利用电刺激在生物导线中促进人干细胞来源心肌细胞的成熟

摘要

心脏类导线平台是一种 体外 通过结合三维细胞培养与电刺激，用于促进人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）成熟的实验方法。本文详细介绍了心脏类器官导线平台的构建步骤。

摘要

由人多能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CMs）是一种极具前景的细胞来源，已推动其在心脏研究领域潜在应用的广泛探索，包括药物发现、疾病建模、组织工程和再生医学。然而，现有方案所产生的细胞与天然的成年心室心肌细胞相比，表现出不同程度的不成熟状态。尽管已开展大量促进hPSC-CMs成熟化的研究，但迄今为止所实现的成熟程度仍较为有限。因此，研究人员开发了一种名为“生物导线”（biowire）的工程化系统，通过提供物理和电学双重刺激，以促进hPSC-CMs在体外向更成熟的状态发展。该系统利用微加工平台，将hPSC-CMs接种于I型胶原凝胶中，并沿刚性缝合模板排列，从而组装成取向一致的心肌组织（即生物导线），随后对其进行频率逐步递增的电场刺激。与未受刺激的对照组相比，接受电刺激的生物导线心肌细胞在结构和电生理特性方面均表现出更显著的成熟化特征，且此类变化依赖于刺激频率。本文详细描述了生物导线系统的设计与构建过程。

引言

基于细胞的治疗是实现心脏修复/再生最有前景且研究最广泛的战略之一。该策略得到了心脏组织工程以及生物材料共递送技术的支持^1,2。目前大多数可用的细胞来源已在动物模型中被研究，以评估其对受损、患病或衰老心脏可能产生的有益作用³。特别是，研究人员已投入大量努力，致力于将人多能干细胞（hPSC）来源的心肌细胞（hPSC-CM）应用于心脏组织工程，因其是一种潜在的无限自体细胞来源。hPSC-CM可通过多种已建立的方案进行制备^4,5,6。然而，所获得的细胞表现出类似胎儿的表型，与成人心室心肌细胞相比具有一系列未成熟的特征^7,8。这可能阻碍hPSC-CM在药物发现研究中作为成人心脏组织模型，以及在成人心脏疾病模型构建中的应用⁹。

为了克服心肌细胞表型不成熟这一局限性，研究人员已积极探究多种新方法以促进心肌细胞的成熟。早期研究表明，周期性机械¹⁰或电刺激¹¹可有效促进新生大鼠心肌细胞的成熟。凝胶收缩和周期性机械刺激也被证明可在一定程度上改善人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的成熟度^12,13，但对电生理特性和钙处理能力的提升作用有限。因此，研究人员开发了一种名为"生物导线"（biowire）的平台系统，通过提供结构引导和电场刺激来增强hPSC-CMs的成熟度¹⁴。该系统利用微加工平台构建排列有序的心肌组织，并可施加电场刺激，从而改善hPSC-CMs的结构和电生理成熟度。本文将详细描述此类生物导线的制备方法。

方案

1. 主控设计与制备

注意：使用软光刻技术进行器件制备。制作双层 SU-8 模具用于聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制成型。

1. 使用设计与制图软件设计该装置（图1A，左侧）。分别绘制母版的每一层。以20,000 dpi将器件设计分别打印到两张光刻掩模上，对应母版的两层。¹⁵将器件图案设置为透明，周围区域设置为暗色；这些掩模将作为模板，通过光刻技术将器件图案光学转移至SU-8上（方法如他人所述）¹⁵).
2. 在4英寸硅片中心滴加约4 mL SU-8 50。使用匀胶机以2,000转/分钟（RPM）匀速旋转30秒，使SU-8 50在硅片表面均匀涂覆。将硅片置于95 °C热板上烘烤10分钟。用200 mJ/cm²的紫外（UV）光照射硅片².
3. 在晶圆中心倒入约 4 mL SU-8 2050，以 2,500 RPM 旋涂 30 秒。在 95 °C 热板上烘烤 15 分钟。冷却至室温（RT）。
4. 重复步骤1.3两次。
5. 将涂覆好的晶圆覆盖第一层透明光刻掩模，用270 mJ/cm²的紫外光照射晶圆² 制作第一层。在95 °C的加热板上烘烤15分钟。
6. 通过重复步骤1.3两次，制备第二层SU-8 2050。
7. 使用掩模对准器将第二层掩模与第一层的图形对准。然后在240 mJ/cm²的紫外光下曝光。在95 °C下烘烤15分钟。
   注意：曝光时间由所需的总紫外剂量和使用前一天测得的紫外光输出强度决定。
8. 将晶圆浸入丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）中，在轨道摇床中以200转/分钟的速度振荡30分钟以进行显影。
9. 将模具放入培养皿中，小心地将PDMS混合物（基础剂与交联剂按10:1的质量比混合）倒在晶片中央，确保完全覆盖所有结构特征，并避免产生气泡。
10. 在 70 °C 烤箱中加热 2 小时。使用锋利刀片沿 PDMS 生物导线模板边缘切割图1A， 右侧）。将PDMS从模具上剥离，用刀片修整器件。将PDMS生物线模板放入灭菌袋中，于121 °C高压蒸汽灭菌20分钟。
11. 在生物安全柜（BSC）中，将PDMS生物微线模板放入培养皿内。使用镊子夹持一段无菌外科缝合丝线（6-0），将其置于PDMS微孔通道的中央，并将其两端嵌入通道末端的凹槽中以固定图1B-I).

2. 电刺激室的构建

1. 制作一对矩形聚碳酸酯片（长 × 宽 × 厚：2 cm × 0.85 cm × 0.35 cm），用作电刺激室的框架（图2）。
2. 沿每片聚碳酸酯框架的中心线钻两个直径为3 mm的孔，两孔间距为2 cm。
3. 截取两段长度为1.5 cm的碳棒。在距碳棒一端约3 mm处钻一个直径为1 mm的孔，将铂丝穿过该孔，并通过将铂丝缠绕在碳棒上将其固定。在铂丝的另一端连接一个夹子，以便后续与电刺激器连接。
4. 将碳棒插入聚碳酸酯框架中。将装配好的带碳棒的框架放入六孔板的一个孔中。
5. 向孔中加入2 mL PDMS。使聚碳酸酯框架的底部浸入PDMS中，同时保持PDMS液面接近但不达到碳棒底部。在70 °C烘箱中加热2小时。
6. 将电刺激室从六孔板中取出，放入灭菌袋中，在121 °C下进行蒸汽灭菌20分钟。

3. hPSC-CMs 的酶解离

1. 使用已建立的方案诱导人多能干细胞（hPSC）向心肌细胞分化⁴。
   注意：简而言之，通过在干细胞培养基中依次添加骨形态发生蛋白4（BMP4）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、激活素A（activin A）、血管内皮生长因子（VEGF）和Dickkopf同源物1（DKK1），采用已建立的拟胚体（EB）方案生成心肌细胞⁴。使用分化第20至34天的拟胚体制备生物导线（biowires）。
2. 用P1,000移液器吸头从低吸附培养板中收集拟胚体，并转移至锥形管中。在室温下以125 × g离心5分钟，形成沉淀。弃去上清液，用预热至37 °C、含1%脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）的胶原酶I重悬沉淀。于37 °C孵育2小时进行消化。
3. 加入5 mL预热至37 °C的洗涤液，以125 × g在室温下离心5分钟。弃去上清液。用2 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液重悬沉淀，于37 °C孵育5分钟。
4. 加入1 mL含3%（v/v）DNAse I的终止液。
5. 将20 G（0.9 mm）针头连接至5 mL注射器，将拟胚体悬液通过针头推注3–5次。
6. 加入7 mL洗涤液，以280 × g离心5分钟。弃去上清液。用Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）重悬沉淀，并置于冰上保存。使用血细胞计数板测定细胞数量。取0.5 × 10⁶个细胞，以280 × g离心5分钟形成沉淀，弃去上清液。
7. 在无菌离心管中混合所有凝胶组分前，先将各组分置于冰上预冷。混合以下胶原凝胶组分（终浓度）：2.1 mg/mL大鼠尾部I型胶原蛋白、24.9 mM葡萄糖、23.8 mM NaHCO₃、14.3 mM NaOH、10 mM HEPES，以及10%细胞外基质（ECM），溶于1× M199培养基中。最后加入胶原蛋白和细胞外基质，通过反复吹打混匀。
8. 用3.5 µL胶原凝胶重悬0.5 × 10⁶个细胞，并充分混匀。
9. 使用P10移液器吸头将4 µL细胞悬液加入0.5 cm长的微通道中（图1B-II）。如有必要，用无菌镊子调整缝合线的位置。
10. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖培养皿底部，注意不要触碰凝胶。于37 °C孵育30分钟。
11. 将PBS更换为12 mL培养基（例如，stem pro或细胞生产商推荐的培养基），用量以覆盖细胞为宜（图1B-III）。在37 °C培养箱中培养1周，每隔一天更换一次培养基。

4. 生物导线培养的电刺激

1. 在生物安全柜中，向六孔板的每个孔中加入 2 mL PBS，该六孔板将用于放置电刺激装置室。使用无菌镊子轻轻将已灭菌的电刺激装置放入孔中，随后弃去孔内的 PBS。
2. 用 5 mL 预热的培养基覆盖碳棒。使用无菌镊子将生物导线安装到电刺激室中，并使其垂直于碳棒方向放置（图 2）。
3. 将六孔板盖盖上，但需留出足够的铂丝延伸至板外，以便连接电刺激仪。将六孔板置于 37 °C 细胞培养孵箱中，并将铂丝连接至电刺激仪。
4. 使用电刺激仪对生物导线进行刺激，设置参数如下：双相重复脉冲，脉冲持续时间 1 ms，电场强度 3 V/cm，频率为每秒 1 次脉冲（PPS）。每 24 小时逐步提高 PPS 至以下数值：1.83、2.66、3.49、4.82、5.15 和 6。每隔一天更换一次培养基。
5. 在显微镜下以 10 倍物镜观察心肌细胞在电刺激下的收缩活性。
   注意：刺激一周后，生物导线将趋于成熟（见结果部分）。

结果

在生物导线中使用缝合线的原理是作为三维结构形成的模板，使细胞沿单一轴向排列，并模拟心肌纤维的形态。我们发现，在生物导线中培养7天后，细胞重塑了缝合线周围的凝胶（图3A）。细胞沿缝合线轴向组装，形成有序排列的心肌组织（图3）。在预培养7天后，生物导线接受了为期7天的电场刺激，进一步表现出与心肌细胞结构和功能成熟相一致的特性。

生物导线中的人多能干细胞来源心肌细胞（PSC-CMs）表现出心脏收缩蛋白、肌节α-肌动蛋白和肌动蛋白的强烈表达（图4A）。我们观察到人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CM）收缩装置呈现肌节条带结构，并沿缝合线轴向排列肌原纤维结构。这种结构在定性上类似于成人心脏的结构（图4A）。其次，与拟胚体（EBs）相比，这些生物导线培养的hESC-CMs增殖率较低（图4B）。第...

讨论

本文描述了工程化平台“生物导线”（biowire）的构建与实施方法，旨在促进人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的成熟。该装置可在标准微加工设施中制备，生物导线的制备可结合常规细胞培养技术与电刺激仪完成。

据我们所知，目前尚无与生物导线（biowires）类似的方法被报道。该策略表明，心肌细胞成熟度的提升依赖于电刺激方案，这一点在采用较高刺激频率递增方案（6 Hz 对比 3 Hz）的生物导线中观察到更高的成熟水平得到了证实。与培养20天（EBd20）或40至44天（EBd44）的拟胚体（EBs）相比，生物导线中的心肌细胞表现出更低的自律性以及更高的hERG电流和I_K1。EBd20心肌细胞代表了细胞在整合入生物导线前的特性，而EBd44心肌细胞的培养时间比生物导线培养时间长10天，这表明即使以拟胚体形式延长培养时间，心肌细胞也无法达到生物导线中通过电刺激所诱导的成熟程度。然而，通过生物导线获得的心肌细胞仍不及成年心肌细胞成熟。

有研究表明，机械刺激可有效诱导人多能干细胞来源的心肌细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-抗坏血酸	Sigma	A-4544	hPSC-CM 培养基成分
AutoCAD	Autodesk, Inc		设计设备的软件
碳棒， Ø 3 mm			电刺激器腔室组件
I型胶原，大鼠尾部	BD 生物科学	354249	胶原凝胶：2.1 mg/mL 大鼠尾部I型胶原，溶于24.9 mM葡萄糖、23.8 mM NaHCO₃314.3 mM NaOH，10 mM HEPES，溶于含10%生长因子减少型Matrigel的1x M199培养基中。
I型胶原酶	Sigma	C0130	PBS（含Ca）中含0.2% I型胶原酶（w/v）和20%胎牛血清（v/v）2+ 和 Mg2+. 使用 0.22 微米滤器除菌 μm 滤膜过滤并分装为 12 mL 等份。于 -20 ℃ 保存 °C.
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	配制1 mg/mL DNase I储存液于水中。过滤除菌后，分装为0.5 mL每份，于－20°C保存 −20 °C
钻孔 &和钻头（Ø 1 mm 和 2 mm	Dremel		在聚碳酸酯框架上钻孔
电刺激器	草	s88x
胎牛血清（FBS）	WISENT 公司	080-450
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G5767	胶原凝胶组分
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm 在 25 °C，超纯，用于配制所有溶液
HEPES	Sigma	H4034	胶原凝胶组分
加热板	托里松树	HS40
Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）	赛默飞世尔科技	12440053
掩模对准器	EVG	EVG 620
基质胶，生长因子减量型	康宁	354230	胶原凝胶组分
Medium 199 (M199)	赛默飞世尔科技	11825015	胶原凝胶组分
单硫代甘油（MTG）	Sigma	M-6145	hPSC-CM 培养基成分
轨道摇床	VWR	89032-088
青霉素/链霉素（P/S）	赛默飞世尔科技	15070063
含钙磷酸盐缓冲液（PBS）2+ 和 Mg2+	赛默飞世尔科技	14040133
6孔板	康宁	353046
6 孔板，低吸附	康宁	3471
铂丝，0.2 mm			电刺激器腔室组件
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	道康宁	Sylgard 184
丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）	Doe & Ingalls 公司		开发晶圆
袋装，可剥离开启	转换器	92308	用于蒸汽灭菌
硅晶圆，4 英寸	UniversityWafer 公司
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma	S5761	胶原凝胶组分
氢氧化钠	Sigma	S8045	胶原凝胶组分
旋涂仪	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 培养基	赛默飞世尔科技	10639011	hPSC-CM 培养基。配制 50 mL 时，加入 1.3 mL 添加剂、500 μ100 L× L-谷氨酰胺，250 μ30 mg/mL 转铁蛋白的 L，500 μ5 mg/mL 抗坏血酸溶液，150 μL μ26 升 μl/2 mL 巯基甘油（MTG），以及 500 μL (1%) 青霉素/链霉素
停止培养基			洗涤液：FBS（1:1）
SU-8 50	MicroChem 公司		光刻胶，母版组件
SU-8 2050	MicroChem 公司		光刻胶，母版组件
转铁蛋白	罗氏	10-652-202	hPSC-CM 培养基成分
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	赛默飞世尔科技	25200056	hPSC-CM 培养基成分
洗涤液			含1%青霉素/链霉素的IMDM