用于研究肿瘤细胞神经保护作用及侵袭性的海马组织切片器官型培养模型

摘要

器官型海马切片培养（OHSC）是一种 体外 模拟的模型 体内 该方案能很好地满足这一需求。本文介绍一种基于振动切片机的优化切片方法，用于制备高质量脑片，以评估新物质的神经保护潜力或肿瘤细胞的生物学行为。

摘要

在海马组织切片培养（OHSC）中，神经元和胶质细胞的形态学与功能特征均得到良好保存。该模型适用于研究神经保护、神经元电生理、神经网络活动或肿瘤侵袭等多种科学问题。尽管切片操作本身会初始造成损伤并引发胶质瘢痕形成，但OHSC中多突触环路的海马结构和神经元活性仍保持良好。瘢痕的形成可能改变局部机械特性以及小分子的扩散行为。 等等脑片技术可在无需动物手术的情况下监测脑损伤后的时间依赖性过程，并可用于研究不同脑源性细胞类型（即星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元）在生理和病理条件下的相互作用。该模型的一个矛盾之处在于缺乏血流和免疫血细胞。在神经元损伤进展过程中，来自血液的迁移性免疫细胞发挥重要作用。由于脑片中缺少这些细胞，因此可以在无外界干扰的情况下观察培养物中的内在过程。此外，在离体脑片培养（OHSC）中，培养基及外部环境的组成可被精确控制。该方法的另一优势是相较于标准制备方法，所需牺牲的动物数量更少。单只动物可获得多个离体脑片，从而可在同一只动物来源的样本中同时进行多种处理的平行研究。基于上述原因，离体脑片培养适用于分析组织损伤后或肿瘤侵袭过程中新型保护性治疗手段的效果。 关键词：离体脑片培养，脑损伤，星形胶质细胞，小胶质细胞，神经元，免疫细胞，神经保护，肿瘤侵袭，细胞相互作用，培养基控制

本文所述方案介绍了一种制备OHSC的方法，可获得高度可重复且保存良好的脑片，适用于多种实验研究，如神经保护或肿瘤侵袭研究。

引言

OHSC 是一种特征明确的模型 体外 用于研究神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞生理学与病理学特性的模型¹易于控制细胞外环境，并可在施加各种刺激后监测细胞及形态学变化。制备后，海马神经元的组织结构及其连接得以良好保存。^2,3与多种优势相比，离体脑片培养（OHSC）可在无需动物手术的情况下监测脑损伤和肿瘤侵袭过程。单个啮齿类动物脑组织可获得6至8个离体脑片。因此，OHSC能显著减少实验动物使用数量，并可在同一动物来源的脑片中测试多种药物浓度、基因操作或不同损伤模型。在基于脑片的实验中，可精确控制实验条件。此外，通过延时成像可方便地监测如继发性损伤等病理状态的时间依赖性发展过程。

在 Stoppini 等人最初建立的该实验方案中et al.⁴，描述了制备步骤，并强调了选择合适脑片的重要形态学标志。我们建议使用出生后第 7–9 天的大鼠或出生后第 4–5 天的小鼠进行制备。在这些时期，离体脑片培养物（OHSC）对机械损伤具有较强的抵抗力，并且神经元环路具有较高的重组潜力。相比之下，来自胚胎期或成年大鼠的脑片在培养过程中会迅速发生结构改变，失去其器官型形态，因此不太适合用于基础研究中长期过程的观察^{5,6,7,8,9,10,11}。影响 OHSC 存活率的另一个关键因素是脑片本身的厚度，因为扩散能力有限，从而限制了营养物质的供应^12,13,14。

方案

动物实验遵循欧洲议会和欧盟理事会2010/63/EU号指令批准的伦理政策以及神经科学研究中动物使用政策，该指令涉及用于科学目的动物的保护。

1. 仪器与培养基的准备

1. 用于制备OHSC时，请使用以下仪器：小剪刀两把、弯头镊子两把、尖头镊子一把、刀片三片（11号两片，15号一片）、手术刀柄三个、圆形滤纸（直径：35 mm）、琼脂、剃须刀片一片、未改装的巴斯德移液管一根，以及去尖端的改装巴斯德移液管一根。所有材料在使用前需经高压灭菌器灭菌图1).
2. 称取5 g琼脂，溶于100 mL蒸馏水中。将溶液在高压灭菌锅中于121.7 °C、210.8 kPa条件下灭菌20 min。使用无菌玻璃移液管将3 mL液态琼脂溶液分装至60 mm培养皿中，静置使其凝固约5 h，用塑料石蜡膜封盖以防止污染，4 °C保存备用。琼脂块用于在切片过程中稳定脑组织。
3. 培养基
   1. 配制200 mL制备培养基（pH 7.35），包含198 mL最低必需培养基（MEM）和2 mL L-谷氨酰胺溶液（终浓度2 mM）。在培养基制备当天配制该溶液，并于4 °C保存。
   2. 配制100 mL培养基，包含49 mL MEM、25 mL Hanks平衡盐溶液（HBSS）、25 mL（v/v）正常马血清（NHS）、1 mL L-谷氨酰胺溶液（终浓度2 mM）、100 µg胰岛素、120 mg葡萄糖、10 mg链霉素、10,000 U青霉素和800 µg维生素C，如先前报道所述。将培养基预热至37 °C，调节pH值至7.4，并经0.2 µm孔径滤膜无菌过滤。重复该操作（预热、pH调节、 等等每两天在更换培养基前进行一次。4 °C 保存条件下，培养基最多使用一周。
4. 用制备液填充一个35 mm的培养皿以保存脑组织。在工作区域的冷却包上放置两个空的培养皿，用于收集组织。

2. 使用振动切片机进行样品制备与切片

1. 使用7至9日龄大鼠或4至5日龄小鼠的脑组织，按照Stoppini方法制备器官型脑片培养（OHSC） 等.⁴ 动物断头后，用剪刀去除颅骨上的皮肤。
2. 将精细剪刀的刀片插入枕骨大孔，沿尾侧（后部）至头侧（前部）轴线剪开颅骨。再做两个与第一条切口垂直的剪切，分别将剪刀尖朝向左耳和右耳方向"T形切口").
3. 用精细镊子小心打开颅骨，注意不要损伤脑组织。使用手术刀（11号刀片）切除额极最前端部分和小脑。
4. 用解剖刀小心取出脑组织，并将其轻柔地放入盛有制备液的培养皿中（图2). 将脑组织置于样本托上，并用医用氰基丙烯酸酯胶水固定。使用琼脂块以确保机械稳定性。
5. 使用滑动式振动切片机将组织水平切成350 µm厚的OHSC。
6. 使用双目显微镜对切片进行光学评估。立即弃去质量较差的离体海马切片。应仅选取来自背侧与腹侧海马之间中段区域、细胞构筑完整且结构完好的切片（见图3和图4）。
7. 使用解剖刀（圆形刀片，型号15）分离海马区与内嗅皮层； 图3）。必须保留穿通通路和内嗅皮层。
8. 每次可从每只脑组织中获得6至8个离体海马切片（OHSC）。将2-3个切片转移至一个细胞培养插件（孔径0.4 µm）中，并将其放入6孔培养板的一个孔内，每孔加入1 mL培养基。
9. 将6孔板置于35 °C、含5% (v/v) CO的完全湿润大气环境中孵育₂ 每隔一天更换一次细胞培养基。
   注意：在第6天进行实验 体外 （第6天时，与切片操作相关的炎症反应消失。此时，小胶质细胞再次呈现分支状形态，突触连接也已成熟。）

3. 组织质量评估

1. OHSC 中变性神经元的固定、标记与可视化
   1. 完成实验后，在固定前将 OHSC 与 5 µg/mL 碘化丙啶（PI）共同孵育 2 小时，以标记变性神经元的细胞核。
      注意：PI 为疑似致癌物，操作时务必穿戴个人防护装备（PPE），如手套。
   2. 用 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗 OHSC，并用 4%（v/v）多聚甲醛（PFA）溶液固定 24 小时。
      注意：PFA 具有毒性且为疑似致癌物，操作时应在通风橱中进行，并穿戴个人防护装备。
   3. 在插入物中用 1 mL PBS 清洗 OHSC，并使用钟表匠毛刷将脑片从膜上分离。
   4. 在 24 孔板中使用 IB₄ 染料对 OHSC 进行标记（图 5）。
2. 使用荧光标记单细胞进行肿瘤侵袭实验
   1. 实验开始前 24 小时，使用荧光染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA SE）对肿瘤细胞进行标记。
   2. 用血细胞计数板（Neubauer 计数室）收集并计数肿瘤细胞。
   3. 将细胞重悬于培养基中，使 10 µL 悬液含有目标数量的细胞（通常为 50,000 或 100,000 个细胞）。
   4. 将 10 µL 细胞悬液滴加至脑片培养物上，允许细胞侵袭 3 天。
   5. 实验结束后，用 4%（v/v）PFA 固定脑片培养物 24 小时，再用 PI 标记共培养物 24 小时，以显示细胞结构。
      注意：PFA 具有毒性且为疑似致癌物，操作时应在通风橱中进行，并穿戴个人防护装备。
   6. 使用封片介质将共培养物封固于盖玻片上，用于后续分析。

4. OHSC 实验的评估

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析OHSC。检测PI标记的变性神经元或PI标记的细胞结构时，采用波长λ = 543 nm的单色光，并使用波长范围为λ = 585–615 nm的发射带通滤光片。对于CFDA标记的肿瘤细胞或IB₄标记的小胶质细胞，使用波长λ = 488 nm的激发光。在两种实验条件下，均采集厚度为2 µm的光学切片z轴层扫图像，并用于后续分析。

结果

神经保护研究：为确定神经元损伤，对齿状回颗粒细胞层（GCL）每隔第三个光学切片中PI阳性细胞核和IB₄阳性小胶质细胞的数量进行计数。在肿瘤侵袭实验中，采用最大强度z投影法对图像堆栈进行处理，以计算肿瘤细胞覆盖的面积，作为侵袭程度的指标，并用于观察不同的侵袭模式（图6）。

在未处理的对照组OHSC（CTL）中，神经元保持良好。在齿状回（DG）的颗粒细胞层（GCL）中，几乎未观察到PI阳性的神经元核（图5A）。在分子层中，大多数小胶质细胞呈分支状。在DG的GCL中，仅检测到极少数IB₄阳性的小胶质细胞（图5A）。在使用50 µM N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）孵育后，与对照组OHSC相比，PI阳性神...

讨论

本方案描述了脑片培养物（OHSC）的制备方法。该模型可用于检测脑组织在施加生理性和病理性刺激后的内在功能与反应。除了可分析电生理参数外，还可对OHSC进行损伤处理，并确定损伤对所有细胞类型的影响。此外，可使用不同物质进行处理，从而详细描述损伤过程或在无巨噬细胞和淋巴细胞情况下的修复过程。

成功制备和培养的关键步骤包括：1）在无菌条件下操作，2）正确配制培养基，注意温度和pH，以及3）在处理OHSC时培养必要的手动操作技巧。

离体脑片培养物的特征

由于神经元细胞形态未发生改变及其 体内类器官样结构，因此这些切片被称为器官型切片。OHSC包含锥体细胞层和颗粒细胞层，分别由海马角（CA1、CA2、CA3）的锥体细胞和齿状回（DG）颗粒细胞组成。海马的某些区域具有高度有序的结构，传入纤维投射以非重叠的方式终止于特定的层次。在制备后，内嗅皮层（穿通通路）、齿状回、CA3和CA1神经元之间的传出连接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Falcon	35-3046
琼脂	Fluka	5040
高压灭菌器	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）LSM700	Carl Zeiss
Eagle´s 最低必需培养基	Invitrogen	32360-034
荧光素标记的长蒴菜豆（Bandeiraea）凝集素 I	Vector Labs	FL-1101
葡萄糖	Merk	1083371000
谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
Hank´s 平衡盐溶液（含 Ca2+ 和 Mg2+）	Invitrogen	24020-133
Hank´s 平衡盐溶液（不含 Ca2+  和 Mg2+）	Invitrogen	14170-138
胰岛素	Sigma Aldrich	I5500
L-抗坏血酸	Sigma Aldrich	A5960
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
LN229	Cell-Lines-Service	300363
医用氰基丙烯酸酯胶（Histoacryl 胶）	B.Braun	1050052
Millicell 培养插件	Millipore	PICMORG50
NMDA N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	M3262
正常马血清	Invitrogen	26050-088
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
培养皿（各种规格）	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	有毒
碘化丙啶（PI）	Sigma Aldrich	81845-25MG	有毒
U138	ATCC	HTB-14
振动切片机	Leica	Leica VT 1200