方法文章

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

DOI：

10.3791/55362

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2017年3月1日

 ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana–Champaign

本文内容

摘要

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细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微加工的细胞微阵列由在弹性水凝胶表面接触打印的生物分子组合构成，为测量阵列化生化信号对细胞分化的影响提供了一个高度可控、高通量的工程化系统。近期利用细胞微阵列的研究已证明其在并行呈现多种微环境因素的组合研究中的实用性。然而，这些研究主要集中在探究生化信号对细胞反应的影响。本文介绍了一种具有可调材料特性的细胞微阵列平台，可用于通过免疫荧光检测细胞分化，并通过牵引力显微镜评估细胞与基底之间的生物力学相互作用。为此，我们开发了两种不同格式，分别在显微镜载玻片或玻璃底培养皿上制备具有不同杨氏模量的聚丙烯酰胺水凝胶。我们提供了在这些水凝胶基底上制备微阵列、后续细胞培养及数据采集的最佳实践与故障排除方法。该平台非常适合用于研究那些生化因素（例如，细胞外基质组成）和生物物理因素（例如，基底刚度）均可能发挥重要且相互关联作用的生物学过程。

引言

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细胞与周围微环境因素之间的相互作用，在发育、稳态以及疾病发生过程中介导了多种多样的生物学过程1,2,3,4这些微环境相互作用包括向细胞递送可溶性因子、细胞与基质的结合，以及通过配体-受体结合介导的细胞间相互作用。除了上述生化因素外，还包括基底力学性能等生物物理参数（例如，杨氏模量、孔隙率）和细胞形态及其相关的下游机械转导在细胞分化中的关键介导作用正日益受到重视5,6,7,8,9,10由这些微环境相互作用产生的信号可作为基因网络和信号通路的输入信号。此外，这些细胞内在组分还通过分泌因子和基质降解酶向微环境提供反馈，从而形成细胞内在遗传程序与细胞外在微环境因素之间复杂的共调控回路。5,11,12.

利用工程化系统对微环境因子进行可控呈现，在多种不同情境下已被证明具有重要价值13,14,15。特别是微加工系统，通过微型化实现了蛋白质和细胞的精确空间排布，以及高通量平行化分析13,16,17,18,19,20,21,22。细胞微阵列即为其中一种微加工系统，其通过接触式打印将多种生物分子组合点样至弹性聚丙烯酰胺水凝胶基底上23,24,25。通过引入细胞黏附组分（即基质蛋白），可在微阵列上实现细胞的长期黏附与培养，随后常通过免疫细胞化学染色和荧光报告系统进行下游分析。细胞微阵列已被成功应用于深入理解肝细胞表型23,26、神经前体细胞分化27、乳腺前体细胞命运决定28、胚胎干细胞维持与分化23,29,30、肺癌转移31以及黑色素瘤治疗反应32。我们近期已证实，细胞微阵列可用于阐明细胞外基质（ECM）蛋白组成在内胚层特化33、肝前体细胞分化34,35以及肺肿瘤细胞药物反应36中的作用。在这些研究中，我们重点拓展了阵列平台的组合能力，并探索了细胞内在信号通路与细胞外基质组成及生物力学特性之间的相互作用。此外，我们在该阵列平台上引入了生物物理读出方法，以定量表征细胞收缩力在分化过程中的作用35。为此，我们将牵引力显微镜技术（TFM）与细胞微阵列相结合，实现对细胞产生牵引力的高通量评估。TFM 是一种广泛应用的技术，用于测量细胞产生的牵引力，已在揭示单细胞及组织水平功能与局部微环境组成和生物力学特性协调机制方面提供了重要见解37,38,39,40。因此，将 TFM 与细胞微阵列结合，构建了一个高通量系统，可用于测量关键且具有生理相关性的生物物理参数。

此处描述的细胞微阵列平台包含四个部分：聚丙烯酰胺基底的制备、阵列的制备、细胞培养与检测信号读取，以及数据分析。参见 图1 有关前三个实验部分的示意图总结，请参见 图2 有关最终部分的示意图总结，重点为免疫荧光数据分析。为将细胞微阵列平台应用于细胞-基质生物力学相互作用的研究，我们采用了可调节杨氏模量但孔隙率相似的聚丙烯酰胺基质，依据Wen等人的方法 等41为了实现对细胞施加于基底上的力进行牵引力显微镜（TFM）测量，除了其他研究团队常使用的厚玻璃显微镜载玻片外，我们还采用了玻璃底培养皿的结构。因此，该细胞微阵列平台能够并行测量细胞分化情况 通过 在显微镜载玻片上进行免疫荧光染色，并在独立的玻璃底培养皿上通过牵引力显微镜（TFM）检测细胞产生的力学力。我们还对细胞微阵列常用的分析方法进行了多项改进：具体而言，不再采用对整个细胞岛整体强度进行参数化Z评分的方法，而是测量单个细胞的荧光强度，并应用分位数归一化，以校正非正态分布，更准确地描述细胞行为。我们认为，这些改进在研究生化信号与生物物理信号均发挥重要且相互交叉作用的生物学过程时具有特别的价值。此外，我们的分析方法改进使得细胞微阵列可被应用于更广泛细胞功能的研究，特别是在单细胞水平与群体水平行为存在差异的情况下。

方案

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1. 聚丙烯酰胺基底的制备

  1. 清洗玻璃基底——用于终点免疫荧光的普通显微镜载玻片或用于牵引力显微镜（TFM）的35 mm玻璃底培养皿，以确保聚丙烯酰胺水凝胶在细胞培养过程中的最佳制备效果和结构完整性。也可使用预先清洗好的玻璃基底。
    1. 将玻璃基底浸入含0.25% v/v Triton X-100的蒸馏水（dH2O）中，置于旋转摇床上处理30分钟。
    2. 移除Triton X-100溶液，用dH2O冲洗基底5次。将基底保留在最后一次冲洗液中，并在旋转摇床上继续处理30分钟。
    3. 移除dH2O，将基底浸入丙酮中，在旋转摇床上处理30分钟。
    4. 移除丙酮，将基底浸入甲醇中，在旋转摇床上处理30分钟。
    5. 移除甲醇，用dH2O冲洗基底5次。将基底浸入0.05 N NaOH溶液中，并在旋转摇床上处理1小时。
      警告：NaOH具有强腐蚀性，可能导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时须佩戴防护手套、防护服和护目镜。
    6. 移除NaOH溶液，用dH2O冲洗基底5次。使用过滤压缩空气吹干基底，并在加热板上110 °C烘烤至完全干燥（5–15分钟）。清洗后的基底可在室温下长期保存。
  2. 对洁净的玻璃基底进行硅烷化处理，以确保聚丙烯酰胺水凝胶的牢固附着。
    1. 将洁净的玻璃基底浸入新配制的含2% v/v 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（3-TPM）的乙醇溶液中，置于旋转摇床上处理30分钟。
      警告：3-TPM为易燃液体，应远离热源、火花、明火和高温表面，仅可在化学通风橱中使用。
    2. 移除3-TPM溶液，将基底浸入乙醇中，在旋转摇床上处理5分钟。
    3. 使用过滤压缩空气吹干基底，并在加热板上110 °C烘烤至完全干燥（5–15分钟）。硅烷化处理后的基底可在室温下保存最多1个月。
  3. 方案一：在硅烷化处理的显微镜载玻片上制备聚丙烯酰胺水凝胶，用于终点免疫荧光检测。
    1. 在dH2O中配制所需浓度（w/v）的丙烯酰胺/双丙烯酰胺预聚体溶液，以制备具有不同杨氏模量（Young's moduli）且孔隙率相似的基底：4 kPa（4%丙烯酰胺，0.4%双丙烯酰胺）、13 kPa（6%丙烯酰胺，0.45%双丙烯酰胺）或30 kPa（8%丙烯酰胺，0.55%双丙烯酰胺），参照Wen et al.41的方法。充分涡旋至溶液澄清，并用0.2 µm注射器滤器过滤。预聚体溶液可在4 °C保存3个月。
      警告：接触丙烯酰胺或双丙烯酰胺可能导致急性毒性、神经毒性和刺激。操作时须佩戴防护手套、防护服和护目镜。
    2. 配制20% w/v Irgacure 2959的甲醇光引发剂溶液。该光引发剂溶液不可保存，每次使用前需新鲜配制。
    3. 按9:1（预聚体:光引发剂）比例混合预聚体溶液和光引发剂溶液。可选步骤：在真空腔中脱气15分钟以去除气泡。
    4. 将硅烷化处理的载玻片放入玻璃干燥盘中，每张载玻片上加100 µL 9:1的预聚体:光引发剂混合液。轻轻覆盖22 × 60 mm的盖玻片，避免产生气泡。注意：盖玻片可防止氧气抑制聚合反应。
    5. 将干燥盘放入紫外交联仪中，用365 nm紫外A光照射10分钟（4 W/m2）。可根据需要优化聚合时间。照射时间过长可能导致盖玻片难以移除（因过度聚合）；时间过短则可能导致聚合不完全，水凝胶稳定性降低。
    6. 将水凝胶浸入dH2O中5分钟。用刀片小心移除盖玻片，注意避免损伤已聚合的水凝胶。
    7. 将水凝胶在室温dH2O中浸泡1–3天，每天更换dH2O。在加热板上50 °C脱水至干燥（15–30分钟），并在室温下保存，最长可达3个月。
  4. 方案二：在硅烷化处理的35 mm玻璃底培养皿上制备含荧光微球的聚丙烯酰胺水凝胶，用于通过牵引力显微镜（TFM）实时评估细胞-基底相互作用。
    1. 将1 µm荧光微球的储备液超声处理15分钟，以分散聚集体。
    2. 在dH2O中配制所需浓度（w/v）的丙烯酰胺/双丙烯酰胺预聚体溶液，以制备具有不同杨氏模量（Young's moduli）且孔隙率相似的基底：4 kPa（4%丙烯酰胺，0.4%双丙烯酰胺）、13 kPa（6%丙烯酰胺，0.45%双丙烯酰胺）或30 kPa（8%丙烯酰胺，0.55%双丙烯酰胺），参照Wen et al.41的方法。充分涡旋至溶液澄清，并用0.2 µm注射器滤器过滤。预聚体溶液可在4 °C保存3个月。
      警告：接触丙烯酰胺或双丙烯酰胺可能导致急性毒性、神经毒性和刺激。操作时须佩戴防护手套、防护服和护目镜。
    3. 将荧光微球加入预聚体溶液中，终浓度为0.2% v/v，充分涡旋混匀。
    4. 配制20% w/v Irgacure 2959的甲醇光引发剂溶液。该光引发剂溶液不可保存，每次使用前需新鲜配制。
    5. 按9:1（预聚体/微球:光引发剂）比例混合预聚体/微球混合液与光引发剂溶液。可选步骤：在真空腔中脱气15分钟以去除气泡。
    6. 将硅烷化处理的35 mm玻璃底培养皿放入玻璃干燥盘中，每皿中心加入20 µL 9:1的预聚体/微球:光引发剂混合液。轻轻覆盖12 mm圆形盖玻片，避免产生气泡。注意：盖玻片可防止氧气抑制聚合反应。
    7. 为使荧光微球分布至水凝胶表面，参照Knoll et al.42的方法，将培养皿倒置，在室温下静置20分钟。
    8. 保持倒置状态，用365 nm紫外A光照射10分钟（4 W/m2）。可根据需要优化聚合时间。照射时间过长可能导致盖玻片难以移除（因过度聚合）；时间过短则可能导致聚合不完全，水凝胶稳定性降低。
    9. 将水凝胶浸入0.1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中，在避光条件下室温孵育过夜。用刀片小心移除盖玻片，注意避免损伤已聚合的水凝胶。
    10. 在加热板上50 °C脱水至干燥（15–30分钟）。水凝胶可在避光条件下室温保存3个月。

2. 阵列的制备

  1. 准备用于打印生物分子的缓冲液。根据目标生物分子选择合适的打印缓冲液。生长因子（GF）打印缓冲液通常也适用于其他类别的分子，例如细胞-细胞配体。
    1. 配制2× ECM蛋白打印缓冲液：将164 mg醋酸钠和37.2 mg乙二胺四乙酸（EDTA）加入6 mL去离子水（dH₂O）中2O. 涡旋混匀并在37 °C孵育以充分溶解。溶解后，加入50 µL预热的Triton X-100和4 mL甘油。再次涡旋并37 °C孵育以溶解。加入40–80 µL冰醋酸，滴定调节pH至4.8。2× ECM蛋白打印缓冲液可在4 °C保存1个月。
      警告：乙酸易燃且具有腐蚀性。请佩戴防护手套、防护服和护目用品。
    2. 配制2× GF打印缓冲液时，将105.5 mg醋酸钠和37.2 mg EDTA加入6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。涡旋混匀，并在37 °C孵育以充分溶解。溶解后，加入100 mg 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸（CHAPS）和4 mL甘油。2× GF蛋白打印缓冲液可在4 °C保存1个月。
  2. 准备源板。
    1. 在384孔V型底微孔板中，将2×打印缓冲液与每种生物分子溶液等体积混合，生物分子溶液的浓度为靶浓度的两倍。
      注意：大多数常见细胞外基质蛋白的适宜目标浓度为 250 µg/mL，而其他类型阵列因子的目标浓度则根据其在水凝胶中的保留能力及生物学功能而有所不同。每孔总体积可低至 5 µL，无需超过 15 µL。除感兴趣的生物分子组合外，还需加入阵列式荧光标记物，以方便后续图像分析。使用罗丹明标记的葡聚糖（2.5 mg/mL）。
    2. 用移液器充分混匀各孔，注意避免产生气泡。将源微孔板在100 × g条件下离心1分钟。使用同一天制备并储存于4 °C的源板进行微阵列制备。
  3. 根据制造商的说明，在每次微阵列制备运行前对点样针进行清洁。将清洁后的点样针直接装入微阵列点样仪的点样头中。
  4. 使用制造商提供的软件准备并编程微阵列点样仪。尽管以下步骤部分针对本实验所用的特定微阵列点样仪，但大多数微阵列点样仪的操作相似。
    1. 打开加湿器，将设定值调整为65%相对湿度（非冷凝状态），并等待流变仪达到设定值。将源板放入相应的适配器中。
    2. 在50 °C下将水凝胶基底脱水15分钟，并放入相应的适配器中。微阵列仪配有适用于显微镜载玻片和微孔板的适配器。若需在35 mm玻璃底培养皿上进行点样，可将培养皿装入6孔微孔板中，再将微孔板置于阵列仪的微孔板适配器内。
    3. 调整程序参数，以准确反映源板布局、阵列设计和所需格式例如，载有35 mm培养皿的显微镜载玻片或微孔板）。每种处理条件之间需使用水和二甲基亚砜（DMSO）进行洗涤步骤，以防止残留和交叉污染。
    4. 开始芯片制备，每小时至少检查一次湿度是否保持在不低于65% RH（非冷凝状态），并确认点样针未发生堵塞。若湿度意外下降，应暂停点样，及时补充加湿器用水，并清除相关管路中的冷凝水。若点样针发生堵塞，应暂停点样，清洗点样针或更换为预先清洁好的备用点样针。需注意，只要提供足够的干燥时间，可在同一基底上依次点样多种类型的生物分子即，4小时至过夜。
    5. 程序完成后，将制备好的芯片置于覆盖铝箔的载片盒或微孔板中，在室温、65%相对湿度（非冷凝）条件下过夜保存。请注意，可能需要使用通用蛋白质染色或免疫荧光方法评估芯片质量和信号保留情况；参见 Brafman 等 详情请见25.

3. 细胞培养与检测读数

  1. 制备次日，将排列好的基底放入4孔玻片培养皿或6孔细胞培养板中，加入含1%（v/v）青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡，玻片使用4 mL，培养板使用3 mL。置于紫外C波段（UV C）照射30分钟。随后将青霉素/链霉素溶液更换为细胞培养基。
  2. 收集并计数细胞。以 500 × 103 -  2 × 106 细胞/芯片，每张显微镜载玻片加4 mL，每个35 mm培养皿加3 mL。将芯片培养物置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 2–24 小时，或直至形成细胞分布密集的细胞岛。根据您的细胞类型和具体应用需求，调整接种密度和培养时间。接种密度过低（即，密度过低或接种时间不当）可能导致阵列细胞分布不佳及生物学结果偏差。过度接种（即，高密度或播种时间可能导致因岛状结构脱落而降低阵列完整性。
  3. 在细胞岛形成后，用预热的细胞培养基将芯片培养物清洗两次；对于载玻片使用4 mL，培养皿使用3 mL。可选择性地加入适当的对照和处理因素例如小分子抑制剂，生长因子 等等。) 对生物系统具有研究意义。每隔1–2天更换一次阵列的培养基，以维持任何处理因素的浓度。在开始阵列培养后的1–5天内，通过免疫荧光检测细胞标志物表达和细胞功能，或通过牵引力显微镜（TFM）检测细胞-基质相互作用——参见下文选项1和选项2。
  4. 选项1：进行终点免疫荧光检测。请注意，某些蛋白质的免疫荧光染色可能需要使用甲醇、乙醇或盐酸进行更严格的通透处理。由于这些处理可能对芯片造成损伤，因此在大规模实验前应先评估并优化每种通透方案。
    1. 从4孔板中的阵列玻片上吸除细胞培养基，每片加入4 mL新配制的4%（v/v）多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液，室温孵育15分钟。
      警告：接触PFA可能导致急性毒性，并在接触时刺激或腐蚀皮肤。请佩戴防护手套、防护服和护目用具，仅可在化学通风橱中使用。
    2. 吸弃PFA溶液，每张切片用4 mL PBS洗涤3次。固定后的切片可在4 °C保存1周。然而，为确保芯片完整性，建议在固定当天继续完成免疫标记和封片操作。
    3. 吸弃 PBS，每张玻片加入 4 mL 含 0.25% v/v Triton X-100 的 PBS。室温孵育 10 分钟。
    4. 吸弃Triton X-100溶液，每张载玻片用4 mL PBS洗涤3次。每张载玻片加入4 mL与二抗物种匹配的5% (v/v) 血清例如，用于驴源二抗的驴血清）溶于PBS中，室温孵育1小时。
    5. 彻底移除每张载玻片上的封闭液。每张载玻片加入500 µL用5% v/v血清PBS溶液稀释的一抗。该体积足以覆盖芯片，适用于室温孵育1小时或4 °C过夜孵育。
    6. 每张芯片载玻片用 4 mL PBS 洗涤 3 次。彻底去除最后一次洗涤液后，每张载玻片加入 500 µL 用 5% v/v 血清 PBS 溶液稀释的相应二抗。
    7. 每张芯片载片用 4 mL PBS 洗涤 3 次，再用 dH₂O 快速洗涤一次2用镊子小心地从溶液中取出芯片载片，然后用实验室纸巾吸去或擦干残留的去离子水2O.
    8. 用移液器吸取100 µL含DAPI的封片液，均匀覆盖载玻片表面，并在操作过程中目视确认整个阵列区域完全被液体覆盖。
    9. 将22 × 60 mm盖玻片覆盖在载玻片上进行封片。用透明指甲油密封盖玻片边缘。避光保存于4 °C，待成像前使用，最早于次日进行。
    10. 使用微阵列扫描仪或配备机器人载物台的倒置荧光显微镜对整个阵列进行成像。微阵列扫描仪可实现更快的读取速度，但可能需要与Cy3或Cy5兼容的荧光染料，且在单细胞水平上的分辨率通常有限即，1–10 µm）。荧光显微镜提供了使用多种荧光通道和更高分辨率的选项<1 µm，总放大倍数约100×），但读取速度较慢，具体取决于机器人载物台的质量以及放大倍数/物镜。
    11. 将任一方法捕获的整个阵列图像以 TIFF 文件格式保存，以避免其他文件格式可能引起的数据压缩或丢失例如，JPG）。
  5. 选项2：使用牵引力显微镜技术（TFM）对细胞-基质相互作用进行活体评估。
    1. 在PBS中配制含1% v/v牛血清白蛋白（BSA）和1% v/v十二烷基硫酸钠（SDS）的溶液，用于TFM过程中使细胞从基质上解离。
    2. 将含有阵列培养物的35 mm培养皿转移至培养箱（37 °C，5% CO₂）中2配备机器人载物台用于TFM测量的倒置荧光显微镜
      1. 在其中一个培养皿中，使用相差显微镜标记各个细胞岛的位置（X 坐标，Y 坐标）和焦平面（Z 坐标）。
      2. 切换至远红荧光显微镜以观察微珠。返回上一步中保存的各个位置，调整焦平面的Z坐标，使焦平面仅聚焦于细胞岛下方的第一层微珠。保存新的坐标，随后对所有细胞岛进行自动成像，以获取解离前的相差图像和远红荧光图像。
    3. 向培养皿中小心加入 150 µL BSA/SDS 溶液，静置 5 分钟，以使细胞完全从基质上解离；使用相差显微镜监测细胞解离情况。
    4. 待细胞岛从基质上解离后，返回标记的位置，检查第一层微珠是否仍处于焦平面内。如果这些微珠因细胞牵引力引起的形变而偏离焦平面，则调整焦平面的Z坐标，使其重新清晰对焦。保存校正后的Z坐标，并重复对所有细胞岛进行自动成像，以获取解离后的远红荧光图像。
    5. 对剩余的培养皿重复步骤 3.5.1 – 3.5.4。

4. 数据分析

  1. 免疫荧光数据分析。
    1. 处理获取的阵列图像。将复合阵列图像拆分为包含各个通道（即，红色、蓝色或绿色）的独立文件，并转换为8位TIFF图像43,44。应用像素合并（例如，2×2或4×4）以将每个通道的图像大小减小至约32兆像素，从而降低下游全阵列图像单细胞分析过程中的内存需求。有关这些阵列处理步骤的ImageJ宏实现，请参见补充代码文件"array_processing.ijm"。
    2. 记录罗丹明偶联葡聚糖标记物或阵列条件的左上角、左下角和右下角的像素坐标。利用这些坐标将8位TIFF图像旋转至完全垂直，并在后续用于将单细胞分析结果与特定阵列条件进行注释。有关这些阵列旋转和网格划分步骤的实现，请参见补充代码文件"rb_array_rotater.ijm"、"rg_array_rotater.ijm"、"rgb_array_rotater.ijm"和"array_gridding.ijm"。
    3. 在CellProfiler（版本2.1.1）45中对经过像素合并和旋转的8位TIFF图像进行单细胞分析，使用以下模块：IdentifyPrimaryObjects、IdentifySecondaryObjects和MeasureObjectIntensity。IdentifyPrimaryObjects用于识别细胞核，IdentifySecondaryObjects用于识别与每个细胞核相关的免疫标记，MeasureObjectIntensity则提供细胞核标记和免疫标记的定量结果。
      1. 使用ExportToSpreadsheet模块将三个模块输出的单细胞数据按通道导出为CSV文件，以便后续分析。有关针对包含红色、绿色或蓝色通道图像集的这些步骤的CellProfiler流程实现，请参见补充代码文件"b_array_image_analysis.cppipe"、"gb_array_image_analysis.cppipe"、"rb_array_image_analysis.cppipe"和"rgb_array_image_analysis.cppipe"。
    4. 为校正实验变异性和非高斯分布的单细胞数据，需按生物学重复进行分位数归一化46。该过程可在不同重复间生成共享分布，从而实现对免疫标记强度变化的无偏比较。此外，与Z-score标准化及其他参数方法不同，分位数归一化是一种非参数方法，不假设数据具有特定分布形式，因此能够更真实地分析单细胞行为随阵列条件的变化。
    5. 绘图与结果解读。根据具体生物学系统和研究假设，针对每种阵列条件计算并绘制以下一种或多种集合度量：
      1. 计算并绘制每个岛状结构中的细胞数量，作为整个实验过程中细胞黏附和存活能力的综合指标。
      2. 计算并绘制经分位数归一化的免疫标记强度，作为细胞命运或功能的度量。
      3. 计算并绘制免疫标记阳性细胞所占百分比，阳性定义为信号强度高于一致设定的阈值（通常为阴性对照平均强度以上2个标准差）。
      4. 或者，绘制免疫标记强度的分布图，以观察和分类单细胞行为随阵列条件的变化。这些分布可进一步通过集中趋势指标（均值、中位数、众数）和变异度指标（方差、变异系数、Fano因子）进行表征，并采用Kolmogorov-Smirnov检验等假设检验方法进行分析。
  2. 牵引力显微镜（TFM）数据分析。此处描述的方法整合了Butler et al. 和 Wang et al. 之前开发的算法40,47。
    1. 使用ImageJ批量将图像转换为8位TIFF文件。应用像素平均合并（例如，2 × 2）以降低下游分析的计算成本和耗时。由于TFM算法主要集中于单细胞分析，而本实验中岛状结构的细胞-基底接触面积（约17.5 × 103 µm2）远大于单个细胞的接触面积（75 µm2），因此必须进行像素合并处理。
    2. 将采集的相差图像和远红荧光图像（包括解离前和解离后）输入至MATLAB等科学编程环境，并使用Butler et al. 和 Wang et al. 之前开发的算法进行处理40,47。
      1. 选择三个远离细胞岛状结构的区域，用于校正因图像漂移或样品移动引起的位移。
      2. 提供将像素转换为微米的换算因子（例如，0.454 像素/µm）、基底的杨氏模量（例如，13 kPa）以及泊松比（例如，本文所述聚丙烯酰胺凝胶为0.48）。
      3. 对每个岛状结构，在其外围绘制边界以定义几何约束；该边界外的所有力均设为零。鉴于岛状结构之间距离较大（即，450 µm），该约束系统是合理的。
    3. 计算每个岛状结构的均方根牵引应力和收缩力矩。收缩力矩是衡量细胞岛内残余应力的指标，已被证明可反映细胞间相互作用的强度48。对于每种阵列条件，需在多个岛状结构和生物学重复间对均方根值取平均，并计算相应的方差以进行假设检验。此外，也可对多个岛状结构的应力或力矩分布进行平均，从而生成反映几何特征（例如，距岛中心距离）的代表性图谱。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用该平台，我们研究了生化和生物物理信号在肝前体细胞命运决定中的作用34,35。蛋白A/G偶联的Notch配体在聚丙烯酰胺水凝胶中表现出更优的保留性和聚集性（图3A），并能够有效驱动肝前体细胞向胆管细胞命运分化（图3B）。通过单细胞分析，我们量化了肝前体细胞在细胞外基质蛋白I型胶原、III型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白存在下对Notch配体的响应（图3C），发现肝前体细胞对配体的响应还依赖于细胞外基质的微环境。最后，我们利用shRNA敲低技术构建了缺失Dll1和Jag1配体的肝前体细胞。对点阵化Notch配体的响应因这两种配体的存在与否而异，证实了细胞对外源性配体的响应能力也取决于细胞内源性配体的表达水平（图3D）。此外，在Dll1敲低条件下，我们观察到一个独特的双阳性（ALB+/OPN+）细胞亚群（图3D）。综上所述，这些代表性结果表明：（1）该点阵平台具有组合分析能力，例如可同时结合多种点阵化的细胞外基质蛋白与Notch配体，并与单个配体的敲低实验相整合；（2）不仅点阵化的细胞外基质蛋白具有功能活性，通过蛋白A/G介导偶联的细胞间配体也具备功能活性；（3）我们所采用的单细胞分析方法能够有效识别出独特的细胞亚群。

我们还观察到，肝前体细胞的分化依赖于基底刚度和细胞外基质（ECM）的组成（图4A），具体发现IV型胶原在软性和硬性基底上均支持细胞分化，而纤连蛋白仅在硬性基底上支持分化（图4B）。典型的牵引力显微镜（TFM）测量热图表明，在IV型胶原上，低基底刚度下持续的牵引应力促进了向胆管细胞的分化（图4C），该结果通过平均均方根值得到验证（图4D）。综上所述，这些代表性结果表明：（1）成功将牵引力显微镜技术与可在刚度可调基底上使用的细胞微阵列整合，用于同时评估细胞表型和牵引应力；（2）肝前体细胞命运受到基质组成和基底刚度的共同调控；（3）实现了在细胞微阵列中应用我们的TFM分析方法及典型的牵引应力分布图谱。

水凝胶阵列的制备：示意图展示阵列制备、细胞培养和检测读出过程。
图1：前三个实验部分的总体示意图。 在第1部分中，对玻璃基底进行清洗和硅烷化处理，以促进聚丙烯酰胺水凝胶的制备。在第2部分中，将感兴趣的生物分子组合制备于384孔源微孔板中。随后将洁净的点样针、源微孔板和聚丙烯酰胺水凝胶装入机器人阵列仪并启动运行，从而在水凝胶上制备出阵列。在第3部分中，将细胞接种到阵列区域并使其贴附，之后执行感兴趣的培养方案。在实验终点，细胞可固定用于免疫细胞化学/免疫荧光分析，或采用牵引力显微镜（TFM）进行分析。比例尺为75 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

RGB通道拆分、成像细胞术示意图；单细胞分析、分位数归一化过程。
图 2：来自阵列的免疫荧光数据的处理与分析。（A） 首先将拼接的复合32位RGB图像进行合并（binning），然后拆分为独立的8位通道。通过组合使用阵列化的荧光标记物和细胞岛，识别阵列的三个角，以实现阵列的自动定向与网格划分。（B） 针对输入阵列的每个通道生成单细胞数据。为校正实验过程中的信号漂移，按生物学重复样本进行分位数归一化处理，使所有重复样本间形成一个共享的数据分布。随后，通过对集合测量值（例如，每岛细胞数、平均荧光强度、标记阳性细胞百分比）的计算或对单细胞分布的直接分析，对分位数归一化后的数据进行绘图与解释。 请点击此处查看该图的放大版本。

Static equilibrium study: Fc-JAG1, Fc-DLL1 assays; cell surface marker analysis; diagrams and graphs.
图3：Notch配体呈递介导肝前体细胞分化。 （A） 经 Protein A/G 阵列排列后，Fc-重组 Notch 配体 Jagged-1（JAG1）和 Delta-like 1（DLL1）表现出增强的滞留性和聚集性。比例尺为 50 µm。 （B） 肝前体细胞在接触Notch配体后分化为胆管细胞。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）为细胞核标记物，白蛋白（ALB）为肝细胞标志物，骨桥蛋白（OPN）为胆管细胞标志物。比例尺为150 µm。 (C) 在细胞外基质蛋白I型胶原、III型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白上，对Notch配体JAG1、DLL1和Delta样4（DLL4）阳性细胞中骨桥蛋白（OPN）阳性细胞百分比的定量分析。Student's t-针对每种阵列化的Notch配体，在每种ECM蛋白中均以对照IgG为参照进行检验，并标示出相应的P值<0.05 (*). (D) 胶原III上呈递Notch配体JAG1、DLL1和DLL4条件下，对细胞中ALB和OPN的成像流式分析。无Notch配体的肝前体细胞 Dll1 和 Jag1 (即，shDll1 和 shJag1）通过 shRNA 沉默技术构建。数据来自 (C) 以均值 ± 标准误表示。该图已根据 Kaylan 的原始内容修改 等34. 请点击此处以查看此图的放大版本。

不同基质刚度下的细胞黏附：共聚焦图像、牵引力应力图、柱状图。
图 4：基质成分与基底刚度协同调控肝前体细胞分化。（A） 肝前体细胞向胆管细胞的分化依赖于细胞外基质（ECM）成分和基底刚度。DAPI 为细胞核标记，ALB 为肝细胞标志物，OPN 为胆管细胞标志物。（B） 在杨氏模量分别为 30 kPa、13 kPa 和 4 kPa 的基底上，胶原蛋白 I（C1）、胶原蛋白 IV（C4）、纤连蛋白（FN）以及这些 ECM 蛋白所有两两组合条件下，OPN 阳性细胞百分比的定量分析。（C） 细胞牵引力应力依赖于基底刚度和 ECM 成分。（D） 在杨氏模量为 30 kPa 和 4 kPa 的基底上，胶原蛋白 I（C1）、胶原蛋白 IV（C4）、纤连蛋白（FN）以及这些 ECM 蛋白所有两两组合条件下，牵引力应力均方根值的定量分析。在（B）和（D）中，数据以均值 ± 标准误表示，对每种 ECM 组合均以 30 kPa 为对照进行 Student's t-检验，P 值标注如下：P< 0.05（*），P< 0.01（**），P< 0.001（***）。比例尺为 50 µm。本图改编自 Kourouklis et al.35。请点击此处查看本图的放大版本。

部分问题潜在原因解决方案
1. 聚丙烯酰胺基底的制备盖玻片无法从水凝胶上移除过度聚合将聚合时间缩短至<10分钟（4 W/m2）。检查紫外交联仪输出是否在预期范围内。
聚丙烯酰胺水凝胶聚合效果差聚合不足将聚合时间延长至>10分钟（4 W/m2）。检查紫外交联仪输出是否在预期范围内。
移除盖玻片后聚丙烯酰胺水凝胶受损较软的聚丙烯酰胺水凝胶容易损坏我们观察到最软（i.e.，4 kPa）的水凝胶制备产率尤其下降（约50%）。操作时应轻柔处理水凝胶，并增加起始数量以达到所需产率。
2. 阵列的制备点样形态差或不一致加湿器功能不稳定确保在每次打印过程中加湿器和流变仪正常工作，并维持65%相对湿度（RH）。
打印头针头卡住或堵塞清洁打印头以确保针头自由移动。在每次打印前后彻底清洁针头，清除针道中的聚集体。
3. 细胞培养与实验操作细胞在阵列上初始贴附后发生脱落或死亡接种密度过高及过度增殖降低初始接种密度和时间。在阵列培养期间使用“维持”或“分化”培养基以减少细胞增殖。
水凝胶释放出有毒的丙烯酰胺单体将水凝胶浸泡于去离子水（dH2O）中至少3天，以促进丙烯酰胺单体的扩散和释放，降低细胞毒性。
细胞无法贴附到阵列上接种密度不足提高初始接种密度和时间。使用贴附能力更强的细胞类型。
基质或生物分子点样条件不佳清除针头上的颗粒和聚集体，确认打印参数，并通过荧光标记物（e.g.，罗丹明标记的葡聚糖）评估点样质量。
细胞-基质相互作用的特异性不同细胞类型仅特异性地贴附于某些细胞外基质（ECM）蛋白，而对其他蛋白不贴附。请用您的细胞测试多种不同的ECM蛋白。
阵列制备后储存条件不理想建议将制备好的阵列在65%相对湿度和室温下过夜储存，部分原因是为了避免冷冻过程中的相变。细胞贴附对湿度、温度和储存时间均敏感，请确保这些参数在实验中保持一致并已优化。
细胞培养过程中水凝胶从玻璃基底上脱落载玻片清洁和硅烷化处理不佳更换用于载玻片清洁和硅烷化处理的工作液。
水凝胶过度脱水不要将水凝胶在加热板上脱水超过15–30分钟。
4. 数据分析重复点样之间及载玻片之间的变异性高阵列制备过程中的变异性检查针头和打印头是否清洁。确认加湿器功能正常。使用荧光标记物可视化并量化点样和阵列质量。按照上述建议储存阵列。

表1：故障排除。

讨论

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在我们的实验中，最常见的失败原因与所制备微阵列的质量以及目标生物系统中反应表征不佳有关。关于细胞微阵列实验中的常见故障模式及相应的排查步骤，请参见表1。特别针对阵列质量，我们建议采取以下措施：使用荧光标记分子（如罗丹明偶联葡聚糖）验证点样程序、参数和缓冲液的技术质量与稳定性；根据制造商的说明，在点样前或点样后彻底清洗点样针，并使用光学显微镜目视检查针孔通道是否无残留物；通过通用蛋白质染色或免疫标记法确认点样生物分子的保留情况。需要注意的是，分子量低于70 kDa的生物分子通常无法在水凝胶中有效保留23,31。应使用多种细胞类型验证点样生物分子的细胞功能性。需注意，仅贴壁细胞适用于微阵列；此外，细胞在阵列上的黏附能力取决于细胞自身的特性（例如，整合素表达谱）以及所选用的细胞外基质（ECM）蛋白。

由于空间有限，本文未对芯片设计、布局和制备进行详尽阐述，建议读者参考先前的研究工作23,25。我们通常使用包含100个点的子阵列（点直径为150 µm，点中心间距为450 µm），每个子阵列包含10–20种不同的生物分子条件（即每种条件5–10个点）。单个芯片上的子阵列数量取决于感兴趣的生物分子条件数，最多可在一张25 × 75 mm的显微镜载玻片上容纳1,280个子阵列（共约6,400个点，分布在64个子阵列中）25,31。上述参数会根据所需图案尺寸进一步调整；目前可方便获得能够生成75–450 µm图案的针头。

阵列实验最好通过使用其他培养形式、检测读数和生物模型系统，对感兴趣的高评分阵列化条件进行验证，以作补充。具体而言，我们建议结合标准分子生物学技术，利用大规模培养进一步验证所选阵列化条件的作用效果例如，qRT-PCR、免疫印迹）或标准TFM。遗传操作（例如在适当的生物模型系统中对目标因子进行敲低或过表达，也可用于验证芯片实验中观察到的结果。 在体 动物模型是另一种验证手段，最近被用于确认半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-8在肺癌转移微环境中的核心作用，该作用最初通过细胞微阵列技术发现31,49.

已有多种其他方法被用于研究微环境对细胞功能的调控作用，包括多种二维微加工系统18,50,51,52,53,54,55以及三维工程化生物材料系统56,57,58,59,60,61。与其他方法相比，本文所述细胞微阵列平台的特定优势包括：（1）通量可达数百至数千种不同的因子组合，能够分析因子间的相互作用效应；（2）可实现便捷的自动化成像与分析；（3）在可控呈现阵列化因子的同时，整合生化和生物物理的检测读出；（4）能够调节基底材料的理化特性；以及（5）对细胞命运和功能进行高内涵的单细胞分析。

综上所述，将细胞微阵列与可调节基底刚度的基底上的牵引力显微镜技术（TFM）相结合，能够对生化和生物物理信号进行系统表征。如本文所述，该平台具有普适性，可广泛应用于多种贴壁细胞类型和组织环境，有助于深入理解细胞微环境的协同调控作用及其对细胞分化和机械信号转导的影响。

披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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我们感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所的Austin Cyphersmith和Mayandi Sivaguru在显微成像方面的协助，以及 microscopy core 在屏幕显示和视频采集方面的慷慨支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 注射器滤器Pall Corporation4433与合适尺寸的鲁尔锁塑料注射器匹配。
100 × 青霉素–链霉素溶液Fisher ScientificSV30010
22 × 60 mm 盖玻片电子显微镜科学公司63765
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（3-TPM）Sigma-Aldrich440159按照制造商说明，在惰性气体环境下储存。3-TPM 暴露于空气可能导致玻璃基底的硅烷化效果受损。注意：3-TPM 为可燃液体，应远离热源、火花、明火和高温表面，仅可在化学通风橱中使用。
3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐水合物（CHAPS）Sigma-AldrichC3023
35 mm 玻璃底培养皿细胞 E&GGBD00002-20013 mm 孔，含 1.5 号盖玻片，适用于牵引力显微镜（TFM）和活细胞成像。
384孔聚丙烯V型底微孔板，非无菌USA Scientific1823-8400
6孔聚苯乙烯微孔板Fisher Scientific08-772-1B35 mm 玻璃底培养皿可放入微孔板的孔中，便于阵列的制备。
丙酮Sigma-Aldrich179973
丙烯酰胺Sigma-AldrichA3553警告：接触丙烯酰胺可能导致急性毒性及刺激作用。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。
I型胶原，大鼠尾部EMD Millipore08-115MI
人III型胶原蛋白EMD MilliporeCC054
IV型胶原蛋白，人源EMD MilliporeCC076
交联剂，365 nmUVPCL-1000
70 kDa 董氏兰B偶联葡聚糖赛默飞世尔科技D1841用作阵列位置的标记。
二甲基亚砜Fisher ScientificBP231
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific（HyClone）SH3001302
乙醇Decon Labs2701
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichED
小鼠Fc重组DLL1R&D Systems5026-DL-050
小鼠 Fc-重组 DLL4AdipoGenAG-40A-0145-C050
Fc-重组JAG1，大鼠R&D Systems599-JG-100
纤连蛋白，人Sigma-AldrichF2006
荧光显微镜，倒置ZeissAxiovert 200M确保显微镜配备有机器人载物台，用于自动荧光成像和牵引力显微镜（TFM）。环境控制（即., 37 °C 和 5% CO₂2对于TFM，强烈建议使用。
含DAPI的Fluoromount GSouthernBiotech0100-20
冰醋酸Sigma-Aldrich695092警告：乙酸易燃且具有腐蚀性。请佩戴防护手套、防护服和护目用品。
甘油Sigma-AldrichM6145
Irgacure 2959巴斯夫公司55047962
小鼠层粘连蛋白EMD MilliporeCC095
甲醇Sigma-Aldrich179957
微阵列扫描仪GenePix4000B荧光染料必须与 Cy3 或 Cy5 兼容。
微阵列点样仪DigilabOmniGrid 微阵列点样仪其他具有相似或更高性能的微阵列仪可轻松替换使用。
显微镜载玻片，25 × 75 mmSigma-AldrichCLS294775X25~0.9 – 1.1 mm 厚度。
N,N′- 甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）Sigma-AldrichM7279警告：接触丙烯酰胺可能导致急性毒性及刺激作用。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。
多聚甲醛（PFA），16% v/v电子显微镜科学公司RT15710现配现用PFA以获得最佳固定效果（切勿储存）。注意：接触PFA可能导致急性毒性，且接触皮肤可引起刺激或腐蚀。操作时须佩戴防护手套、防护服和护目用具，并仅在化学通风橱中使用。
重组蛋白A/G赛默飞世尔科技21186
Pyrex 干燥盘，2,000 mLFisher Scientific15-242B
矩形四腔培养皿Fisher Scientific（Nunc）12-565-495用于阵列显微镜载玻片上的细胞培养。
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
氢氧化钠Sigma-Aldrich415413警告：氢氧化钠具有强腐蚀性，可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。请佩戴防护手套、防护服和护目用具。
用于阵列的隐形针ArrayItSMP3每次阵列运行后，按照制造商的说明清洁针头。可产生150微米的点阵区域；如需更小区域，可购买其他规格的针头（75–450 微米），以适应您的特定应用需求。
Triton X-100Sigma-AldrichX100

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