本文描述了一种同时测量血小板功能和凝血功能的止血实验模型。该模型可实时检测血小板和纤维蛋白的荧光信号，并测定血小板黏附速率、凝血速率以及凝血启动时间。该模型用于评估输注用浓缩制剂中血小板在流动条件下的促凝血特性。
方法文章
一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成 微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学
本文内容
摘要
摘要
血小板功能在流体剪切力条件下的微流控止血模型分析，通常在抗凝剂存在时仅限于血小板沉积的评估。钙离子（Ca2+）依赖性凝血过程与血小板功能之间存在复杂关联，因此在分析前需对血液进行精确且可控的再钙化处理。本实验装置采用Y形混合通道，在灌注前将浓缩的Ca2+/Mg2+缓冲液引入流动血液中，实现快速再钙化，同时避免样本停滞。两个储液器之间十倍的流速差异可最大限度减少稀释效应。再钙化后的血液随后流经胶原包被的分析腔室，通过差异性标记，可利用荧光视频显微镜实时成像血小板和纤维蛋白的沉积过程。该系统仅使用 commercially available 工具，有助于提高标准化可能性。通过将储存的血小板浓缩物加入血小板减少症血液中进行重建，还可模拟血小板输注，证明其在该研究领域的应用价值。示例数据表明，凝血启动和纤维蛋白沉积与血小板浓度呈线性相关，验证了本模型中初级止血与次级止血之间的关联性。在16分钟的灌注时间内，即使将Ca2+和Mg2+恢复至正常水平，接触激活途径仍未启动。当使用玉米胰蛋白酶抑制剂抑制凝血因子XIIa时，该时间窗进一步延长，表明该系统具有较宽的动态范围，可用于评估血小板促凝活性的变化。将组织因子与胶原共固定可显著缩短凝血启动时间，但不影响其速率。该检测方法支持对组织因子途径和/或接触途径进行独立研究，从而提升了其实验灵活性与应用广度。
引言
最初，初级和次级止血被视为两个相对独立的生化过程。初级止血被认为在动脉血流条件下起主要作用，其中血小板发挥关键功能；而次级止血则被认为在静脉血流条件下主导凝血过程，通过蛋白酶级联反应生成不溶性纤维蛋白。近几十年来，这一传统观点已发生显著改变，人们认识到血小板活化与凝血过程相互依赖，在所有（非极端）流体动力学环境中，二者在生理性和病理性止血过程中均具有同等重要性。这一新认识已逐步应用于临床，目前越来越多地采用旨在全面测量全血凝固功能的检测方法，尽管关于其相关性、适用性和实用价值仍存在诸多未解问题1。
我们最近发表了一项利用涂有纤维状胶原的微流控流动腔对血小板浓缩物进行功能分析的研究 体外 输血模型2，样本中含有正常数量的红细胞、血浆和血小板。该方法使用肝素或水蛭素抗凝的血液，意味着不涉及或仅有限涉及依赖凝血酶生成和离子钙（Ca²⁺）的继发性止血过程。2+）。为了促进凝血酶的形成，从而在微流控流动条件下涵盖止血过程的全部方面，我们在同一技术平台上开发了一种互补方法，该方法现在包含游离 Ca2+通过这种方式，可在血小板输注模型中再次研究血小板沉积和纤维蛋白形成，以评估血小板浓缩物的质量。
在该方法中，血小板和纤维蛋白原被标记上具有完全分离发射光谱的荧光染料。双色实时视频显微镜技术从而能够分析血小板的初始黏附、凝血启动以及纤维蛋白沉积过程。此类检测中的一个重要变量是再钙化，因为在灌注前将Ca2+加入静置的血液中，不可避免地会在容器内引发接触性凝血。这种提前启动的凝血会因在灌注前堵塞管路和生物芯片入口而影响检测结果。因此，在我们的方法中，柠檬酸盐抗凝血液和含Ca2+的缓冲液分别通过Y形进样室的两个上支通道由泵驱动输送。在进入分析室之前，两组分在灌注过程中混合，分析室的表面包被有胶原蛋白，或胶原蛋白联合重组人组织因子（rhTF）。通过调节两个泵的流速以及缓冲液中Ca2+的浓度，最终血液样本被稀释10%。
通过本扩展方案，我们展示了凝血因子XII（FXII）和血小板浓度在流动条件下对接触途径凝血启动的贡献。我们的数据还表明，通过将重组组织因子（rhTF）与胶原蛋白共同包被，可同时测量组织因子途径。
方案
本方案遵循机构关于人体样本研究的伦理准则，并已获得所有供体的知情同意。本研究所述实验已获得安特卫普大学医院机构审查委员会的批准（批准编号 16/10/120）。
注意：温度指示均为室温，除非另有说明。
1. 微流控装置设置
- 准备微流控流动室通道、管路和连接针
- 通过涡旋振荡重悬胶原蛋白原液小瓶，然后用生产商提供的等渗葡萄糖溶液稀释至终浓度为 50 µg/mL。
注意：使用马腱来源的胶原蛋白，主要由 I 型纤维构成。这种 I 型马胶原蛋白常被称为“Horm”胶原蛋白，由于历史和生物学原因，是此类检测的金标准。也可使用人 III 型胶原蛋白，但其纤维包被效果较差，血小板反应也较弱。其他包被表面也可使用，例如血管性血友病因子、纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、血栓反应蛋白-1，或这些蛋白的组合3。 - 取一个新的、一次性微流控生物芯片，其具有八条直的平行通道，尺寸（毫米）为 0.4 宽 × 0.1 高 × 20 长。在芯片一端的通道中加入 0.8 µL 胶原蛋白溶液，并将此端标记为出口。仅填充通道长度的 5/6，以确保胶原纤维不包被在通道入口处，避免造成堵塞，影响有效灌注。
- 将生物芯片置于湿润密封容器中，在 4 °C 下孵育至少 4 小时。
- 若需研究组织因子（外源性）介导的凝血与接触途径（内源性）的联合效应，需在通道内包被胶原蛋白和重组人组织因子（rhTF）。
- 将 rhTF 溶于 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐水（HBS；0.9% (w/v) NaCl，pH 7.4）中，稀释比例为 1:3,000（储备液浓度：4.5 nM）。
- 从出口端移除胶原包被液。向通道出口加入 0.8 µL 的 rhTF-HBS 溶液（储备液稀释 1/500，终浓度：9 pM），填充通道长度的 5/6，方法与胶原包被策略相同。
- 将生物芯片在湿润密封容器中额外孵育 30 分钟。
- 从另一端（标记为入口）开始，用封闭缓冲液（HBS 中含 1.0% (w/v) 牛血清白蛋白和 0.1% (w/v) 葡萄糖）填充已包被的通道。在混合生物芯片中，用相同的封闭缓冲液填充相同数量的 Y 形通道。
- 确保所有通道及其分支均完全充满封闭缓冲液。将两个生物芯片在湿润密封容器中孵育至少 1 小时。
- 对每个使用的通道，准备两根 8 cm 长的管路、一根 2 cm 长的管路和一根 46 cm 长的管路。在三根较短管路的一端以及最长管路的两端各插入一根针。
- 通过涡旋振荡重悬胶原蛋白原液小瓶，然后用生产商提供的等渗葡萄糖溶液稀释至终浓度为 50 µg/mL。
- 准备冲洗泵
- 用蒸馏水冲洗所有泵流路及连接管路。
- 使用精密无尘擦拭布和变性酒精清洁生物芯片模具，以去除指纹和灰尘。
- 在将管路连接至生物芯片前，先用封闭缓冲液充满所有管路。
- 将包被好的生物芯片固定在自动显微镜载物台上。使用实验室剪式千斤顶将混合生物芯片固定在与显微镜载物台相同高度的位置。
- 使用 46 cm 长的最长管路连接包被生物芯片和混合生物芯片。确保两个芯片之间保持适当距离，使管路呈灵活但笔直的状态。
- 将一个注射器连接针插入冲洗泵的鲁尔接口管路中，连接至 2 cm 管路的自由端，并将另一端固定在包被生物芯片的出口。
- 使用针将两根 8 cm 管路固定在混合生物芯片的入口端。将每根管路的自由端插入 HBS 小瓶中。用 1 mL HBS 冲洗所有管路和通道。
注意：由于冲洗泵的抽吸作用，HBS 从小瓶经 8 cm 管路流入混合芯片，再经 46 cm 管路流向包被芯片（从非包被区流向包被区）。此步骤可去除封闭缓冲液以及附着不牢的胶原蛋白（或双包被芯片中的 rhTF）。
- 准备灌注泵
- 打开灌注泵的驱动软件。在软件中双击注射器图标以初始化泵。
- 选择将使用的注射器类型：凝血缓冲液使用 1 mL 注射器，重建血液使用 2 mL 注射器。
- 将注射器连接至生物芯片装置
- 断开冲洗泵及所有管路，仅保留连接两个生物芯片的那根管路。断开的管路将在后续步骤中重复使用。
- 将 2 cm 管路及其注射器连接针连接至厚壁废液管的鲁尔锁接口。使用注射器向厚壁管中填充标准胃蛋白酶溶液。
注意：在废液管中加入胃蛋白酶可抑制并裂解灌注后形成的血凝块，从而防止系统末端发生堵塞。 - 用科赫钳夹紧厚壁管的开口端。在其下方放置含漂白剂的合适废液容器，用于收集流出液。
- 将管路及其针固定在包被生物芯片的出口端。
2. 血液样本的制备
- 从健康志愿者采集血液并分离其组分4
- 使用真空乙二胺四乙酸（EDTA）采血管采集血液。该样本仅用于通过自动化血液分析仪进行全血细胞计数（CBC）。
- 使用真空采血管（含枸橼酸钠）采集血液。每个通道需要5 mL血液。
- 将样品置于水平旋转仪上，等待血液重组。
注意：该检测应在采血后3小时内完成。血小板浓缩液与全血样本需进行ABO/RhD血型匹配。 - 离心13分钟，250 × g，以制备富血小板血浆（PRP）。禁止使用离心机刹车，以防扰动松散的沉淀物。
- 将PRP转移至新的锥形离心管中。在4,500 × g条件下离心10分钟（使用刹车），使血小板沉淀，制备血小板贫乏血浆（PPP）。弃去血小板沉淀。将PPP置于37℃水浴中孵育 °C.
- 使用21 G针头穿刺原离心管底部，将压积红细胞转移至新的锥形管中。
注意：浓缩红细胞组分中的残余血小板计数为11 ±4 × 103 灌注 µL（均值 ± 标准差，n = 10。
- 重建血液
- 使用自动化血液分析仪测定步骤 2.1.6 中制备的浓缩红细胞的血细胞比容。
- 使用自动化血液学分析仪测定将用于分析的血小板浓缩液的血小板浓度。
- 计算获得40%红细胞压积和250 × 10⁹/L血小板浓度所需的浓缩红细胞、血小板浓缩液和血小板贫乏血浆（PPP）的体积。3 血小板µ在2.5 mL的终体积中。混合以制备重建血液，并进行全血细胞计数（CBC）。
注意：可根据研究问题使用其他细胞目标滴度。 - 准备一个 "空白" 对照样品，其中血小板浓缩物体积被等体积生理盐水替代，以确定浓度 "内源性" 血小板（即， 非血库血小板
- 标记重组血液中的血小板和纤维蛋白原
- 移液 13 µL 的 10.7 mg/mL Alexa Fluor 405 标记纤维蛋白原溶液（70 µg/mL 终浓度）于试管中，并加入 1 mL 重悬血液。
注意：纤维蛋白原使用商用试剂盒，按照制造商说明书进行标记。 - 在含有2的试管中，另取1 mL重悬血液混合 µ1 mM DiOC 的 L6 (1 µM 终浓度）或含有 2 µ5 mM Calcein AM 的 L µM终浓度）。将其加入含有含纤维蛋白原血液的试管中，得到终体积为2 mL的血小板和纤维蛋白原标记血液。
注意：染料的选择可能取决于研究问题或研究人员的偏好5需注意，任何染料的激发均可能引起光化学伪影。 - 轻轻颠倒混匀。将样品在37℃孵育10分钟。 °C.
- 移液 13 µL 的 10.7 mg/mL Alexa Fluor 405 标记纤维蛋白原溶液（70 µg/mL 终浓度）于试管中，并加入 1 mL 重悬血液。
- 配制凝血缓冲液
- 配制含有 10 mM CaCl₂ 的凝血缓冲液2 和 3.75 mM MgCl2 在 HBS 中。为一个通道配制 1 mL 凝血缓冲液。
- 通过0.2 μm滤器对凝血缓冲液进行过滤除菌 µm 滤器。将其预热至 37 °C.
3. 灌注实验
- 将显微镜光学系统聚焦于粘附在通道底部的胶原纤维。使用相差或微分干涉差（DIC）成像模式。在实验软件中选择“为选定的拼接区域设置当前Z值”，以数字方式固定所选焦平面。
- 使用显微镜采集软件在选定通道中定义感兴趣区域（ROI）。
注意：ROI可任意选择灌注通道内的任意表面区域。建议避免在入口和出口附近分析血栓形成和纤维蛋白生成，以防止获取分布不均的血栓图像。ROI的表面积应包含足够数量的血栓，以便通过多个血小板平均化信号变异性。ROI在通道xy平面中的位置应始终保持固定，并在灌注前预先确定。如有需要，可将未包被区域纳入分析，以判断血小板是否非特异性结合至生物芯片塑料表面。 - 准备灌注样品
- 将装有1 mL预热凝血缓冲液的1 mL注射器安装至灌注泵中。
- 轻轻倒置混匀预热的重组血液，并将2 mL转移至2 mL注射器中。
- 确保两个注射器中均无气泡，并使用注射器连接针将各自连接至一段8 cm长的管路。
- 以高速（400 µL/min）对两个注射器的连接件和管路进行预灌注，当管路完全充满凝血缓冲液或血液后停止。
注意：通过预灌注管路，可在实验开始时使凝血缓冲液与重组血液立即在混合生物芯片的Y形通道中混合，避免向灌注腔室引入气泡。
- 使用固定针将两根管路的另一端分别固定至混合生物芯片中Y形通道的分叉支臂。下支用于灌注凝血缓冲液，上支用于灌注重组血液。
- 启动灌注，使凝血缓冲液流速为4.4 µL/min，重组血液流速为44 µL/min。移除废液管出口处的科赫钳，以允许灌注进行。
注意：流速可根据具体研究问题进行调整。启动秒表，以确定实验开始至实时图像采集开始之间的时间间隔。 - 使用显微镜的采集与实验软件，每10秒实时记录一次图像，持续30分钟。当重组血液与凝血缓冲液的混合液进入安装在显微镜载物台上的包被生物芯片时，开始记录。
注意：可根据实验设置采用其他时间序列。使用100倍放大倍数（10倍物镜和10倍目镜）。
4. 结束实验
- 30 分钟后或信号饱和时（以较早者为准），停止泵和图像采集。拆下所有管路和注射器，并将其作为生物危害废物丢弃。
5. 数据分析
- 使用图像分析软件确定血栓生长（绿色荧光）和纤维蛋白形成（紫色荧光）的动力学。以下命令针对此处使用的特定软件：
- 打开插件 Processing: stitching ，以拼接每个时间点的并排图像。
- 打开插件 Image Analysis，以确定血小板的表面覆盖面积。
- 打开插件 Measure。通过绘制一个包含所有血栓和纤维蛋白纤维的矩形区域来定义感兴趣区域（ROI）；在本方案中，ROI为面积637 mm2的矩形。
选择标签页 All Views，以包含所有记录的时间点。 - 使用 Create Tables 自动生成一个电子表格，其中将包含每个时间点所选矩形区域的平均荧光强度值。
- 将电子表格保存为 xml 格式。
- 在电子表格程序中打开电子表格以进行进一步计算。
- 从所有数据中减去初始（背景）值。
- 绘制绿色（血小板）和紫色（纤维蛋白）染料的荧光信号随灌注时间变化的曲线。
注意：需考虑泵启动与图像采集实际开始点之间的时间间隔。在此模型中，血栓形成通常分为两个步骤：（1）血小板“缓慢”黏附（i.e., 黏附）至固定的胶原蛋白，随后为（2）由凝血驱动的血栓快速生长，表现为血小板结合（i.e., 聚集）和纤维蛋白沉积（i.e., 凝血）的“快速”增加（图1）。 - 通过线性回归计算血小板黏附和聚集阶段的斜率；该斜率反映了血小板血栓在各形成阶段的生长动力学。
- 计算纤维蛋白凝固的斜率，并将该直线外推至与X轴相交，以确定凝血起始时刻。
结果
实时原始数据的分析见图1。首先，血小板黏附于反应表面，导致记录到的绿色荧光信号持续上升（图1A，i），此过程称为黏附。在此阶段，紫色荧光信号较弱，表明纤维蛋白尚未形成或仅少量生成（图1B）。当凝血启动后，发出紫色荧光的纤维蛋白迅速沉积（iii），同时血小板的绿色荧光以大致相同的速度增加，此处将其定义为血小板聚集（ii）。因此，单次实验可获得三个荧光增强速率（i、ii 和 iii），作为该模型中血小板与纤维蛋白沉积速度的替代指标。此外，还可推算出凝血启动的时刻（启动时刻（iv）），该参数是评估血小板促凝潜能的重要决定因素。
在缺乏组织因子（TF）的情况下，凝血启动缓慢，主要通过接触途径进行，其中内源性X酶复合物通过直接激活FIX来活化FX6 由 FXI 和/或 FXII 引发。为证明对 FXII 的依赖性， 4 µM 加入玉米胰蛋白酶抑制剂（CTI）以抑制活化的FXII（FXIIa）7。这种抑制作用不影响血小板黏附（图 2A），但在灌注实验预设的整个持续时间内并未开始凝固（图2B 和 补充视频 1).
体外接触途径可由玻璃等异物材料启动，或在临床检测中通过使用高岭土等矿物材料来启动。 体内，活化的血小板提供负电荷8 通过膜暴露酸性磷脂9，如磷脂酰丝氨酸，和/或通过释放多聚磷酸盐（polyP）10,11我们的微流控实时检测方法模拟了后一种情况，因为在一定范围的血小板浓度内，止血反应依赖于血小板计数图3）。通过增加重建样本中血小板的数量，黏附速率（图3A），积累（图3B，绿色）和凝固（图3B，紫光）强度呈线性增加。反应起始时间显著缩短（图3C通过增加血小板浓度，表明需要一定数量阈值的（活化后）沉积血小板才能触发凝血。
组织损伤后 体内，然而，在存在 Ca²⁺ 的情况下，携带组织因子（TF）的细胞将通过 FVIIa-TF 外源性凝血酶原复合物启动血液凝固2+。在我们的实验装置中，通过在含胶原的灌注腔上进行脂化重组人组织因子（rhTF）的后续包被来模拟这一过程。在对仅包被胶原或联合包被rhTF的通道进行配对分析时，凝血启动显著加快（图4A）。血小板黏附速率呈非线性，因此无法进行线性回归分析（数据未显示）。不同条件下凝血速率和血小板聚集程度均无显著差异。图 4B-4C, 补充视频 2).
图1：微流控灌注腔中血小板黏附与凝血的回归分析。该图阐明了在反应性表面进行复钙血液流动期间，从实时荧光原始数据中获得的参数。（A）绿色荧光的平均强度反映了血小板沉积随灌注时间的变化。曲线描述了一个双相过程：首先（i）为缓慢线性增加的血小板黏附，随后（ii）为快速线性增长的聚集。曲线的这两个线性部分分别进行回归分析，其斜率代表通过血小板荧光所测得的血栓形成的两个速率：（i）黏附速率和（ii）聚集速率。（B）紫色荧光的平均强度反映了纤维蛋白随时间的沉积情况。在血小板黏附阶段，紫色荧光基本不存在，而在凝血启动后迅速增强。（iv）凝血启动时刻定义为纤维蛋白荧光所表征的血栓形成的第二阶段（即此处定义的凝血阶段）线性回归外推线与横轴的交点。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：在缺乏组织因子（TF）的情况下，胶原包被的灌注流动腔室中的凝血依赖于 FXIIa。 在剪切速率为 1,000 s-1 的条件下，对含有 CTI 或对照缓冲液（CONTROL）的重建血液进行微流控灌注，总时长为 30 分钟。（A）血小板黏附速率（s-1）不依赖于 CTI。（B）经 CTI 处理的样本的起始时刻超出实验设定的 30 分钟时限（以虚线表示），表明该参数依赖于 FXIIa。柱状图和散点表示均值，须线表示标准差。统计分析采用配对 t 检验。（NS = 无显著性差异，n ≥ 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：流动条件下的凝血依赖于血小板数量。在胶原包被的微流控灌注腔室中，使用重组血液在 Ca2+ 存在下进行实验，并改变血小板浓度（n ≥3）。(A) 血小板黏附速率，(B) 血小板聚集速率（绿色）和凝血速率（紫色），以及(C) 凝血起始时间，均以重组血液中血小板浓度的函数形式展示。圆点代表平均值，须状线代表标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：组织因子（TF）和接触途径凝血的激活均显著缩短凝血起始时间。 在存在 Ca2+ 的条件下，将重建血液灌注通过仅包被胶原或同时包被胶原与重组人组织因子（rhTF）的腔室，以分别研究接触途径或同时研究接触途径与TF途径的凝血过程。(A) 在含有TF的流动腔室中，凝血起始时间显著缩短。(B) 凝血过程中血小板的聚集速率以及(C) 凝血速率在仅包被胶原或同时包被胶原与rhTF的流动腔室之间无显著差异。柱状图与数据点表示均值；误差线表示标准差。统计分析采用配对t检验。（NS = 无显著性，*P <0.05，n ≥3）。请点击此处查看此图的放大版本。
补充视频 1：在无组织因子（TF）的情况下，胶原包被的灌注流动腔室中的凝血依赖于FXIIa。 在胶原包被的灌注流动腔室中确定接触途径的作用。（A）在无CTI存在时，血小板（绿色）和纤维蛋白原/纤维蛋白（紫色）沉积的叠加荧光图像序列。（B）与图A相同序列，但关闭绿色通道。（C）在有CTI存在时，血小板（绿色）和纤维蛋白原/纤维蛋白（紫色）沉积的叠加荧光图像序列。（D）与图C相同序列，但关闭绿色通道。请点击此处下载该视频。
补充视频 2：组织因子（TF）和接触途径的同时激活显著缩短凝血起始时间。 为研究TF的作用，使用仅包被胶原或同时包被胶原与重组人组织因子（rhTF）的流动腔室。(A) 仅包被胶原的流动腔室内血小板（绿色）和纤维蛋白原/纤维蛋白（紫色）沉积的叠加荧光图像序列。(B) 与图A相同序列，但关闭绿色通道。(C) 包被胶原和rhTF的流动腔室内血小板（绿色）和纤维蛋白原/纤维蛋白（紫色）沉积的叠加荧光图像序列。(D) 与图C相同序列，但关闭绿色通道。 请点击此处下载该视频。
讨论
血小板浓缩物输注用于血小板减少症患者，以预防或制止出血。其临床意义最近在一篇关于急性白血病的历史性综述中得到强调12，该综述指出，20世纪六七十年代儿童患者的生存率提高在很大程度上归功于（血小板）输血医学的进步。血小板浓缩物也用于控制急性创伤或手术期间的出血。在这些情况下，优选具有优良促凝特性的血小板，以快速启动止血过程。然而，血小板浓缩物来源于自愿献血者的捐献，与药物不同，其标准化仅基于制备方法，而非（化学）成分。因此，血液储存领域仍存在许多未解决的问题，包括最佳献血方式、储存条件以及输注实践等。在血小板（输注）生物学领域，关于循环中细胞清除机制、输注血小板对止血的贡献，以及其免疫学特性等问题也尚未明确。
目前已有多种用于血小板功能分析的实验室技术，但这些方法大多仅针对血小板功能的某一方面，例如聚集或脱颗粒13。为了全面评估血小板及血小板浓缩物，必须采用包含流体动力学因素的综合性止血模型。血液流变学对于正确解读止血14,15或血栓形成16过程中血小板的行为至关重要，即使抗凝剂（如柠檬酸盐或肝素）分别阻止了Ca2+和/或凝血酶的参与，这一因素仍然不可忽视2。为了在流动条件下研究凝血与血小板功能之间的相互作用17,18，必须保证正常的凝血酶生成，因此也需要游离的Ca2+。在此类条件下研究止血的实验装置较为复杂，因为应尽可能采取措施防止"人为假象"或凝血过程的非预期激活。此外，许多专业研究团队使用自行研制的设备19,20，这导致了显著的实验室间差异5。此类方法的典型局限性包括使用矩形容器、非脉动性流场以及非人源性的表面涂层5。本文所描述的检测方法采用市售工具，因此可能更适合实现标准化。
由于凝血级联反应在血液离开人体后极易被激活，因此受控的再钙化是一个关键步骤。为实现这一点，需在血液即将流经反应性胶原表面之前才加入 Ca2+，因为若将 Ca2+ 缓冲液大量加入静止的血液中，凝血反应将不可避免地发生，最终导致管路堵塞并干扰数据解读（数据未显示）。解决该问题的方法是将 Ca2+ 缓冲液与血液分别泵送，使其在流向分析腔室的灌注过程中通过对流和扩散作用实现混合。在混合腔室与分析腔室之间的 46 cm 管路段内可实现完全混合。该长度是根据在特定流速（1,000 s-1）下灌注时质量传递和对流传质的基本规律所计算出的试剂最佳停留时间而确定的21。该方法已被证明具有良好的可控性和可重复性。
接触激活凝血有时被视为简单的血液采样所导致的人工假象，在解读凝血时间时应予以避免。因此，我们证明了在无抑制剂存在的情况下，接触诱导的凝血在灌注开始后16.7分钟（±3.7分钟）启动。当存在CTI以抑制FXIIa介导的接触激活时，在实验预设的任意时间段内（30分钟）均未引发凝血。这一实验时间窗口足够长，可用于区分具有促血栓或抗血栓特性的样本。尽管接触激活引起的凝血可能是血液接触人工表面时的非预期后果，但我们的数据明确显示了血小板的生物学剂量效应。这一点对输血医学可能具有重要意义，因为近年来关于FXII、血小板多聚磷酸盐10、磷脂酰丝氨酸分布22以及血小板微颗粒23的研究实际上重新评估了接触途径在凝血中的作用，将其视为止血过程中的重要参与者，尤其是在血栓形成背景下24。例如，若证实成功的凝血依赖于这些因素，则患者血小板输注疗效的差异性，或储存血小板中磷脂酰丝氨酸表达水平的变异性，可能导致治疗效果的不一致。
通过将脂化重组人组织因子（rhTF）与胶原共固定，可在血小板于胶原表面沉积的同时激活外源性凝血途径（即组织因子途径）。这使得该检测扩展为其最全面的模式，可模拟血液与携带组织因子的细胞及组织发生接触的损伤情况。我们的数据显示，胶原与组织因子的共固定可缩短凝血启动的时间，但并不改变凝血速率。值得注意的是，固定于表面的rhTF含量是该模型中的一个重要变量25,26，应在特定研究中进行标准化。在存在CTI的情况下，由于接触激活途径被抑制，可单独研究组织因子途径（结果未显示）。
综上所述，我们的实验设计结合了通过储存血小板重建血小板减少血液的输注模型，以及在流体动力流动条件下依赖钙离子的血小板沉积和纤维蛋白形成的止血模型。该检测方法将用于探讨储存血小板的促凝血特性，以及血小板浓缩制备技术对这些特性的影响。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由比利时红十字会-弗拉芒血液服务中心的研究与发展基金会资助。我们感谢提供的财务支持 "特殊研究基金" 根特大学BOF（特别研究基金）资助项目，合同编号BOF30290744。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | A00434 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 309604 | |
| 2 mL 注射器 | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | 按照制造商说明书对纤维蛋白原进行标记 |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | 带预装持针器的采血针 |
| 含EDTA的BD vacutainer管 | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| 含柠檬酸钠的BD vacutainer管 | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| 封闭缓冲液 | 实验室自制 | 实验室自制 | HBS中含1.0% (w/v) 牛血清白蛋白和0.1% (w/v) 葡萄糖 |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| 凝血缓冲液 | 实验室自制 | 实验室自制 | HBS中含10 mM CaCl2 和 3.75 mM MgCl2 |
| 15 mL 锥形管 | Greiner bio-one | 1888271 | |
| 50 mL 锥形管 | Greiner bio-one | 227261 | |
| 玉米胰蛋白酶抑制剂（CTI） | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| 变性酒精 | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-二己基氧杂羰花青碘化物 - DMSO中的1 mM溶液 |
| Exigo微流控泵 | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| 纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | F3879 | 在实验室用AF 405标记 - 储存液浓度为10.7 mg/mL |
| 血液学分析仪 | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES缓冲盐水（HBS） | 实验室自制 | 实验室自制 | 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐水（0.9% (w/v) NaCl），pH 7.4 |
| Horm胶原 | Takeda/Nycomed | 1130630 | 天然马腱胶原（I型） 使用等渗葡萄糖溶液稀释胶原 |
| 加湿盒 | Cellix | HUMID-BOX | |
| 孵育水浴箱 | GFL | 1013 | |
| 显微镜 | Zeiss | Axio Observer Z1 | 配备colibri-LED和高分辨率CCD相机 |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | 配Multiflow8 |
| 移液器 | Brand | A03429 | |
| 100-1000 μL移液器吸头 | Greiner bio-one | 740290 | |
| 1-10 μL移液器吸头 | Eppendorf | A08928 | |
| 2-200 μL移液器吸头 | Greiner bio-one | 739280 | |
| 血小板浓缩物轨道摇床 | Helmer | PF-48i | |
| 精密擦拭纸 | Kimtech | 5511 | |
| 胃蛋白酶溶液 | Hanna instrument | HI7073L | 每75 mL溶液含2 g胃蛋白酶，含胃蛋白酶的蛋白质清洗液 |
| 重组人组织因子Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | 含合成磷脂的rhTF |
| 显微镜软件 | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| 无菌对接装置 | Terumo BCT | TSCD | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 521-0095 | |
| 试管滚轴混合器 | Ratek | BTR5-12V | |
| 管路封口机 | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8注射器连接针 | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ 生物芯片 | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | 包被型生物芯片 |
| Vena8 针头 | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 管路 | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 生物芯片 | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | 混合型生物芯片 |
| 涡旋混合器 | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012软件 | Zeiss |
参考文献
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