磁力搅拌法检测肌肉样品中的Trichinella幼虫

摘要

全球许多国家预防人类旋毛虫病的方法是通过消化法对易感动物的肌肉样本进行实验室检测，其中磁力搅拌器法被视为金标准。

摘要

旋毛虫病是一种使人衰弱的人类疾病，由食用感染了旋毛虫属线虫幼虫的动物生肉或未煮熟的肉类引起。Trichinella 是全球人类感染最重要的来源，包括野味、猪肉及猪肉制品。在许多国家，预防人类旋毛虫病主要依靠通过人工消化易感动物尸体的肌肉样本来检测感染动物。

基于肉类消化的检测方法有多种，但磁力搅拌法被视为金标准。该方法通过对肌肉样本进行酶消化，再经过滤和沉淀步骤后，借助显微镜检测Trichinella幼虫。尽管该方法无需特殊且昂贵的设备，但无法使用内参对照。因此，整个检测过程必须实施严格的质量管理。本研究旨在根据欧盟寄生虫参考实验室和德国Trichinella国家参考实验室的经验，向检测人员提供该方法的详细操作说明及关键控制点。

引言

旋毛虫属（Trichinella）线虫可在全球范围内的肉食性和杂食性哺乳动物、鸟类和爬行动物的横纹肌中被检测到。当人类摄入生的或半生的猪、马及野生动物的肉类及其制品时，可感染此类人畜共患线虫。该人畜共患病在人类中可能表现为一种严重疾病，具有特征性的体征和症状，例如腹泻、发热、眶周水肿和肌痛，以及可能的并发症，如心肌炎、血栓栓塞性疾病和脑炎¹。

旋毛虫 是最常见的病因病原体 旋毛虫 在野生动物和家养动物中传播，并导致全球大多数人类感染病例。在欧洲、北非、西非以及西亚地区， Trichinella britovi 是人类感染的另一来源。此外，还有十种其他分类群较少被报告为人类疾病的致病因子，它们分布于世界不同地区，通常存在于野生动物中²除野猪、熊、海象和獾等野生动物外，猪肉是全球人类感染的最重要来源。

预防旋毛虫病的最佳方法是避免食用生肉制品，并将所有肉类（尤其是野味）彻底烹煮至安全温度（> 65 °C 下 1 分钟， 即 使肉制品中心的肉色由粉红色变为褐色³欧盟和美国农业部已规定了可用于杀灭猪肉产品中病原体的冷冻和烹饪时间与温度 T. spiralis 肉中的幼虫^4,5此外，关于灭活的建议 旋毛虫 国际旋毛虫病委员会发布了关于肉类及肉制品中旋毛虫的研究报告⁶在欧洲，除了在商业猪群中引入受控饲养条件以降低感染风险外 旋毛虫 感染风险可忽略不计，人类旋毛虫病的预防主要依赖对易感动物肌肉样本的实验室检测⁴.

出于食品安全目的，消化法检测是直接检测肉类中Trichinella幼虫的唯一可靠方法^3,7。尽管消化法存在多种变异形式，磁力搅拌法仍是国际公认的参考方法^3,4,7。该检测基于在横纹肌组织中检测Trichinella幼虫。在对肌肉样本进行酶消化，随后经过过滤和沉淀步骤后，通过显微镜鉴定Trichinella幼虫。根据贸易义务和各国法律法规的不同，磁力搅拌法的通用方案存在多种细微差异。本文所述技术细节依据欧盟要求⁴、ISO规范⁸、ICT指南⁶，以及欧洲联盟寄生虫参考实验室（EURLP）和德国Trichinella参考实验室的经验制定。

方案

1. 准备工作

1. 样本采集
   注意：磁力搅拌法可用于单个或混合肌肉样本。
   1. 从适当的易感部位采集适量样本⁹。请参考各国要求或国际兽医组织（ICT、OIE 或 ISO）的推荐方案。
      1. 例如，在欧盟地区，应从家猪膈肌脚与腱索部交界处采集 1 g 样本。确保所有肌肉样本均剔除全部脂肪和筋膜。
   2. 若检测舌部组织，需在检测前去除表面层。
   3. 处理冷冻样本时需格外小心，因为大多数Trichinella幼虫不耐受冷冻，死亡后会解旋，对消化液的抵抗力下降，并容易黏附于容器壁，从而导致检测灵敏度降低。
      注意：若样本已冷冻，至少应将样本量加倍，并延长沉降时间（见下文）。
2. 消化液的配制
   1. 将 25% HCl（16 ± 0.5 mL）加入已预热至 46 - 48 °C 的 2 L 自来水中，置于 3 L 玻璃烧杯中。温度过低会导致消化不完全；温度过高则会使胃蛋白酶的酶活性失活。
   2. 将搅拌棒放入烧杯中，在预热板（46 - 48 °C）上持续搅拌溶液。
   3. 向酸性溶液中加入 10 ± 0.2 g 胃蛋白酶（1:10,000 NF，1:12,500 BP，2,000 FIP）。
      注意：胃蛋白酶的质量至关重要，其酶活性必须由生产商提供认证。出于实验室安全考虑并维持胃蛋白酶活性，必须严格按照顺序添加消化液成分。
3. 肌肉样本的制备
   1. 将最多 100 g 肌肉样本放入搅拌机或研磨机中切碎。为便于混合，可向样本中加入 2 mL 预热的水，以最高速度搅拌 2 - 3 秒。
   2. 第二次搅拌前，打开搅拌机，将搅拌杯边缘顶部残留的肌肉样本刮至底部后再次搅拌。重复此操作，每次搅拌 2 - 3 秒，直至肉眼不可见任何肉块。
      注意：搅拌不足可能导致消化不完全，而过度搅拌则可能损伤样本中存在的Trichinella幼虫⁶。

2. 实验步骤

1. 肌肉样品消化
   1. 将1 L消化液转移至量筒中。将研磨后的肉样倒入烧杯，并用勺子或叉子在消化液中充分分散。用500 mL预热的消化液彻底冲洗搅拌机盖、刀片和搅拌杯，并将冲洗液全部倒入3 L烧杯中。
      注意：冲洗不彻底可能导致灵敏度下降。
   2. 用铝箔覆盖烧杯，保持恒温44–46 °C，并用温度计监测温度。
   3. 搅拌消化液30分钟，形成深漩涡但不溅出，直至肉颗粒完全消失。根据所检测肉类的类型（例如野生动物肉），可将消化时间延长至最多60分钟。
2. 消化液的过滤与沉降
   1. 为确定未消化组织的量，先将天平调零，使用前称量筛网并记录其重量。筛网应清洁且无任何组织残留，以免阻碍Trichinella幼虫进入沉降漏斗。检查分液漏斗是否垂直放置。
   2. 消化完成后，小心地将消化液通过180 µm筛网倒入玻璃分液漏斗中。玻璃分液漏斗的宽度不应超过其长度的55%，以利于幼虫良好沉降。注意避免溢出。
   3. 为避免灵敏度损失，使用洗瓶中的自来水约200 mL彻底冲洗玻璃烧杯和筛网，并将冲洗液转移至玻璃沉降漏斗中。注意仔细冲洗3 L烧杯的边缘。提起筛网，彻底冲洗筛网下方区域。
3. 未消化组织量的测定
   注意：由于操作方法上的误差，肌肉组织可能残留在筛网上，包括筋膜和不可消化的结缔组织。未消化组织的量在最初的10分钟沉降步骤期间测定（见2.5）。这允许筛网约30分钟的干燥时间，因为残留水分会影响未消化组织的称重结果。
   1. 将一张纸巾放在天平上，称量带有未消化组织的筛网。
   2. 从带未消化组织的筛网重量中减去过滤前的筛网重量。若筛网上残留的组织不超过起始样品重量的5%（即每100 g起始材料不超过5 g），则认为消化过程满意。
   3. 如果未消化组织量超过5%，应使用新鲜肌肉样品重复检测。若残留组织主要为未消化的肌肉组织且无新鲜样品可用，则应对残留物再次进行消化，并与原始样品一同检测。
4. 消化液的沉降
   1. 将过滤后的消化液在分液漏斗中静置30分钟。若保持静止，Trichinella幼虫将沉降至漏斗底部。
   2. 若使用冷冻样品，应将沉降时间延长至最多60分钟。
   3. 沉降完成后，完全打开分液漏斗的活塞，使至少40 mL消化液快速流入量筒中（若肌肉样品曾冷冻，则排出80 mL）。
   4. 首先让一半液体流入量筒，然后将活塞完全反向打开，使10 mL消化液通过。最后再次反向打开活塞，再让10 mL消化液通过。此操作可确保Trichinella幼虫不会滞留在活塞中。
      注意：需足够快的速度，以避免幼虫残留在分液漏斗中，导致灵敏度降低。
5. 量筒中消化液的沉降
   1. 将量筒中的沉淀物静置10分钟，使幼虫充分沉降。用移液管小心吸除30 mL上清液，勿扰动底部10 mL沉淀物。
   2. 为减少样品中组织纤维的含量，向沉淀物中加入30 mL自来水，再静置10分钟。重复此步骤，直至液体变澄清。
   3. 去除上清液，将10 mL洗涤后的沉淀物转移至带网格的培养皿或幼虫计数盆中。用10 mL自来水冲洗量筒，然后将冲洗液加入样品中。
      注意：若样品中含有大量杂质，可能妨碍Trichinella幼虫的识别（图1），必要时应进行进一步洗涤。
6. 显微镜检查
   1. 使用旋毛虫检测镜或配备可调强度透射光源的体视显微镜，在15至20倍放大倍数下，立即对洗涤后的样品进行检查。
   2. 将样品倒入带网格的培养皿后，应系统地逐格检查。若未发现可疑结构，可轻轻以环形方式搅动培养皿或幼虫计数盆中的液体，使可能被遗漏的Trichinella幼虫聚集于培养皿中心。重复检查。
   3. 若发现可疑结构，应将放大倍数提高至40–100倍。用移液管从培养皿或计数盆中取出Trichinella幼虫，收集至含90%乙醇的试管中。
   4. 在完成整个培养皿的检查后，从轻柔振荡培养皿/计数盆开始重复该程序。至少重复三次，或直至不再发现幼虫为止。
   5. 统计幼虫数量。根据所检测肌肉组织的量进行换算，以每克组织中的幼虫数（lpg）表示。
   6. 若消化液中幼虫数量过多，难以准确计数，可将含幼虫的液体倒回量筒，用洗瓶中的自来水冲洗，并静置使幼虫沉降至底部。
   7. 经过10分钟沉降后，将上清液减少至特定体积（例如10 mL）。为确定准确体积，可用移液管将上清液转移至新的量筒中。
   8. 通过剧烈振荡使幼虫在液体中均匀悬浮。在振荡过程中，将12滴20 µL幼虫悬浮液滴加至培养皿中。
   9. 用显微镜逐一检查每滴液体。统计240 µL中的幼虫数量，并剔除最高值和最低值。根据上清液总体积（例如10 mL）推算总幼虫数。
      注意：体视显微镜的质量对Trichinella幼虫的识别至关重要。
   10. 当用移液管将幼虫收集至试管时，应仔细检查幼虫是否粘附在移液管壁上，确保其完全转移至试管中。
       注意：从混合样品中检出阳性的Trichinella结果，必须追溯至原始个体尸体。应逐步缩小混合样本的规模，直至确定阳性个体。在此过程中也可增加样本量以提高检测灵敏度。若集体样本检测结果为阳性或不确定，需从每头猪再取20 g样品。将五头猪的20 g样品混合后，采用所述方法进行检测。以此方式共检测20组五头猪的混合样本。当在五头猪的混合样本中检出Trichinella时，需分别采集该组内每头猪的20 g样品，逐一检测，直至确定阳性个体。

结果

消化后，感染性肌幼虫的形态可能有所不同，这使得鉴定更加困难。典型形态包括紧密盘绕的幼虫、轻微盘绕的幼虫或呈C形或完全伸展的幼虫（图2B - 2C）。每克组织中发现的幼虫数量差异较大，可从1条到数百条不等。

感染性肌幼虫的形态如图2A所示。Trichinella幼虫长度为0.7至1.5 mm，宽约0.3 mm。食管狭窄，末端略呈圆形。角质层光滑。在体腔的前半部分可见纺锤体（stichosome），该结构由一根细长的管道及其周围排列的45至55个大型细胞（纺锤细胞，stichocytes）组成。直肠亦呈圆形，无任何突起或附属结构^10,11。

除Trichinella幼虫外，肌肉消化后还可能发现其他结构。一些示例如图3A - 3F所示。野生动物常感染其他寄生虫，或在剖检过程中，待检肌肉样本被生物或非生物结构/生物体污染。幼虫的长度、前后端形态以及杆状体（stichosome）的存在情况有助于区分不同线虫属¹²。

图1： 显微镜检查 旋毛虫 幼虫在（A）冲洗步骤不足和（B）冲洗步骤充分后的状态。 比例尺表示 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2： 感染性Trichinella幼虫的形态，显示幼虫的直肠、刺器和食管（A）。消化后肌幼虫可能呈现的形态，包括（B）紧密盘绕和松散盘绕的活动幼虫，以及（C）伸展未盘绕的幼虫。比例尺为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 使用磁力搅拌法消化肌肉样本后发现的偶然性结果示例。 （A） 在野猪中发现的蚯蚓刚毛样毛发；（B） Alaria alata（来自野猪）；（C） 野猪的肌肉纤维；（D） Metastrongylus sp.（来自野猪）；（E） 在野猪中发现的植物纤维；（F）：Toxocara sp. 幼虫（来自野猪）。比例尺表示 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

尽管磁力搅拌法易于操作，但若不严格遵守技术细节，会导致灵敏度不足，从而危害消费者健康。上述文本中已标出关键控制点。此外，使用合适的设备对检测的成功至关重要。所有容器应由玻璃制成，移液器吸头应涂有硅以减少幼虫在表面的黏附。

消化法的敏感性取决于肌肉中的幼虫密度以及所检测肌肉样本的量。当幼虫密度为每克肌肉组织3-5条时，报道的敏感性可达100%；但当密度低于每克1条时，敏感性下降至40%¹³。根据所检测的宿主动物种类不同，可通过增加样本用量来提高检测的敏感性。野生动物体内的感染负荷通常较低，因此需使用较大的样本量¹⁴。不同宿主动物的寄生偏好部位也存在差异。此外，某些肌肉组织（如舌肌）消化性较差，这一点也需考虑，可能因此需要使用更大的样本量¹⁵。

此外，需要明确的是，磁力搅拌法不包含内部对照。因此，从取样到记录的全过程质量保证管理对于获得准确且精确的结果至关重要。实验室检测肌肉样品中Trichinella幼虫的能力应通过每位分析人员定期参加能力验证测试来进行监控。

该方法的进一步局限性在于，通过显微镜对肌肉幼虫进行最终鉴定的步骤具有高度主观性，且严重依赖检测人员对幼虫形态学的了解。

一种有趣的替代方法是磁力搅拌法/滤膜分离法，随后通过乳胶凝集试验检测幼虫。然而，根据欧盟法规，该方法仅被视为适用于家猪肉类检测的等效方法，而不适用于感染风险较高的动物（如野猪）的检测⁴。使用单克隆抗体鉴定幼虫抗原使试验结果更具客观性，但使实验室无法确定每克肉中幼虫的数量¹⁶。

磁力搅拌器法的其他变体包括机械辅助的混合样本消化法/沉淀技术、机械辅助的混合样本消化法/滤膜分离技术，以及适用于最多35 g混合样本的自动消化技术。这些技术均基于肉类的人工消化以及对Trichinella幼虫的显微观察与计数，但在过滤和沉淀步骤所使用的设备上有所不同。

分离得到的幼虫可通过分子检测进一步鉴定到物种水平（例如，多重 PCR¹⁷根据欧盟法规，所有阳性样本必须送至国家参考实验室或欧盟参考实验室（EURLP）进行 旋毛虫 物种鉴定

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术刀、剪刀、镊子			切割样品并去除不可消化的组织
搅拌器			使用锋利的切碎刀片
磁力搅拌器			使用温控加热板
玻璃棒			聚四氟乙烯涂层，长约5 cm
锥形玻璃分液漏斗			容量至少为 2 L，最好配有聚四氟乙烯安全塞。其宽度不应超过长度的 55%，以利于幼虫良好沉降。
支架、铁环和夹子
筛子			孔径180微米，外径11厘米，带不锈钢网
漏斗			内径不小于12 厘米，用于支撑筛网
玻璃烧杯			容量 3 L
玻璃量筒			容量50至100 mL，或离心管
体视显微镜			使用可调节强度的透射式透射光源或带有水平载物台的旋毛虫镜
培养皿			直径9厘米，底部标记为10等份 × 使用尖头工具或幼虫计数盆，在10 mm见方的检查区域内进行三线镜检查
铝箔			或者使用盖子覆盖烧杯
25% 盐酸
胃蛋白酶			效价：1:10,000 美国国家处方集（US National Formulary），相当于 1:12,500 英国药典（British Pharmacopoeia）和 2,000 国际药学联合会（FIP）édé药典国际单位，或含最低660欧洲药典单位/毫升的稳定化液体胃蛋白酶
乙醇			70-90% 乙醇
自来水			加热至46-48 °使用前置于 C
平衡			精确至至少 0.1 g
金属托盘			容量10至15 L，用于收集剩余消化液
移液器和移液器架			不同规格（1、10 和 25 mL）
温度计			精确至0.5 °C，温度范围至少从20 ° C 至 70 °C
虹吸			自来水