使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

摘要

我们介绍一种在厚脑切片中使用高尔基-考克斯染色法的实验方案，以实现对具有长树突的神经元进行可视化观察 单个组织样本中包含的树木。本方案还介绍了两种变体，分别涉及焦油紫复染，以及未处理脑组织的冷冻以实现长期保存。

摘要

高尔基-考克斯神经元染色法已应用两百多年，用于增进我们对组织学脑样本中神经元形态的理解。尽管从实际操作角度而言，尽可能制备较厚的脑切片有助于提高在单个切片内完整观察到染色神经元的概率，但该方法在技术上受限于高倍显微镜物镜的工作距离。本文报道了一种使用高尔基-考克斯法对小鼠脑组织进行染色的实验方案，脑切片厚度为500 μm，并采用配备高分辨率30X 1.05 N.A.硅油浸没物镜（工作距离达800 μm）的直立显微镜，实现对整个切片深度内神经元的清晰成像。此外，我们还介绍了该方案的两种实用变体：一种可用于对贴片脑切片表面进行焦油紫尼氏染色复染，另一种可在切片和最终处理前将完整脑组织冷冻以实现长期保存。主方案及其两种变体均可产生染色良好的厚脑切片，使完整的神经元树突 树及树突棘得以可靠地观察与定量分析。

引言

组织样本中单个神经元的可视化能够实现 原位 神经元形态学特征分析极大地推动了我们对大脑及其受内源性疾病或外源性环境因素影响机制的理解。Golgi-Cox染色法是一种经济、相对简便的脑内随机神经元染色方法。该方法最初由Golgi建立¹ 并由 Cox 修改² 19世纪以来，研究人员多年来不断改进这一技术，以获得清晰且染色良好的神经元，可用于可视化并量化树突树形态和树突棘密度^{3,4,5,6,7,8,9}.

可视化脑切片中染色神经元时，一个重要的技术考量因素是切片的最大厚度，该厚度受限于现有高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离。常用的60–100倍油镜虽能提供优异的分辨率，但其工作距离通常不超过200 μm，因而存在局限性。厚度在200 μm左右的脑切片可能足以用于观察某些可完全包含在此切片厚度内的神经元类型，例如....

方案

本研究使用成年雌性CD1品系小鼠。使用不同性别和年龄的动物也可获得相似的染色结果。实验动物的饲养和管理遵循加拿大动物护理委员会的原则和指南，实验方案已获得圭尔夫大学动物护理委员会的批准。

1. 高尔基-考克斯染色

1. 脑组织高尔基-考克斯染色
   1. 配制高尔基-考克斯溶液：分别将1%（w/v）重铬酸钾和0.8%（w/v）铬酸钾溶解于高质量纯水中，混合后加入1%（w/v）氯化汞，用1号滤纸过滤最终溶液。将溶液避光保存，最多可保存一个月。
   2. 使用5%异氟烷麻醉小鼠。
   3. 通过断头法处死小鼠，并迅速取出脑组织。
   4. 将脑组织放入含有17 mL高尔基-考克斯溶液的20 mL玻璃闪烁瓶中，避光、室温下孵育25天。
   5. 将脑组织转移至含有40 mL蔗糖防冻液（30%（w/v）蔗糖溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）的50 mL锥形管中，避光、4 °C条件下孵育24小时。
      注：以下三个可选步骤可用于替代主方案，以便在此阶段将脑组织冷冻以实现长期保存。
   6. 将脑组织浸入预先用干冰冷却的200 mL异戊烷中，进行整体冷冻。
   7. 将冷冻后的脑组织放入50 mL锥形管中，避光保存于-80 °C。
   8. 准备继续实验时，将脑组织放入含有40 mL蔗糖防冻液的50 mL锥形管中，避光、4....

结果

该Golgi-Cox染色方案及其所述的两种可选变体可用于可视化400 - 500 μm 厚脑切片。使用10X拍摄的二维Z投影代表性图像拼接图 客观且 5 μm Z轴方向的步进如图所示 图1：A1 - C1 包含前扣带皮层1区和次级运动皮层的大范围冠状脑切片区域¹⁸切片在 500 μm请注意，包含焦油紫染色的方案变体可用于识别皮层细胞层，例如在切片软脑膜表面处可见的皮层第1层。 图1B1还需注意，使用新鲜组织的主方案染色切片时，其外观相似图1A1）以及在实验流程中将脑组织部分冷冻以实现长期保存的方案变体（图1C1).

使用高分辨率30X 1.05 数值孔径的硅油浸入式物镜能够获取在 X 和 Y 轴方向上比使用更高倍.......

讨论

本文介绍了一种高尔基-考克斯染色方案，以及两种适用于在较厚脑切片中观察神经元的有用变体。如代表性结果所示，使用工作距离长达800 μm的高分辨率物镜，可可靠地在整个500 μm厚的脑切片深度范围内完整观察整个神经元。对相对较厚的脑切片进行研究，提高了任意类型染色神经元被完全包含在切片内的概率，这对于具有长而复杂的顶端树突树的锥体神经元尤为重要。例如，在啮齿类动物脑的冠状切片中，这种方法能够包含在吻侧或尾侧方向延伸更远的神经元，同时在切片步骤中对脑组织进行方正取材时也允许更大的操作误差空间。尽管本文仅描述了冠状面的脑切片方法，但该方案可根据需要调整用于其他切面，以确保标记的神经元完全包含在单一切片内。所采用的切片平面取决于所研究神经元群体的形态学特性。利用本方案可以观察并定量树突棘，但需要更高倍率的物镜来评估棘的类型/形态，例如用于生成图2：A3 - C3中显微照片所用的60X油镜。该方法也可用于厚切片，但受限于物镜工作距离，仅能观察切片表面区域。本方案还可适用于脑大小相近的不同物种。我们发现，标准的25天 浸渍期足以在整个小鼠、大鼠和拟鹂脑中实现神经元的充分染色，而不会导致非特异性染色或背景过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重铬酸钾	Fisher Scientific	P188-100	危险的
铬酸钾	Fisher Scientific	P220-100	危险的
氯化汞	Fisher Scientific	S25423	危险的
Whatman 1号滤纸	Fisher Scientific	1001-185
异氟烷	加拿大制药合作伙伴	CP0406V2
20 mL 闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-4
蔗糖	Bioshop Canada	SUC700.1
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S5011-500G
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL 离心管	Fisher Scientific	12-565-271
异戊烷	Fisher Scientific	AC126470010	又称2-甲基丁烷；有害
琼脂	Sigma Aldrich	A1296-100G
小型称量皿	Fisher Scientific	02-202-100
振动切片机	Leica	VT1000 S
6孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1b
带网底的组织培养小室	Fisher Scientific	07-200-214
多聚甲醛（PFA），16%	电子显微镜科学公司	15710-S	危险的
氨水	Fisher Scientific	A669S-500	危险的
Kodak 定影液 A	Sigma Aldrich	P7542
SuperFrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv 透明剂	Fisher Scientific	22-143-975
无水乙醇	商业酒精	N/A
焦油紫	Sigma Aldrich	C1791
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
正置显微镜	Olympus	BX53 型号
彩色相机，12 位	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging 部件编号 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D电动显微镜载物台、控制器和编码器	MBF Biosciences	N/A	由 MBF Biosciences 提供并集成至显微镜
4X 显微镜物镜	奥林巴斯	4× 0.16 数值孔径 UplanSApo
10倍显微镜物镜	Olympus	10倍 0.3 数值孔径 UPlan FL N
30倍显微镜物镜	Olympus	30倍 1.05 数值孔径 UPlanSApo
60倍显微镜物镜	奥林巴斯	60x 1.42 数值孔径 平场复消色差物镜
硅油浸油	奥林巴斯	Z-81114
Neurolucida 软件	MBF Biosciences	版本 10
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	当前版本	安装 OME Bio-Formats 插件后
Photoshop 软件	Adobe	版本 CS6