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方法文章

使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

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DOI：

10.3791/55358

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2017年4月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

本文内容

摘要

我们介绍一种在厚脑切片中使用高尔基-考克斯染色法的实验方案，以实现对具有长树突的神经元进行可视化观察 单个组织样本中包含的树木。本方案还介绍了两种变体，分别涉及焦油紫复染，以及未处理脑组织的冷冻以实现长期保存。

摘要

高尔基-考克斯神经元染色法已应用两百多年，用于增进我们对组织学脑样本中神经元形态的理解。尽管从实际操作角度而言，尽可能制备较厚的脑切片有助于提高在单个切片内完整观察到染色神经元的概率，但该方法在技术上受限于高倍显微镜物镜的工作距离。本文报道了一种使用高尔基-考克斯法对小鼠脑组织进行染色的实验方案，脑切片厚度为500 μm，并采用配备高分辨率30X 1.05 N.A.硅油浸没物镜（工作距离达800 μm）的直立显微镜，实现对整个切片深度内神经元的清晰成像。此外，我们还介绍了该方案的两种实用变体：一种可用于对贴片脑切片表面进行焦油紫尼氏染色复染，另一种可在切片和最终处理前将完整脑组织冷冻以实现长期保存。主方案及其两种变体均可产生染色良好的厚脑切片，使完整的神经元树突 树及树突棘得以可靠地观察与定量分析。

引言

组织样本中单个神经元的可视化能够实现 原位 神经元形态学特征分析极大地推动了我们对大脑及其受内源性疾病或外源性环境因素影响机制的理解。Golgi-Cox染色法是一种经济、相对简便的脑内随机神经元染色方法。该方法最初由Golgi建立1 并由 Cox 修改2 19世纪以来，研究人员多年来不断改进这一技术，以获得清晰且染色良好的神经元，可用于可视化并量化树突树形态和树突棘密度3,4,5,6,7,8,9.

可视化脑切片中染色神经元时，一个重要的技术考量因素是切片的最大厚度，该厚度受限于现有高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离。常用的60–100倍油镜虽能提供优异的分辨率，但其工作距离通常不超过200 μm，因而存在局限性。厚度在200 μm左右的脑切片可能足以用于观察某些可完全包含在此切片厚度内的神经元类型，例如大脑皮层浅层的锥体神经元10,11,12海马体CA1区的锥体神经元13,14以及海马齿状回中的颗粒细胞15. 具有相对较长树突的神经元 树突，例如小鼠大脑皮层深层中的锥体神经元，其树突可从胞体延伸超过800 μm16，带来了更大的挑战，因为需要以完全精确的角度对脑组织进行切片，才能在200 μm厚的切片内完整保留整个树突树。如果树突或其任何分支沿头侧或尾侧方向延伸，这种切片甚至可能无法实现。尽管可以通过追踪多个相邻脑切片中的同一神经元来克服这一限制，但这种方法在准确对齐切片以进行连续追踪时会引入显著的技术难题17一种更实用的方法是观察完整神经元，这些神经元位于切得较厚的脑切片内。

本文报道了一种利用高尔基-考克斯（Golgi-Cox）方法对小鼠厚度为 400 - 500 μm 的脑切片中的神经元进行染色，并使用工作距离达 800 μm 的高分辨率硅油浸入式物镜观察其形态的技术。我们所描述的高尔基-考克斯浸渍与处理方案，是在文献中被引用次数最多的现代方案之一的基础上进行改良的6。采用厚脑切片的方法，可提高在切片内完整保留任意类型神经元的概率。除主方案外，我们还介绍了两种具有独特优势的变体：（1）在贴片切片表面进行高尔基-考克斯染色并辅以焦油紫复染，以界定脑区边界并识别大脑皮层的分层结构；（2）在切片和最终处理前，对浸渍后的完整脑组织进行中间冷冻步骤，以便长期保存。

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方案

本研究使用成年雌性CD1品系小鼠。使用不同性别和年龄的动物也可获得相似的染色结果。实验动物的饲养和管理遵循加拿大动物护理委员会的原则和指南，实验方案已获得圭尔夫大学动物护理委员会的批准。

1. 高尔基-考克斯染色

  1. 脑组织高尔基-考克斯染色
    1. 配制高尔基-考克斯溶液：分别将1%（w/v）重铬酸钾和0.8%（w/v）铬酸钾溶解于高质量纯水中，混合后加入1%（w/v）氯化汞，用1号滤纸过滤最终溶液。将溶液避光保存，最多可保存一个月。
    2. 使用5%异氟烷麻醉小鼠。
    3. 通过断头法处死小鼠，并迅速取出脑组织。
    4. 将脑组织放入含有17 mL高尔基-考克斯溶液的20 mL玻璃闪烁瓶中，避光、室温下孵育25天。
    5. 将脑组织转移至含有40 mL蔗糖防冻液（30%（w/v）蔗糖溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）的50 mL锥形管中，避光、4 °C条件下孵育24小时。
      注：以下三个可选步骤可用于替代主方案，以便在此阶段将脑组织冷冻以实现长期保存。
    6. 将脑组织浸入预先用干冰冷却的200 mL异戊烷中，进行整体冷冻。
    7. 将冷冻后的脑组织放入50 mL锥形管中，避光保存于-80 °C。
    8. 准备继续实验时，将脑组织放入含有40 mL蔗糖防冻液的50 mL锥形管中，避光、4 °C条件下孵育24小时以解冻。
  2. 脑切片
    1. 从蔗糖溶液中取出脑组织，用刀片切除小脑部分，使剩余脑组织的尾端形成一个平整的切面，以便进行切片。
    2. 加热琼脂（3%（w/v）水溶液）至完全融化，冷却至略高于其熔点的温度。
    3. 将脑组织放入一次性小型称量皿中，尾端朝下，加入足量熔化的琼脂完全覆盖脑组织。
    4. 待琼脂凝固后，修剪多余琼脂，使脑组织周围保留约2–4 mm厚度，然后使用少量氰基丙烯酸乙酯胶水将脑组织尾端朝下粘附于振动切片机的载物台上。
    5.  向振动切片机的载物台区域加入足量蔗糖防冻液以覆盖脑组织，使用86 Hz振动频率和0.125 mm/s刀片推进速度，将脑组织切成400–500 µm厚度的切片（根据待观察脑区决定具体厚度）。
    6. 使用小号画笔将脑切片转移至6孔细胞培养板的孔中，孔内已放置市售底部带网格的插入式培养插件，并预先加入10 mL含6%（w/v）蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）。
    7. 将切片避光、4 °C孵育过夜。
  3. 脑切片显影
    1. 利用底部带网格的插入式插件，将脑切片转移至新孔中，孔内含有5 mL 2%（w/v）多聚甲醛（PBD）溶于0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）。在摇床上以低速、避光、室温条件下孵育15分钟。
    2. 将切片转移至含有5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度、避光、室温条件下振荡洗涤5分钟。
    3. 将切片转移至含有5 mL 2.7%（v/v）氨水的新孔中。在摇床上以低速、避光、室温条件下孵育15分钟。
    4. 将切片转移至含有5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度、避光、室温条件下振荡洗涤5分钟。
    5. 将切片转移至新孔中，孔内含有5 mL固定液A（见材料表），该溶液已用水稀释至原购买浓度的1/10。在摇床上以低速、避光、室温条件下孵育25分钟。
    6. 将切片转移至含有5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度、避光、室温条件下振荡洗涤5分钟。
  4. 脑切片封片
    1. 使用小号画笔将切片转移至载玻片上。用镊子和小片纸巾去除多余的水分和琼脂。在进行脱水前，确保所有琼脂均已被彻底清除。
    2. 将切片在室温下自然晾干约45分钟（400 μm切片）或90分钟（500 μm切片）。
      注：干燥时间和干燥程度至关重要，需根据实验室环境温度和湿度进行优化。干燥时间过短会导致切片在后续脱水步骤中从载玻片脱落；干燥时间过长则会导致切片开裂。在适当干燥程度下，切片表面仍应呈现轻微光泽。
    3. 使用焦油紫对切片进行染色，将载玻片按指示放入考普林染色缸中。
      注：此为可选步骤，适用于从未冷冻过的切片，用于对神经元细胞核进行焦油紫染色。我们发现，在焦油紫染色前对切片进行透明和再水化处理，可实现切片染色均匀且背景信号低。
      1. 放入透明剂中5分钟，重复一次。
      2. 放入100%乙醇中5分钟，重复一次。
      3. 依次放入水中含95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇溶液中，各2分钟。
      4. 放入水中5分钟。
      5. 放入0.5%（w/v）焦油紫水溶液中7分钟。
      6. 放入水中2分钟，重复一次。
    4. 将载玻片按指示放入考普林染色缸中进行切片脱水。
      1. 依次放入水中含50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇溶液中，各2分钟。
      2. 放入100%乙醇中5分钟，重复一次。
      3. 放入透明剂中5分钟，重复一次。
        注：上述脱水和透明时间适用于本文所述的小鼠脑组织处理。然而，我们观察到在其他物种（如大鼠和拟鹂）中，最终透明步骤可能需要延长至总共15分钟。
    5. 使用无水封片剂对切片进行盖片。
    6. 将载玻片水平放置，避光、室温下干燥至少5天。

2. 厚脑切片中染色神经元的成像

  1. 捕获图像序列
    1. 打开显微镜灯泡、相机和载物台控制器。
    2. 打开显微镜软件（例如，Neurolucida）
    3. 将载玻片放置在显微镜载物台上。
    4. 使用低倍物镜（如1.25X 0.4 N.A. PlanAPO或4X 0.16 N.A.）捕获脑切片的二维宽视野图像
      1. 对焦图像并调整相机设置，包括曝光时间和白平衡。
      2. 通过在切片任意位置左键单击创建参考点
      3. 通过选择捕获图像 "获取单张图像" 在图像采集窗口内。
    5. 使用10X 0.3 N.A. UPlan FL N物镜，对包含目标神经元的区域采集中等分辨率的图像序列。
      1. 对图像进行对焦，并调整相机设置，包括曝光和白平衡。
      2. 通过聚焦到切片顶部并选择，设置图像堆栈的上边界和下边界 "设置" 旁边 "堆栈顶部" 在图像采集窗口内，然后聚焦到切片底部并选择 "设置" 旁边 "堆栈底部" 在图像采集时间窗内。
      3. 将步进距离设置为 5 μm "5 μm" 旁边 "图像间距" 在图像采集时间窗内。
      4. 通过选择捕获图像堆栈 "获取图像序列" 在图像采集时间窗内。
      5. 重复上述步骤以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少有10%的重叠。
    6. 使用30X 1.05数值孔径的硅油浸润物镜，对包含目标神经元的区域采集高分辨率图像序列。
      1. 在载玻片上滴加3-4滴硅油浸油，将物镜置于载玻片上，确保物镜与油滴接触。
      2. 对图像进行对焦，并调整相机设置，包括曝光和白平衡。
      3. 通过聚焦到切片顶部并选择来设定图像堆栈的上限和下限 "设置" 旁边 "堆栈顶部" 在图像采集窗口内，然后聚焦到切片底部并选择 "设置" 旁边 "堆栈底部" 在图像采集时间窗内。
      4. 将步进距离设置为 1 μm，通过输入 "1 μm" 旁边 "图像间距" 在图像采集时间窗内。
      5. 通过选择捕获图像堆栈 "获取图像序列" 在图像采集时间窗内。
      6. 重复上述步骤以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少有10%的重叠。
    7. 保存数据文件，并将所有图像文件以TIFF格式保存，以便进行外部处理。
  2. 创建Z轴投影图像与图像拼接图
    1. 在 ImageJ 中创建 Z 投影图像
      1. 打开已安装 Bio-Formats 插件的 ImageJ 软件。
      2. 选择 "插件" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats 导入器".
      3. 选择要打开的图像堆栈文件。
      4. 文件打开后，通过选择将格式更改为 RGB "图像" -> "类型" -> "RGB 颜色".
      5. 通过选择创建Z轴投影 "图像" -> "堆叠" -> "Z 投影…
      6. 将二维Z轴投影图像保存为TIFF文件。
    2. 创建感兴趣区域的完整二维图像拼接图。
      1. 打开软件（例如，Adobe Photoshop）
      2. 选择 "文件" -> "自动化" -> "合并图像".
      3. 选择 "浏览" 然后添加所有要合并的图像文件。
      4. 确保 "将图像合并" 被选中，然后选择 "好的".
      5. 将整个目标区域的最终拼接图像保存为TIFF文件。

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结果

该Golgi-Cox染色方案及其所述的两种可选变体可用于可视化400 - 500 μm 厚脑切片。使用10X拍摄的二维Z投影代表性图像拼接图 客观且 5 μm Z轴方向的步进如图所示 图1：A1 - C1 包含前扣带皮层1区和次级运动皮层的大范围冠状脑切片区域18切片在 500 μm请注意，包含焦油紫染色的方案变体可用于识别皮层细胞层，例如在切片软脑膜表面处可见的皮层第1层。 图1B1还需注意，使用新鲜组织的主方案染色切片时，其外观相似图1A1）以及在实验流程中将脑组织部分冷冻以实现长期保存的方案变体（图1C1).

使用高分辨率30X 1.05 数值孔径的硅油浸入式物镜能够获取在 X 和 Y 轴方向上比使用更高倍...

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讨论

本文介绍了一种高尔基-考克斯染色方案，以及两种适用于在较厚脑切片中观察神经元的有用变体。如代表性结果所示，使用工作距离长达800 μm的高分辨率物镜，可可靠地在整个500 μm厚的脑切片深度范围内完整观察整个神经元。对相对较厚的脑切片进行研究，提高了任意类型染色神经元被完全包含在切片内的概率，这对于具有长而复杂的顶端树突树的锥体神经元尤为重要。例如，在啮齿类动物脑的冠状切片中，这种方法能够包含在吻侧或尾侧方向延伸更远的神经元，同时在切片步骤中对脑组织进行方正取材时也允许更大的操作误差空间。尽管本文仅描述了冠状面的脑切片方法，但该方案可根据需要调整用于其他切面，以确保标记的神经元完全包含在单一切片内。所采用的切片平面取决于所研究神经元群体的形态学特性。利用本方案可以观察并定量树突棘，但需要更高倍率的物镜来评估棘的类型/形态，例如用于生成图2：A3 - C3中显微照片所用的60X油镜。该方法也可用于厚切片，但受限于物镜工作距离，仅能观察切片表面区域。本方案还可适用于脑大小相近的不同物种。我们发现，标准的25天 浸渍期足以在整个小鼠、大鼠和拟鹂脑中实现神经元的充分染色，而不会导致非特异性染色或背景过...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）向 CDCB 提供的发现基金、加拿大创新基金会（CFI 项目编号 30381）向 CDCB 提供的约翰·R·埃文斯领导者基金研究基础设施资助，以及 NSERC 向 NJM 提供的发现基金的支持。ELL 获得了圭尔夫大学安大略兽医学院颁发的安大略研究生奖学金和 OVC 奖学金的支持。CDS 获得了 NSERC 本科生学生研究助理奖学金的支持。ALM 获得了 NSERC 亚历山大·格雷厄姆·贝尔奖学金以及圭尔夫大学安大略兽医学院 OVC 奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
重铬酸钾Fisher ScientificP188-100危险的
铬酸钾Fisher ScientificP220-100危险的
氯化汞Fisher ScientificS25423危险的
Whatman 1号滤纸Fisher Scientific1001-185
异氟烷加拿大制药合作伙伴CP0406V2
20 mL 闪烁瓶Fisher Scientific03-337-4
蔗糖Bioshop CanadaSUC700.1
磷酸二氢钠Sigma AldrichS5011-500G
磷酸氢二钠Sigma AldrichS9390-500G
50 mL 离心管Fisher Scientific12-565-271
异戊烷Fisher ScientificAC126470010又称2-甲基丁烷；有害
琼脂Sigma AldrichA1296-100G
小型称量皿Fisher Scientific02-202-100
振动切片机LeicaVT1000 S
6孔组织培养板Fisher Scientific08-772-1b
带网底的组织培养小室Fisher Scientific07-200-214
多聚甲醛（PFA），16%电子显微镜科学公司15710-S危险的
氨水Fisher ScientificA669S-500危险的
Kodak 定影液 ASigma AldrichP7542
SuperFrost Plus 载玻片Fisher Scientific12-550-15
CitroSolv 透明剂Fisher Scientific22-143-975
无水乙醇商业酒精N/A
焦油紫Sigma AldrichC1791
PermountFisher ScientificSP15-100
正置显微镜OlympusBX53 型号
彩色相机，12 位MBF BiosciencesDV-47dQImaging 部件编号 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D电动显微镜载物台、控制器和编码器MBF BiosciencesN/A由 MBF Biosciences 提供并集成至显微镜
4X 显微镜物镜奥林巴斯4× 0.16 数值孔径 UplanSApo
10倍显微镜物镜Olympus10倍 0.3 数值孔径 UPlan FL N 
30倍显微镜物镜Olympus30倍 1.05 数值孔径 UPlanSApo 
60倍显微镜物镜奥林巴斯60x 1.42 数值孔径 平场复消色差物镜
硅油浸油奥林巴斯Z-81114
Neurolucida 软件MBF Biosciences版本 10
ImageJ 软件美国国立卫生研究院当前版本安装 OME Bio-Formats 插件后
Photoshop 软件Adobe版本 CS6

参考文献

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