Method Article

厚脑切片使用高尔基考克斯方法中成像神经元

DOI:

10.3791/55358

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April 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一个协议，用于使用所述高尔基体考克斯染色法在厚的脑切片中，为了可视化与包含单个组织样品中的树突状长树木神经元。此协议的两种变型还提出涉及甲酚紫复染，和未加工的大脑进行长期存储的冻结。

Abstract

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神经细胞染色的高尔基 - 考克斯方法已使用超过两百年的脑组织样本中推进我们的神经元形态的理解。虽然它是从实用的观点考虑，优选以制备在最大厚度可能脑切片中，为了提高识别被完全包含单个区段内染色的神经元的概率，该方法是从由高工作距离技术的角度有限-magnification显微镜物镜。我们在这里报告的协议使用在小鼠脑切片的高尔基体考克斯方法，其是在500米微米厚的切割染色的神经元，并使用配有高分辨率30X 1.05 NA硅氧烷直立显微镜遍及这些区段的深度可视化的神经元油浸物镜，其具有800μm的工作距离。我们还报告这个协议可用于复染的表面的两个有用的变体安装的脑切片用甲酚紫染色尼斯尔，或以切片和最后的处理之前，冻结长期储存整个大脑。的主要协议和它的两个变体产生染色的厚的脑切片，在整个这充分神经元的树突树和枝晶棘可以可靠地可视化和量化。

Introduction

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单个神经元的组织样本中的可视化允许的神经元形态特征的原位分析，已显著提高了我们的大脑的理解，以及如何可以通过内源性疾病或外生环境因素的影响。高尔基-考克斯染色方法是在大脑中的神经元染色的随机样本的具有成本效益的，相对简单的装置。首先通过高尔基1在19世纪开发并由考克斯2改性，研究人员已经进一步改进这种技术多年来，以产生清晰，染色的神经元可被用于可视化和量化两者树突树形态和棘密度3,4 5，6，7，8，9。

对于染色的神经元的脑切片中的可视化的一个主要技术考虑是最大的切片厚度，这是由可用高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离的限制。在60共同油浸物镜 - 100X范围上提供优异的分辨率，但他们的工作距离是通常不超过200微米的更大的限制。在200微米范围内切脑切片可能是足够的可视化可以被包含在此切片厚度内的....

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Protocol

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成年雌性CD1系小鼠在本研究中使用。类似的染色可以在不同的年龄段使用两种性别来完成。实验动物照顾根据原则和加拿大动物保护协会的指导方针，以及实验方案经圭尔夫大学动物保护委员会的大学。

1.高尔基考克斯染色

  1. 脑的高尔基-考克斯浸渍
    1. 由重铬酸钾和铬酸钾成高品质的水分别溶解使1％的高尔基体考克斯溶液（W / V）的重铬酸钾，0.8％（W / V）的铬酸钾和1％（W / V）氯化汞。混合溶液中，添加氯化汞和过滤器使用1级滤纸最终溶液。存储长达一个月在黑暗中的解决方案。
    2. 麻醉，用5％异氟醚的鼠标。
    3. 断头安乐死鼠标，迅速取出大脑。
    4. 放置大脑到含有17毫升的高尔基考克斯溶液20mL玻璃闪烁瓶中，并在室温在黑暗中孵育25天。
    5. 通过在4℃下将其置于含有40毫升蔗糖的冷冻保护剂的50mL锥形管中（30％（W / V）蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）在黑暗中24小时Cryoprotect大脑。
      注:以下可选三个步骤可被用作替代的主要协议，为了冻结所述的脑在此阶段对于长期储存。
    6. 通过将其浸入已预冷在干冰上200毫升异戊烷冻结整个大脑。
    7. 放置冷冻大脑进入在黑暗中的50mL锥形管中，并储存在-80℃。
    8. 当准备好继续时，通过将其放置到含有40毫升在黑暗中蔗糖的冷冻保护剂在4℃下24小时的5....

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Results

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此高尔基体考克斯染色方案和它的两个描述可选的变体可以被采用以400个内可视化的单个神经元 - 500微米厚的脑切片。使用10X物镜和在Z轴5层微米的步骤捕获的二维Z-突起的代表性图像的蒙太奇显示在图1:A1 - C1为冠状脑切片的大面积，其包括前扣带回皮层区域1和次级运动皮层18。切片在500微米切割。需要注意的是，其包括甲酚紫染色的协议变体允许皮质细胞层的识别，例如，如看到的皮质层1沿部分的图1B1的软膜表面。使用利用所有的新鲜组织（ 图1A1）和协议的变体的主要协议时还要注意染色的切片的相似的外观，其中大脑通过用于长期储存（ 图1C1）冷冻部分的方式。

使用高分辨率的30X 1.05 NA硅酮油浸物镜的允许其在X大和Y比使用更高倍率的物镜捕获轴线图像栈的捕获，因此需.......

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Discussion

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我们在这里介绍一个高尔基考克斯染色协议了两个有用的变种沿着厚的脑切片中神经元的可视化。正如代表结果所示，使用具有长800μm的工作距离的高分辨率目标的允许整个神经元在整个500μm的切割脑切片的深度可靠可视化。比较厚的脑切片的这项研究增加了任何类型的神经元染色完全包含切片，这是长而复杂的顶端树突树锥体神经元是特别重要内的概率。例如，在啮齿动物的脑中的冠状切片，这允许包括在延髓或尾方向延伸更远神经元的，并且在切片步骤正视阻断大脑时也增加了错误的余地。虽然我们描述了大脑冠状面而已，这个协议可以适用于其他PL切片切片ANES根据需要完全包含单个区段内标记的神经元。切片，使用的飞机将取决于被调查的神经元群体的形态特征。树突棘可以可视化，并使用该协议来定量，尽管更高倍率的目标需要评估脊柱类型/形态如用于产生图2中的显微照片的60X油浸物镜:A3 - C3。这可以在厚的部分可以采用但不限于物镜的工作距离内的切片的顶部。该协议也可以适用于不同物种相似的大脑尺寸的使用，因为我们发现，一个标准的25天浸渍期间将充分弄脏整个小鼠，大鼠和牛鹂属大脑的神经元，而不会导致过多的非特异性染色或背景.......

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Disclosures

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作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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这项工作是由一个发现格兰特CDCB从自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会，加拿大创新基金会（CFI项目编号30381），约翰·R·埃文斯领导基金研究基础设施补助金CDCB，并支持发现格兰特NJM从NSERC。 ELL是由安大略研究生奖学金和安大略兽医学院的奖学金OVC圭尔夫大学的支持。 CDS是由NSERC本科生助研支持。 ALM是由NSERC亚历山大·格雷厄姆·贝尔奖学金和安大略兽医学院在圭尔夫大学的奖学金OVC支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
重铬酸钾Fisher ScientificP188-100危险
铬酸钾Fisher ScientificP220-100危险
汞Fisher ScientificS25423危险
Whatman 1 级滤纸Fisher Scientific1001-185
异氟醚加拿大制药合作伙伴
20 mL 闪烁样品瓶Fisher Scientific03-337-4
蔗糖Bioshop CanadaSUC700.1
磷酸氢二钠Sigma AldrichS5011-500G
磷酸氢二钠Sigma AldrichS9390-500G
50 mL 锥形管Fisher Scientific12-565-271
异戊烷Fisher ScientificAC126470010也称为 2-甲基丁烷;危险
琼脂Sigma AldrichA1296-100G
小称量皿Fisher Scientific02-202-100
振动切片机LeicaVT1000 S
6 孔组织培养板Fisher Scientific08-772-1b
网状底部组织培养插管Fisher Scientific07-200-214
多聚甲醛 （PFA），16%电子显微镜科学15710-S有害
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500有害
柯达固定剂 ASigma AldrichP7542
superfrost plus 载玻片Fisher Scientific12-550-15
CitroSolv 清除剂Fisher Scientific22-143-975
无水乙醇商业醇类N/A
甲酚紫Sigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
正置显微镜奥林巴斯BX53 型号
彩色相机， 12 位MBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D 电动显微镜载物台、控制器和研磨机MBF BiosciencesN/A由 MBF Biosciences 提供并与显微镜集成
4X 显微镜物镜Olympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X 显微镜物镜Olympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
30X 显微镜物镜Olympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
60X 显微镜物镜奥林巴斯60x 1.42 N.A. PlanAPO N
硅油奥林巴斯Z-81114
Neurolucida 软件MBF Biosciences版本 10
ImageJ 软件美国国立卫生研究院当前版本已安装 OME Bio-Formats 插件
Photoshop 软件AdobeCS6
氯化CP0406V2 版

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....

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