小鼠左前降支冠状动脉结扎：一种改进且简化的心肌梗死模型

摘要

我们提供了一种在小鼠模型中进行左前降支动脉（LAD）结扎的可靠方法。该方法相较于其他方法侵入性较小，涉及气管插管、左侧开胸入路以及胸腔穿刺。该方法可用于构建急性与慢性心肌梗死（MI）的动物模型。

摘要

缺血性心脏病（IHD），即急性冠状动脉综合征（ACS），是美国主要的死亡原因之一。IHD 的特征是心脏供血减少，导致心肌缺氧并继而发生坏死。心肌梗死（MI）模型因其可用于短期缺血-再灌注模型以及长期永久性结扎模型而广受欢迎。以下，我们介绍一种可靠的左前降支（LAD）永久性结扎方法。随着小鼠基因工程技术的不断进步，以及高质量小鼠外科器械的日益普及，小鼠已成为MI手术的常用模型。我们的外科手术模型采用了一种易于逆转的麻醉方式，以实现小鼠的快速恢复；通过微创气管插管而非气管切开术进行通气；并在不额外切开胸壁的情况下，经原胸廓切口处进行胸腔穿刺，有效清除胸腔内多余的血液和空气。与其他方法相比，该方法侵入性更小，显著降低了手术及术后并发症和死亡率，并提高了实验的可重复性。

引言

冠心病，即急性冠脉综合征（ACS），是最常见的心血管事件，预计在2020年成为全球发病率和死亡率的主要原因¹。ACS的病因是冠状动脉粥样硬化斑块破裂导致心肌血栓形成，从而阻塞或减少流向心肌组织的血流²。因此，临床上可出现与急性心肌缺血一致的症状，例如心肌梗死（MI）^3,4。心肌梗死会导致心肌细胞质量的丧失，并进一步发展为病理性心室重构，最终可能导致心室功能障碍和心力衰竭^5,6。

研究缺血性心脏病（IHD）最有效的方法之一是在动物模型中模拟人类心肌梗死。这可通过结扎小鼠的前降支动脉（LAD）来实现。利用该模型，我们研究心脏如何免受IHD所致损伤的影响。

在过去十年中，研究人员已逐渐从使用较大的动物模型转向较小的动物模型，其中包括从大鼠转向小鼠。由于小鼠体型小、每窝产仔数多、维持成本低、妊娠期短，以及转基因和基因敲除模型资源丰富等诸多原因，小鼠模型正日益受到青睐⁷。尽管小鼠体型较小，但专为其设计的新型外科手术器械推动了这一转变。本方法采用了这些新型外科手术器械。

尽管已有多种方法采用侵入性气管切开术，但我们使用一种创伤更小的经气管插管方法。通过口咽部上方照明，我们在不制造任何切口的情况下完成插管，从而为实验动物提供更安全、创伤更小的操作体验。插管后将小鼠连接至呼吸机，并在整个手术过程中持续使用异氟烷维持麻醉。由于该药物产生的麻醉作用持续时间较短，一旦停止给药，动物仅需几分钟即可恢复。我们的手术模型还包括一种微创胸腔穿刺术。通过原胸廓切开术切口进行胸腔穿刺，小心地清除胸腔内的血液和过量空气，有效解决了左前降支结扎术（LAD ligation）常见的术后并发症——张力性气胸。该方法避免了其他方法中所需的两个额外切口（一个用于气管切开，另一个用于胸腔穿刺），显著减少了术后并发症，并大幅降低了死亡率。

方案

本动物实验方案已由中国罗德岛医院的机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准。

1. 麻醉与插管

1. 称重小鼠以计算术后镇痛药物的剂量。
2. 将小鼠放入诱导室，给予 4% 异氟烷持续 9 - 10 分钟，并全程监测动物状态。打开热珠灭菌器，使设备预热至约 250 °C。预热过程需要 15 - 20 分钟。
3. 当小鼠达到深度麻醉状态，呼吸频率约为 32 次/分钟时，将其仰卧固定于泡沫板上，使用弹性带穿过上门齿下方以保持口腔张开。通过脚趾夹捏试验确认麻醉深度。将高强度照明灯置于小鼠上方，以便观察口咽部结构。
4. 使用弯头镊子打开下颌，并用另一把镊子将舌头移开。确保在与小鼠身体齐平或略低的视线水平进行插管操作。建议使用手术放大镜。
5. 观察声门的开闭情况。当声门张开时，插入带有钝头导针的 20 号、1 英寸静脉（IV）导管。利用导针引导导管进入气管开口，但避免将导针本身插入气管内。可通过塑料移液管验证导管位置是否正确。
6. 将已插管的小鼠转移至配备加热装置的手术台面，连接小型啮齿类动物呼吸机，设置每搏潮气量为 150 µL/次，呼吸频率为 130 次/分钟。
7. 给予 2.5% 异氟烷。通过观察双侧胸廓起伏确认插管成功，并通过脚趾夹捏试验验证麻醉深度。小鼠可能需要在呼吸机上维持 5 - 10 分钟才能达到完全麻醉状态。

2. 小鼠的准备

1. 将气管插管在呼吸机与静脉导管连接处用胶带固定，并固定四肢。在眼睛上涂抹无菌润滑滴液。
2. 使用电动剃刀修剪小鼠胸部左侧腹面的毛发。用干纸巾清除剃下的毛发，然后用无菌棉签涂抹一层脱毛膏。脱毛膏应与毛囊接触约 30 - 45 秒。
3. 在脱毛膏作用期间，将三根无菌棉签分别放入装有聚维酮碘的三个 1.5-mL 离心管中浸泡。使用蒸馏水湿润的擦拭巾轻轻擦去脱毛膏和残留毛发。
4. 以聚维酮碘和无菌 70% 异丙醇消毒垫交替对术区进行三次清洁，每次均以由中心向外围画圈的方式进行。在小鼠术区覆盖带有硬币大小开口的无菌手术巾。
5. 用 70% 乙醇清洁小鼠周围区域。再次通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。

3. 左前降支结扎

1. 将已灭菌的手术器械放入预热至 250 °C 的干热灭菌器中约 20 秒。将灭菌后的器械置于无菌灭菌手术单上。佩戴外科手套。
2. 使用精细尖头镊子轻轻提起剑突软骨左侧约5 mm处的皮肤。用带有10号刀片的外科手术刀从此处向上作垂直切口，直至胸骨柄水平。
3. 使用弯头镊子轻轻分离皮肤和肌肉层。沿皮肤切口打开肌肉层。在切口两侧的肌肉层各穿入一根5-0聚丙烯缝线，并用夹子暂时固定缝线，以保持肌肉层敞开。
4. 在第三肋间隙沿肋骨的自然角度进行识别并做切口。移除小鼠左肢末端的胶带，并用胶带将其左后足固定于右后足上。剪取一段较长胶带，将小鼠左前足以略微抬高的位置固定于操作台面。用70%乙醇清洁手套。
5. 使用拉钩轻轻撑开3^rd 和 4^th 肋骨。剪取一小块无菌纱布，大小约为1英寸×½英寸，浸入无菌0.9%氯化钠溶液中。挤去多余液体，用镊子将纱布轻轻置于左肺表面，以防止操作过程中意外损伤肺组织。
6. 用镊子轻轻剥离薄薄的心包膜。
7. 从无菌棉签上撕下少量棉花，揉成一个小球。将此棉球浸入无菌0.9%生理盐水中，轻轻擦拭心脏表面以辨认动脉。轻柔地将左心耳向上推起，显露其下方的冠状动脉。
8. 识别左前降支（LAD），在其下方穿过一根8-0尼龙缝线；打两个结以确保结扎牢固。若结扎成功，结扎远端的左心室区域将出现苍白。
9. 使用镊子取出先前插入的纱布，然后轻轻移除牵开器。将连接于25号针头的6英寸25号柔性导管通过开胸切口插入胸腔，将导管向前推进约1至2英寸，使其位于左肺上方的空间内。将小鼠恢复至仰卧位，并用70%乙醇清洁手套。
10. 使用5-0聚丙烯缝线以单纯间断缝合法关闭肋骨，同时保持胸管位置不变。拆除用于牵开肌层的两根缝线。使用5-0聚丙烯缝线以单纯连续缝合法关闭肌层，继续保留胸管位置不变。
11. 将1 mL注射器连接至胸管的25号针头上。用镊子缓慢地将胸管从胸腔中抽出，同时轻轻向上拉动注射器活塞。应缓慢拔出导管，因为此步骤可清除多余的空气和血液，否则这些气体会滞留在胸腔内，导致气胸。
12. 注射器抽满后，将注射器与针头分离，并将废液排入废液杯或水槽中。重复此操作直至胸管完全拔出。确保胸部切口紧密封闭。
13. 将异氟烷浓度降低至1.5%。使用4-0聚丙烯缝线以间断单纯缝合方式缝合皮肤。关闭异氟烷蒸发器。
14. 通过腹腔注射给予0.1 mg/mL布托啡诺（buprenorphine）与0.9%生理盐水的混合液。将2 mg/mL利多卡因（Lidocaine）与2 mg/mL布比卡因（Bupivacaine）溶于0.9%生理盐水中，局部应用于切口处。通过皮下注射给予200–500 µL 0.9%生理盐水，根据小鼠体重调整生理盐水量。
15. 给予镇痛药物后等待5分钟，再将小鼠从气管插管中取出。这有助于小鼠脱离呼吸机的过渡。
    1. 如果小鼠脱离呼吸机后未出现双侧胸部起伏，应进行针头减压。操作方法：将一支25号无菌针头连接1 mL注射器，插入第3肋间^rd 和 4^th 肋骨直至进入胸腔，以阻力突然减小为标志。轻轻上拉活塞以排出多余空气。
16. 当小鼠表现出 adequate 的双侧呼吸频率和深度，并对脚趾夹捏有反应时，将其置于装有加热灯的清洁恢复笼中。为小鼠提供湿润食物和水瓶，在层流罩中监测 15 – 20 分钟。监测是否存在呼吸费力、过度出血或其他可能危及生命的并发症。
17. 接下来三天内，每天通过腹腔注射给予小鼠0.1 mg/mL的丁丙诺啡镇痛药物两次。每天监测小鼠状况。

结果

小鼠在术后第28天被实施安乐死，随后取出心脏并进行检查。使用50 - 75 mg/kg的氯胺酮和5 - 10 mg/kg的赛拉嗪对小鼠进行麻醉。当动物达到充分麻醉状态后，打开胸腔，并使用23号针头将冷的氯化钾（KCL, 30 mM）注射至心脏的后基底部区域，使心脏停搏于舒张期。为进一步验证结扎效果，将心脏从动物体内取出，先后注入4%多聚甲醛和1%伊文思蓝染料。图1显示缺血的左心室区域无伊文思蓝染色。图2展示了一套正确的经气管插管装置。图3显示了胸腔穿刺时胸管置于初始切口位置的情况，肌肉层在胸腔排气前已缝合关闭胸管周围。图4显示三色染色法表明梗死区域胶原蛋白增加。

讨论

随着心肌梗死（MI）模型在实验室中的应用日益增多，本描述的实验方案旨在提高小鼠的手术效率和存活率，同时尽量减少术后疼痛和不适。该方案通过在左前降支（LAD）结扎术的多个环节进行改进，力求降低死亡率。本方法与现有方法存在几处差异. 一些利用氯胺酮和赛拉嗪联合异氟烷进行麻醉诱导的小鼠插管研究，尽管具有麻醉持续时间较长的优势，但已显示出较高的死亡率⁸。我们的方法仅使用异氟烷进行诱导，显著降低了药物相关并发症的风险。另一项类似的LAD结扎方案包含气管切开术，导致恢复时间延长，并对操作人员的精确训练要求更高⁹。而我们在此描述的方案采用无创性气管插管方法，从而降低了死亡率，并提高了实验结果的可重复性。此外，本方案不仅使用电动剃毛器，还结合使用脱毛膏进行去毛，可在不到1分钟内实现对无菌术野的完全清晰暴露。

另一个关键区别在于小鼠体位的调整，该步骤发生在初始切口之后，而非之前。在小鼠仰卧位时进行切口，能够更直接、准确地观察剑突软骨等解剖标志，从而提高实验结果的可重复性。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高强度光源	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite 手术平台	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	使用可充电、电池供电的远红外加热垫。手术前需过夜充电。
SurgiSuite LED 照明套件	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
电热灭菌器	Fine Science Tools	18000-45	预热需 15 至 20 分钟。器械灭菌需 20 秒。
小型啮齿动物麻醉系统	VetEquip Inc.	901810
异氟烷	Piramal Enterprises	66794-017-10
丁丙诺啡	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
手术放大镜	Roboz	RS-6687
小型啮齿动物呼吸机	Harvard Apparatus	73-0043
润滑滴眼液	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
电动剃毛器	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
脱毛膏	Nair
医用胶带	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
聚维酮碘	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% 异丙醇擦拭巾	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
手术铺巾	Braintree	SP-TS
外科手套	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 聚丙烯缝线	Ethicon	8630G
8-0 尼龙缝线	Fine Science Tools	12051-08
铂固化硅胶管	Harvard Apparatus	72-1042	内径 0.3 mm × 外径 0.6 mm
0.9% 生理盐水	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 聚丙烯缝线	Ethicon	8631G
带 25 号针头的 1 mL 注射器	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
剪刀	Kent Scientific Corporation	INSS600225
镊子	Kent Scientific Corporation	INS700100
棉签	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
静脉导管，20 号	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
牵开器	Kent Scientific Corporation	INS 750369
镊子	Fine Science Tools	11003-12
直头解剖镊	Kent Scientific Corporation	INS 700101
弯头解剖镊	Kent Scientific Corporation	INS 700103
直头止血钳	Kent Scientific Corporation	INS 750451
弯头止血钳	Kent Scientific Corporation	INS 750452
组织镊	Kent Scientific Corporation	INS 700131
持针器	Kent Scientific Corporation	INS 600109
剪刀	Kent Scientific Corporation	INS 600225