. 使用棉签将少量眼用软膏涂抹于双眼，以防止眼睛干涩。
    5. 当大鼠达到适当的麻醉深度时，开始手术。在整个手术过程中持续监测大鼠状态，并定期检查异氟烷水平。根据大鼠对麻醉的反应，在手术过程中相应调整气流和混合气体调节旋钮。
    6. 使用手术刀片在颅骨中线处做一个前后方向的切口。该切口应暴露眼睛前方足够的区域（即暴露额骨），并向后延伸至略超过人字缝。
    7. 小心刮除颅骨顶部的骨膜，避免引起大量出血。用棉签擦去多余的结缔组织和血液。
    8. 使用手摇钻夹持钻头，在一侧顶骨的冠状缝正后方开始钻孔。用棉签清除血液和骨碎片。用镊子夹住0-80螺钉的螺纹部分，借助钟表匠螺丝刀将其固定于孔中；拧紧螺钉至适当程度，避免损伤大脑皮层组织（通常拧紧3-4圈即可）。
    9. 按照4.2.8中所述的相同步骤，将另外两个0-80螺钉固定于颅骨上，一个位于对侧顶骨冠状缝正后方，另一个位于右侧人字缝正前方。研究发现，3个螺钉已足以将牙科水泥（见4.2.18）固定于颅骨，因为第四个螺钉（位于左侧人字缝前方）会妨碍双极电极的放置。
    10. 从培养皿中取出一个肌电图头戴装置。将头戴装置朝向调整为10T导线位于大鼠右侧。将10T导线向上弯曲，使其与微条带的底边平行。再稍向右侧弯曲，使导线能够绕过前侧和后侧的0-80螺钉。将其放置一旁，但需保持在便于取用的范围内。
    11. [假设为右利手] 将4英寸敷料镊置于右手，3英寸敷料镊置于左手。用右手的4英寸敷料镊夹住左眼切口处上方的皮肤，并将左手的3英寸敷料镊指向该眼的眶角；夹住该眶角处的皮肤。保持3英寸敷料镊的夹持状态，松开4英寸敷料镊。
    12. 取一根26G × 3/8英寸针头，从眼睑角落插入；旋转针头，使斜面朝上。使用带平台的显微解剖镊子，将中间的3T导线插入针头孔中。将导线推入孔内数厘米，但不要完全插入到底；此导线为负极导线。
    13. 按照4.2.11和4.2.12中所述步骤，将外侧3T导线插入眼睑中部；该导线为正极导线。
    14. 用一只手握住两根针，另一只手握住头端装置（或使用镊子）。在保持连续动作的同时，将针从眼睑处向外牵拉，并引导头端装置朝相同方向移动。如有必要，旋转头端装置，使10T导线朝向动物的右眼；注意不要让3T导线相互交叉。使用尖头镊子仔细检查，确保正极导线位于眼睑中央。
    15. 调整头帽位置，使其位于双眼之间，并置于前额骨上的最佳位置，位于双侧植入的螺钉前方。用一只手握住头帽，另一只手握住3英寸敷料镊。将10T导线缠绕在10T侧的一个或两个螺钉上。
    16. 一手持3英寸持针钳，另一手持4英寸持针钳。用3英寸持针钳夹住切口部位皮肤并向左侧颞部牵拉。用4英寸持针钳形成一个小切口 "口袋" 通过将皮肤（即浅筋膜）与颞肌分离。使用虹膜剪进一步剪除结缔组织，向左眼内侧眼角方向操作，以扩大该区域的腔隙。注意避免切入过深或损伤任何血管。
    17. 取一个双极电极，将导线塑形，使其能够贴合颞肌的曲率，两个电极叉位于左眼后方的背侧和腹侧（参见视频），双极电极的底端可垂直置于颅骨顶部。在头件与该电极之间预留足够距离，以容纳换向器电缆插头图3以确保其无阻碍地附着。
    18. 将牙科水泥粉末倒入坩埚中，起始量约为坩埚体积的1/3，随后根据需要调整用量。加入液体组分直至混合物呈水样状态，并用刮刀混合各组分。当水泥混合物变得较为黏稠时，将其涂抹于切口部位，确保覆盖皮肤的所有边缘，且边缘宽度至少为1/8 in。
      1. 在加固头端和双极电极时，涂抹适量的水泥，确保大鼠能够完全闭合双眼。若有水泥滴落到大鼠毛发的非目标区域，应立即擦除。
    19. 确保双极电极至少有4-5根导线未被水泥密封，以便旋上双极插头图3）。清除头端多余的水泥——微带顶部和三个接触针必须保持清洁。水泥会快速硬化，可能阻碍这些电极与换向器电缆插头的完全连接。使用尖头镊子清除部分干燥的多余水泥。
    20. 等待胶水变硬，胶水会变得透明。使用显微解剖剪剪去两根3T导线多余的长度，留下几厘米的操作空间。
    21. 用左手持带平台的显微解剖镊，右手持尖头显微解剖镊。用左手镊子夹住一根3T导线，位置略靠前于眼睑处。用右手镊子将眼睑向上推，以暴露更多3T导线并固定该位置。松开左手镊子，改用左手握住头件（确保此时已固定牢固）。用右手镊子剥离部分PTFE绝缘层，使导线能够与 眼轮匝肌 肌肉
      注意：拉动3T导线时需格外小心，切勿用力过猛，以免导线从接触针上脱落。若导线脱落，则无法更换接触针，因为硬化水泥在不造成颅骨破裂的情况下无法从颅骨上自由分离。
    22. 执行4.2.21中的步骤，去除第二根3T导线上的多余PTFE。
    23. 按照4.2.21所述，持取两把显微解剖镊子（平台端在左侧，尖端在右侧）。将左侧镊子置于其中一根3T导线前方稍靠前的位置，同时为右侧镊子留出空间，使其可直接位于眼睑前方。用两把镊子夹住导线。
      1. 创建一个 "钩" 保持右侧镊子不动，将左侧镊子向上并向眼睑方向旋转；此操作需一气呵成。小心松开右侧镊子，然后松开左侧镊子。
        注意：将电极钩在眼睑上有助于最大限度地减少其与角膜摩擦的可能性，同时也可降低行为测试过程中导线断裂的风险。尽管钩挂方式并不能完全防止所有动物的导线与角膜接触，但通常不会出现眼部损伤的迹象，这可通过较高的眨眼振幅（由5.1.7中的数字示波器测量）以及术后每日健康观察（如流泪过多、眼睑部分闭合、因眼部损伤导致眼球活动受限）来反映。若大鼠出现初期不适症状，应使用异氟烷进行麻醉（见4.1.10），并重新检查和/或调整电极位置。涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。需每日观察大鼠是否存在术后眼部并发症；若并发症持续存在，应寻求兽医治疗。对于出现严重眼部并发症且无法通过调整电极位置或兽医治疗纠正的大鼠，应依据东卡罗来纳大学机构动物护理与使用委员会（ECU IACUC）的标准操作规程实施人道安乐死。
    24. 对第二根3T导线执行4.2.23步骤中的操作。使用显微解剖剪剪去多余的导线。
    25. 用一只手从耳杆上松开大鼠，同时用另一只手托住其身体。检查头部是否有血液或异物，必要时进行清洁，并给予术后布托啡诺注射。
    26. 将大鼠放置在带有热源（如温控水加热垫）的恢复箱中以促进恢复。在手术记录中注明手术结束时间，并记录手术过程中有关大鼠的任何重要事项。监测大鼠的呼吸情况，当其出现胸卧姿势或开始活动时，可将其放回原饲养笼。
    27. 重新使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌（显微解剖镊除外，因其可能受损），并确保手术区域保持无菌；若需进行多次眼睑手术，应重复无菌操作程序。

5. 痕迹性眨眼经典条件反射实验流程

figure-protocol-2
图3：用于眨眼条件反射的改良操作式条件反射箱。大鼠为自由活动的哺乳动物，因此使用旋转换向器以维持与头部连接的肌电图（EMG）和双极插头之间的电信号接触。换向器连接至支架臂上，支架臂配有配重，以减轻对大鼠的压力。压电扬声器（喇叭）以85 dB强度递送2.8 kHz的声音，这些参数需定期校准。声学泡沫有助于降低环境噪声。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-protocol-3
图4：眨眼条件反射系统。该定制系统包括一个EMG积分器单元，用于过滤和放大来自大鼠的输入信号；一个刺激控制单元，可提供除声音和电击外的多种刺激；每个操作箱配备一个前置放大器，以增强EMG信号增益；以及每个操作箱配备一个刺激隔离器，可提供不同强度的电击（单位为mA）。在习惯化和习得阶段，使用一台数字示波器（不属于标准眨眼反射系统的一部分）进行诊断。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 术后5天开始进行习惯化和习得训练。每天对每只大鼠进行一次操作训练和训练装置适应，训练装置包括一个改良的操作式条件反射箱，置于较大的隔音屏蔽室内。图3）- 随后进行为期6天的习得训练。使用自行搭建的眼睑条件反射系统进行适应性和习得阶段实验。图4).
    1. 创建一份训练日志文件并打印出来，用于每日记录。该日志应预先以伪随机（或其他随机化方法）方式将大鼠分组分配至各自的训练箱中。
    2. 打开眨眼系统、计算机并运行眨眼软件。该版本的软件包含多个独立运行的模块（或应用程序）。运行“Animal”模块以创建包含受试者信息（会话编号、动物编号、性别、体重和箱号）的 *.RAT 文件。单个 RAT 文件可管理最多四只大鼠，构成一组受试动物。根据实际情况输入相应数值并保存文件。每组需要训练的大鼠应单独创建一个 RAT 文件。
    3. 将大鼠从动物房转移到测试室并关闭房门。每只大鼠操作5分钟。
    4. 将大鼠转移至指定的箱中，并将集流环电缆上的肌电图（EMG）插头和双极插头分别连接到其头部相应的EMG前置放大器和双极电极上。
      注意：大鼠初次接触换向电缆时，可能会挣扎并表现出应激迹象。操作时应小心抓握大鼠，并在多次连接失败后给予休息时间，以减轻其应激反应。
    5. 使用可旋转的换向器 360° 在大鼠于箱体内自由活动的同时，保持电信号的传递与接收。该系统有5个通道（3个用于肌电图电极，2个用于双极电极），连接至肌电图整合仪单元，对原始信号进行滤波和放大。
    6. 确认大鼠能够自由活动，且未受到换向器电缆组件或立柱臂重量的阻碍。如有必要，调整立柱后部的平衡重。检查所有插头是否牢固，然后关闭箱门。对所有大鼠执行相同的连接和检查程序。
    7. 使用示波器观察其肌电活动是否存在异常信号（例如高频和/或高幅值的电活动），如有条件，可使用视频监控系统检查其状态（例如运动活动、对环境的反应性、疼痛迹象）。在训练记录中注明所观察到的任何问题。
    8. 让大鼠在实验箱中适应10分钟，然后将其放回饲养笼中。
    9. 清洁并消毒操作箱，清扫地面，擦拭桌台。每次实验结束后均需执行上述步骤。
  2. 获取训练在连续6天（6次会话）内进行。
    1. 第1天：将大鼠转移至指定的箱中，将集流环电缆的肌电图（EMG）插头和双极插头分别连接至其头部对应的EMG前置放大器和双极电极。执行5.1.6和5.1.7中所述的相同操作步骤。
    2. 打开刺激隔离器，并将输出电流设置为 0.4 mA（如视频所示，为 10 mA 的 4%）。隔离器以交替方式在双极电极的背侧和腹侧针脚之间轮流输出电流（即在每次试验之间切换）。这有助于减少在重复刺激过程中每个肌肉部位的肌纤维疲劳。
    3. 观察所有大鼠在每次试验中产生的眼睑眨眼反应及表现出的耐受性。每完成两次试验后，将每只大鼠的电击无条件刺激（US）强度增加0.4 mA，直至达到1.6 mA（在第7次和第8次试验时）。每次试验后仔细检查所有大鼠在实验箱中的反应是否正常，确认所有放大和增益设置保持恒定，并确保来自大鼠的电信号正常（即肌电图噪声低或极少）。在获取训练的所有日子里，均使用1.6 mA的电击无条件刺激（US）强度。
      注意：如果大鼠对某一电击强度表现出疼痛反应（例如，从地面高高跳起、攀爬墙壁、四处奔跑），则暂停实验，并将电击强度调回前一毫安值（降低0.4 mA），连续进行两次试验。之后，再次给予该大鼠此前无法耐受的较高电击强度；若表现出耐受，则继续逐步增加电击强度，直至达到1.6 mA。如果大鼠对任何强度均无法耐受，则在训练过程中始终采用其能够耐受的下一个较低强度值（以0.4 mA为增量递减）。
    4. 使用示波器观察其肌电活动是否存在异常信号（例如，高频和/或高幅电活动）以及视频监控系统来检查其状态（例如运动活动、对环境的敏感性、疼痛体征
      注意：Trace ECC 说明：图中展示了一个包含采集到的肌电图波形的代表性试验片段 图1 视频中详细解释了痕迹性眼睑条件反射（trace ECC）的操作流程。痕迹性条件反射训练文件设置为共进行100次试验（每10次试验中包含90次CS-US配对试验和10次仅CS试验）th 试验）之间平均间隔30秒。整个训练过程持续约52分钟（假设无中断）。所有大鼠在第1次训练中均为初学状态，在经历数天训练后将形成不同的学习曲线（通过条件反应的表达来确定）。
    5. 开始训练：运行 Blink 软件模块。当系统提示时，选择正确的 RAT 文件和训练文件 "痕量" 眨眼条件反射
    6. 记录训练日志中的开始时间及实验人员姓名。此时应监控所有活动情况：正常的肌电图信号、对电击非条件刺激产生良好的眨眼反应（即强而频繁的非条件反应）、动物健康状况以及设备功能是否正常。将任何值得注意的事项记录在训练日志中。
    7. 数据采集由软件自动完成，以RAW文件格式保存（每只大鼠每天一个文件）。RAW文件包含EMG振幅（单位：伏特）、频率计数、潜伏期，以及惊跳反应（SRs）、非条件反应（URs）和条件反应（CRs）（总量及适应性）的面积数据。电击伪迹会掩盖UR期前100毫秒的信号，因此仅有UR期最后140毫秒的数据可用于分析UR。
    8. 训练结束后，软件将自动关闭。将所有大鼠从训练箱中取出并放回 动物房
    9. 重复步骤 5.2.5 - 5.2.6 用于所有后续训练日。在当天开始 Blink 模块前，更新 RAT 文件中的会话编号，以便为当天所有大鼠生成新的 RAW 文件。假设无大鼠被移出训练，每只大鼠应有 6 个 RAW 文件。
  3. 处理RAW文件，并生成用于统计分析的过滤后文件。
    1. 运行分析模块。以逐次试验的方式，对每只大鼠的每次实验会话进行审查，以识别存在问题的试验。此步骤用于筛查可能因各种原因而受到影响的试验例如，过高的条件刺激前基线活动、过度运动、电极脱落、导线/电线问题）。该软件包含有助于实验者检测和剔除 "错误试验" 从过滤后的数据集中排除。
    2. 将筛选后的数据导入电子表格程序，并进行相关的统计分析。

结果

眼睑闭合分析软件能够为多种测量类型提供大量且全面的数据。为简洁起见，本研究报告了具有代表性的学习与行为表现结果，包括适应性条件反应（CR）百分比、适应性CR幅度、非条件反应（UR）百分比和UR幅度。选择适应性CR时相是因为其反映了在重复训练过程中精确时序的眼睑闭合反应的获得，这是海马突触可塑性增强的结果，见于痕迹式眼睑条件反射（trace ECC）50,51,52。选择UR指标是为了阐明新生期酒精暴露导致的痕迹式ECC学习缺陷，究竟是源于联想学习的障碍，还是对电击无条件刺激（US）反应能力的受损——后者可能提示动机或运动功能差异，而非不同处理组间的学习能力差异。每项指标的数据均采用2（性别）×3（新生期分组）×6（训练阶段）的混合因素方差分析（ANOVA）进行分析，其中“训练阶段”为重复测量因子。对新生期处理的显著主效应采用Tukey事后检验进行分析，对显著交互作用则采用简单效应检验进行分析。所有统计分析均以α水平不低于0.05为显著性标准，图中结果以均值±标准误（SEM）表示。

从适应性条件反应（CR）百分比指标开始，方差分析显示新生儿分组的主效应显著，F(2,21) = 11.69，p <0.001，但性别主效应不显著（p = 0.71），且这两个因素之间无显著交互作用（p = 0.20）。如预期所示，适应性条件反应百分比在六次训练会话中显著上升，F(5, 105) = 81.15，p <0.001，且不同新生儿组之间的差异依赖于会话水平，F(10, 105) = 4.58，p <0.001。其他涉及会话因素的交互作用均无显著性。同样，在适应性条件反应幅度方面，新生儿分组的主效应也显著，F(2,21) = 22.32，p <0.001，但性别主效应不显著（p = 0.21），且两因素间无显著交互作用（p = 0.48）。条件反应幅度在六次训练会话中也显著增加，F(5, 105) = 59.27，p <0.001，且不同新生儿组之间的差异随会话水平而变化，F(10, 105) = 4.31，p <0.001。总体而言，两种条件反应指标在各组均值间均表现出显著差异，且这些均值在不同训练会话中显著分离。为确认哪些组之间存在显著差异，Tukey 事后检验显示，经酒精插管处理的大鼠（AI）在两种条件反应指标上的表现均显著差于未插管对照组（UC）和假插管组（SI）大鼠（CR 百分比：p <0.01；CR 幅度：p <0.001），而 UC 与 SI 组之间无显著差异（p's >0.05）。针对两种条件反应指标中显著的“新生儿分组 × 会话”交互作用进行的简单效应检验进一步证实，与 UC 和 SI 大鼠相比，AI 大鼠从第 2 次会话开始至第 6 次会话期间在获得条件反应方面表现出更显著的损伤（所有 p's <0.05），而 UC 与 SI 组在全部六次会话中均无显著差异。唯一的例外是 SI 大鼠的适应性条件反应幅度直到第 3 次会话才开始与 AI 大鼠表现出显著差异。这些结果如图 5A、5B所示。

在UR测量中，性别、新生期分组以及这些因素与实验阶段的交互作用均未产生显著差异。这些阴性结果表明，各组对电击US产生眨眼反应的能力相当，且AI大鼠中观察到的学习缺陷不受眨眼动机或运动差异的影响。图6A, 6B).

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图5：痕迹条件反应的获得（均值 ± 标准误）。早期酒精暴露（AI组）显著影响适应性条件反应（CR）百分比（A）和反应幅度（B）的获得。痕迹经典条件反射（ECC）本身较难建立，因此各组的测量值相对较低——在FASD的啮齿类动物模型中，延迟ECC的百分比可达80–85%21,53。尽管如此，痕迹ECC对海马的功能要求更高，而海马在早期脑发育期间易受酒精影响。* = p <0.05，** = p <0.01，*** = p <0.001（UC组与AI组大鼠之间）；样本量在括号中给出。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：非条件反应的获得情况（均值 ± 标准误）。 各组在眼睑反应表现（UR 百分比和 UR 幅度）上无显著差异。该结果表明，在获得训练期间所使用的电击强度并未对 AI 大鼠的动机或产生防御性眨眼反应的能力造成与对照组（UC 和 SI）不同的影响。样本量在括号中给出。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在出生后第4至9天接受乙醇的新生大鼠，在成年后表现出痕迹性瞬目条件反射的损伤。这些结果支持乙醇是一种致畸物，对海马功能具有持久的有害影响。总体而言，与两个对照组大鼠相比，乙醇暴露组大鼠在痕迹性条件反射实验中的条件反应水平较低。乙醇暴露大鼠的联想学习缺陷不受动机或运动功能差异的影响（即，对电刺激无条件刺激强度的眨眼反应无差异）。

尽管痕迹型眨眼经典条件反射（ECC）是阐明由挑战诱发的海马神经病理学的有用诊断工具，但对该方法所得结果的解读必须置于恰当的背景中。首先，本实验中的关键操作步骤包括：在发育中大脑已知的易损窗口期（出生后第4-9天）靶向给予乙醇、制备可记录肌电活动并传递电刺激的电极装置、上述装置的外科植入，以及随后使用评估特定认知功能的学习范式对动物进行测试。在整个过程中，每个阶段都必须注意避免对实验大鼠造成不必要的或非预期的伤害，并定期监测其健康状况。动物的行为结果为认知功能提供了“窗口”，而认知是一种心理构念，只有在动物健康未因实验误差（如乙醇给药剂量不当、装置缺陷或手术植入问题）而受损的情况下，才能被准确描述。因此，研究过程中的每一个操作环节都必须严谨实施，以确保ECC结果能够合理外推至人类。其次，ECC范式可揭示联想学习的本质，但必须注意不可将由此获得的发现泛化并广泛归因于其他认知领域——例如工作记忆、短时/长时记忆以及意识——除非实验设计中已明确纳入了这些认知领域的某些方面。例如，本实验仅考察了痕迹型ECC学习的获得阶段，而未评估大鼠在完成训练后的记忆保持能力。因此，记忆是一个独立的心理过程，应与学习能力一同进行评估。通过实验设计，可引入记忆保持间隔，以评估短时或长时记忆能力。第三，必须认识到存在多个并行的记忆系统54，这些系统可能与动机、经验及激素因素共同作用影响行为。理解这一点对于明确“关联性”（在ECC过程中）仅仅是揭示学习“优劣”的众多过程之一至关重要。最后，痕迹型ECC并非完全依赖于海马的功能，因为其他脑区也可能介导条件反应（CR）的某些成分。因此，在基于离散结果进行推论时，必须考虑不同神经回路之间的相互作用，以及研究中所使用的刺激参数类型。例如，小脑也参与痕迹型ECC，影响CR的拓扑特征和反应时序，尤其是在刺激间间隔（ISI）较短的情况下。在人类中，若使用较长的痕迹间隔（1,000 ms）进行测试，小脑损伤患者的表现不受影响；但若使用较短的痕迹间隔（400 ms），则表现会受到影响34。此外，在小鼠中，针对前扣带回和内侧无颗粒皮层区域的双侧背内侧前额叶皮层（mPFC）损毁会阻碍痕迹型CR的获得55；而在兔中损毁尾部mPFC也会产生类似结果46。这些发现进一步强调了在评估如痕迹型ECC这类由小脑-脑干驱动的联想学习时，需考虑不同物种间前额叶贡献的差异性。尽管在本研究及其他研究中，出生后第4-9天的新生儿期乙醇暴露对成年大鼠获得500 ms痕迹型CR产生了不利影响47,56，但在经历300 ms痕迹间隔的新生儿期乙醇暴露大鼠中并未观察到相同情况，即使其接受相对高剂量的乙醇（5 g/kg）挑战时也是如此57，这表明乙醇暴露大鼠的痕迹型学习障碍依赖于痕迹间隔的持续时间。

本研究强调海马在介导痕迹性眨眼经典条件反射（trace ECC）中的关键作用；当受到新生期酒精暴露的挑战时，海马会表现出与神经损伤相关的功能障碍，反映为痕迹性条件反应（CR）习得能力的受损。然而必须指出，小脑-脑干神经回路，特别是中间位核（interpositus nucleus），对于包括痕迹性ECC在内的多种ECC任务的多个方面均至关重要，包括条件反应的习得、表达及其拓扑特征36,40,55,58,59。事实上，该神经回路会与海马相互作用，共同驱动高级形式ECC（如痕迹性ECC）中条件反应的表达60。目前尚不完全明确早期脑发育阶段的酒精暴露是否特异性影响痕迹性ECC中的海马功能。许多不同的脑区均易受早期酒精损伤的影响，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、小脑和海马18,19,23,47,61,62，酒精极有可能以不同程度干扰这些脑结构的功能，并在多种ECC程序中导致具有重要功能差异的表现。尽管在解释痕迹性ECC研究结果时存在诸多局限，但已有动物损毁研究证实，成功习得痕迹性条件反应至少依赖于结构完整的海马42,44,63,64,65。因此，该方法仍是展示发育期酒精暴露与痕迹性条件反应之间关联的极具价值的手段，因为相较于其他依赖海马的任务（如Morris水迷宫中的位置学习、新物体识别以及情境性和痕迹性恐惧条件反射），其背后的神经回路机制已被更为深入地阐明。

将眼动经典条件反射（ECC）作为一种行为学方法用于“检测”认知功能，在发育神经毒理学领域具有广泛的应用价值。事实上，我们实验室近期的研究结果支持这样一个观点：发育中的海马对酒精作用高度敏感，而这种敏感性可能通过不同的干预策略得以缓解18,47。本方法的关键优势在于，通过对酒精暴露引起的痕迹型ECC学习缺陷的深入理解，可预测关联学习之外的其他海马依赖性功能障碍——特别是那些已知由相同海马神经环路介导的功能异常。

将痕迹眼动经典条件反射（trace ECC）及其其他变体（例如，延迟型、逆转型、辨别型、复合型）应用于揭示与联想学习相关的神经生物学机制和神经系统，其应用范围可超越胎儿酒精研究领域。例如，该范式在精神疾病（如精神分裂症66,67）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病68,69）以及药物成瘾70,71,72 的人类病例和动物模型中已受到广泛关注。因此，作为一种评估神经认知功能与功能障碍的研究方法，其优势在包括神经科学在内的众多心理学和生物医学学科中均显而易见。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了酒精饮料医学研究基金会（ABMRF）向 TDT 提供的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
新生期酒精暴露
190 证明乙醇（USP）Pharmco-AAPER225-36000 [ECU 医用储藏室]可替换；应为 USP 级；避免使用 200 证明乙醇
幼鼠容器/篮子任意
玉米油任意食品级
带垫片的加热水泵治疗仪GaymarTP-500用于保持幼鼠温暖；可替换
一次性无菌皮下注射针头 22G × 1 英寸任意
一次性无菌皮下注射针头 30G × 1/2 英寸任意
70% 异丙醇EMD MilliporePX1840-4 [Fisher Scientific]可替换；试剂级
www.fishersci.com
Long-Evans 大鼠（雌性与雄性种鼠）Charles River LaboratoriesN/A [ECU 比较医学部]需明确年龄与体重；价格因这些因素而异
www.criver.com
微型解剖剪刀，3.5 英寸，23 毫米刀片Biomedical Research Instruments11-2200用于切割聚乙烯管
brisurgical.com
聚乙烯 10 型管（内径 0.011 英寸；外径 0.024 英寸）BD Diagnostic Systems22-204008 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
聚乙烯 50 型管（内径 0.023 英寸；外径 0.038 英寸）BD Diagnostic Systems22270835 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
温控水浴锅或婴儿奶瓶加热器任意可选；有助于加热冷却的乳液
无菌结核菌素注射器，1.0 ml任意
无菌结核菌素注射器，10 ml任意可用于吸取乙醇，或使用合适量程的移液器
电子天平任意应具备良好的分辨率（以克为单位）
名称公司目录编号备注
EMG 头端制作与双极电极改装
双通道不锈钢绞合双极电极Plastics One, Inc.MS303/2-B/SPC  ELECT SS  2C TW .008"必须指定基座下方 20 mm 的定制长度
www.plastics1.com
Centi-Loc 条形插座绝缘子（又称 Micro Strip）ITT Cannon / ITT Interconnect SolutionsCTA4-IS-60* 或 CTA4-1S-60**取决于供应商；参见 www.onlinecomponents.com 或 www.avnetexpress.avnet.com
带齿牙科钳CMF Medicon390.20.05可替换；用于将导线压接到雄性触针上
www.medicon.de
微型解剖剪刀，3.5 英寸，23 毫米刀片Biomedical Research Instruments11-2200仅用于剪切 3T 导线；剪切 10T 导线会损坏刀片——应使用剥线钳的刀刃
brisurgical.com
聚四氟乙烯（PTFE）涂层不锈钢导线，10T（裸线直径 0.010 英寸）Sigmund Cohn-Medwire316SS10T
www.sigmundcohn.com
聚四氟乙烯（PTFE）涂层不锈钢导线，3T（裸线直径 0.003 英寸）Sigmund Cohn-Medwire316SS3T
www.sigmundcohn.com
剃须刀片任意用于从双极电极插脚上剥离 1 mm 的绝缘层
Relia-Tac 插座雄性触针Cooper Interconnect220-P02-100参见 Allied Electronics 目录号 70144761
www.alliedelec.com
高精度带齿镊子，4 3/4 英寸Electron Microscopy Sciences78314-00D在用光滑镊子剥离 PTFE 时，用于牢固夹持 10T 导线
www.emsdiasum.com
高精度光滑镊子，4 3/4 英寸Electron Microscopy Sciences78313-00B
www.emsdiasum.com
超细尖端镊子，4 3/4 英寸Electron Microscopy Sciences78510-0用于从 3T 导线一端剥离 1 mm 的 PTFE；用光滑镊子夹持屏蔽部分
www.emsdiasum.com
剥线钳，16-26 AWG任意使用刀片端切割微型条带
名称公司目录编号备注
眼睑手术
外科器械（高质量不锈钢）
2 × 带齿敷料钳，4 英寸Biomedical Research Instruments30-1205可替换；额外敷料钳用于手术托盘外夹持电极/螺丝
brisurgical.com
带齿敷料钳，3 英寸Biomedical Research Instruments30-1200可替换
brisurgical.com
器械托盘Biomedical Research Instruments24-1355可替换
brisurgical.com
3 号刀柄，5 英寸Biomedical Research Instruments26-1000可替换
brisurgical.com
微型解剖镊，3.5 英寸，细尖Biomedical Research Instruments10-1630可替换
brisurgical.com
微型解剖镊，3.5 英寸，光滑平台（0.3 × 5 毫米）Biomedical Research Instruments10-1720
brisurgical.com
微型解剖剪刀，3.5 英寸，极精细，15 毫米刀片Biomedical Research Instruments11-2000可替换
brisurgical.com
普通碎屑镊，3.5 英寸 Biomedical Research Instruments30-1600可替换
brisurgical.com
#10 不锈钢手术刀片（适配 #3 刀柄），无菌任意可替换
0-80 × 0.125 英寸不锈钢螺丝Plastics One, Inc.0-80 × 0.125可替换
www.plastics1.com
酒精消毒棉片，无菌Fisher Scientific22-363-750 [Fisher Scientific可替换
www.fishersci.com
聚维酮碘（Betadine）Purdue Frederick Co.6761815101 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
聚维酮碘（Betadine）消毒棉片Moore Medical19-898-946 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
灭菌棉签，可高压灭菌任意通常为 7.6 厘米或 15.2 厘米长
手摇钻钻头，#55（0.052 英寸）任意金属应耐锈蚀和腐蚀
纱布垫，2 英寸 × 2 英寸Fisher Scientific22-362-178 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
通用乳胶/丁腈/乙烯基手套任意
玻璃珠灭菌器任意用于手术间器械灭菌
带垫片的加热水泵治疗仪 × 2GaymarTP-500可替换；建议使用独立泵——1 个用于手术，1 个用于恢复
一次性无菌皮下注射针头 26G × 3/8 英寸任意
异氟烷VedcoNDC 50989-150-12制造商可替换；可能需要兽医批准
桌面式非重复呼吸异氟烷蒸发器系统Parkland ScientificV3000PK可替换
www.parklandscientific.com
珠宝商螺丝刀，1.8-2 毫米刀头任意金属应耐锈蚀和腐蚀
Ortho-Jet BCA 套件（牙科水泥）Lang DentalB1334包含粉末（1 磅）和液体
www.langdental.com
大型带减压阀的氧气罐本地供应商
高型釉面瓷坩埚，10 毫升CoorsTek, Inc.07-965C [Fisher Scientific]可用 Fisher FB-965-I 宽型坩埚替换
www.fishersci.com
无菌兽用眼膏 PuralubeHenry Schein CompanyNC0144682 [Fisher Scientific]可替换
www.fishersci.com
Quatricide PV-15PharmacalPV-15抗菌消毒剂；可替换
www.pharmacal.com
用于立体定位手术的大鼠气体麻醉面罩 Stoelting Company51610
www.stoeltingco.com
带耳杆的大鼠立体定位仪（45 度）任意建议使用 45 度耳杆，以防止损伤鼓膜
Roboz 外科器械润滑乳Roboz SurgicalNC9358575 [Fisher Scientific]可替换；用于高压灭菌时润滑器械
www.fishersci.com
啮齿类动物毛发修剪器任意
氯化钠Fisher ScientificS641-500 [Fisher Scientific]用于配制 0.9% 生理盐水；试剂级；USP
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不锈钢微型刮刀（刀片：0.75 英寸长 × 0.18 英寸宽）Fisher Scientific21-401-15 [Fisher Scientific]可替换
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Starrett 手摇钻，0.000–0.055 英寸任意建议使用镍镀层或等效材料，以抗锈蚀和腐蚀
无菌外科手套任意
灭菌包裹布，20 英寸 × 20 英寸，可高压灭菌Propper Manufacturing11-890-8C [Fisher Scientific]用于包裹可高压灭菌物品，以及手术中无菌区域覆盖
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外科洞巾，无菌/可高压灭菌任意可能需要根据大鼠体型裁剪
外科手术服*任意*如 IACUC 要求
外科口罩任意
无菌结核菌素注射器，1.0 ml任意
电子天平任意应具备良好的分辨率（以克为单位）
名称公司目录编号备注
眼睑系统及组件（假设为 4 只大鼠系统）
5 通道换向器 × 4Plastics One, Inc.SL2 + 3C
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双 305 型双极电极电缆 × 4Plastics One, Inc.305-305 80CM TT2 (C)提供大鼠双极电极与换向器的插头端；必须改装
www.plastics1.com
5 通道屏蔽电缆，26 AWG × 4任意用于制作换向器电缆；需从零开始制作
操作箱室（内部尺寸：24 英寸高 × 23 英寸宽 × 14 英寸深）× 4Med-Associates可替换；内部尺寸应能舒适容纳操作箱，留有吸音泡沫空间；配备风扇——55–60 分贝
www.med-associates.com
眼睑系统与软件JSA DesignsN/A专有且为研究实验室定制
热缩管（直径 3/16 英寸、1/4 英寸、3/8 英寸、1/2 英寸）任意用于保护改装后换向器电缆的焊接端与接头
三峰密胺吸音泡沫（带黑色氯丁橡胶涂层，24 × 48 英寸）McMaster-Carr9162T5可替换；裁剪以适配 4 个饲养箱
www.mcmaster.com
完整操作测试箱（外部尺寸 12.5 英寸长 × 10 英寸宽 × 13.5 英寸高）× 4Med-AssociatesENV-007 定制套装含不锈钢网格地板与定制顶盖（中心有 3 英寸孔用于换向器电缆）
www.med-associates.com
示波器（可选）任意建议最低规格：200 MHz 模拟带宽，1 GS/s 实时采样率，4 通道；参见 www.picotech.com
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压电高音扬声器 × 4（7 × 3 英寸）MCM Electronics53-805必须符合眼睑系统频率范围要求（2500 Hz – 25 kHz）
www.mcmelectronics.com
焊台、焊料、助焊剂、镀锡剂任意用于将 26 AWG 电缆焊接到雌性插座（适配雄性 Relia-Tac 触针）和双极插头
刺激隔离器 × 4WPI InternationalA365该设备使用 16–9V 碱性电池；亦有合适的可充电版本（A365R）
www.wpiinc.com
用于 SL3C 换向器的三极电极电缆 × 4Plastics One, Inc.335-335 80cm TT3 C提供大鼠 EMG 头端与换向器的插头端；必须改装
www.plastics1.com
USB LED 灯 × 4任意基于 USB 的灯不会对大鼠 EMG 信号造成电“噪声”
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网络摄像头 × 4，监控软件任意
运行 MS Windows 操作系统的 PC 计算机任意

参考文献

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