本文介绍了一种利用WEHI 164细胞通过中和机制测定抗TNFα单克隆抗体相对抗凋亡活性的实验方案。该方案适用于比较具有相同生物学功能的不同分子的中和能力。
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本文内容
摘要
摘要
本方案展示了利用抗TNFα单克隆抗体在小鼠成纤维细胞模型（WEHI 164）中检测TNFα诱导凋亡活性的中和作用。此外，本方案也可用于评估其他抗TNFα分子，如融合蛋白。所采用的细胞模型在细胞培养条件下引入额外应激因素时，对TNFα介导的凋亡具有敏感性例如， 血清剥夺）。该流程示范了如何执行此分析测定，重点强调了与样品制备、细胞稀释、凋亡诱导及分光光度测量相关的关键操作步骤，这些环节对于确保实验成功至关重要。本方案揭示了实现最佳凋亡诱导效果和高效信号记录的最优条件，从而获得较低的不确定度数值。
引言
生物效价是基于与相关生物学特性关联的检测产品属性而测定的生物学活性的定量度量，而含量（以质量表示）则是蛋白质含量的理化度量。效价检测与其他分析方法一起，作为产品符合性、稳定性及可比性研究的一部分进行。在此意义上，效价测定用于证明在临床试验各阶段以及上市批准后，各批次产品均符合关键质量属性（CQAs）或可接受标准。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在细胞受到病毒感染或受到损害细胞活力和功能的环境因素胁迫时自然发生1,2。其中，抑制细胞凋亡或生物学中和作用是单克隆抗体（mAbs）主要已知的治疗机制之一，尤其在治疗慢性疾病（如免疫介导的炎症性疾病）中具有重要作用。抗TNFα分子通过阻断肿瘤坏死因子α（TNFα）与细胞表面p55和p75受体的相互作用3，从而抑制最终导致细胞凋亡的信号通路。
TNFα 可在某些慢性疾病中引发炎症4。作为先天免疫系统的哨兵细胞以及此类疾病中的主要效应细胞，巨噬细胞会异常地将 TNFα 分泌到细胞外环境中5。TNFα 调控失常是一条常见的致病通路，与这些疾病的发病机制密切相关。若缺乏有效调控，并在持续诱导和细胞应激条件下，TNFα 会诱导细胞死亡....
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方案
1. 培养基与溶液的制备
- 准备培养基：含 10% FBS 的 RPMI-1640，pH 7.4。
- 准备检测用培养基：不含酚红但含 1% FBS 的 RPMI-1640，pH 7.4。
- 准备细胞洗涤液：含 0.02% EDTA 的无镁无钙 DPBS 溶液，pH 7.4。
- 准备细胞解离液：含 1 mM EDTA 的 0.125% 胰蛋白酶溶液。
- 解冻 100 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并转移至无菌的 500 mL 锥形瓶中。
- 加入 100 mL 细胞洗涤液混匀，分装为每管 15 mL 至无菌 15 mL 离心管中。储存于 -70 至 -80 °C，直至使用。
- 使用前通过 0.22-µm 滤膜过滤上述溶液，并在使用前至少 30 分钟预热至 37 °C。
- 准备凋亡诱导储备液：浓度为 3.3 µg/mL 的 TNFα 溶液。
- 在 TNFα 原装容器中加入 500 µL 经滤膜除菌的水，溶解 20 µg TNFα，混匀至完全溶解。
- 转移至 15 mL 无菌离心管中，加入 5.5 mL 无镁无钙 DP....
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结果
剂量-反应曲线（含对照）
图1 显示了发光反应与单克隆抗体（mAb）浓度之间的关系。该S型曲线反映了由于细胞裂解导致的检测培养基中caspase 3和caspase 7的释放。细胞死亡因血清饥饿联合TNFα信号诱导而增强。因此，抗TNFα分子（mAb）与细胞因子结合，通过空间位阻抑制其与TNF细胞受体的相互作用，从而在较高mAb浓度下促进细胞存活。
本方法中使用的对照包括：仅含检测培养基的细胞、含TNFα和检测培养基的细胞，以及仅含检测培养基的对照组。在FBS饥饿条件下，仅含检测培养基的细胞未发生凋亡，因而产生发光信号。此外，仅暴露于TNFα但培养于培养基中的细胞确实存活。
另一个重要的对照是仅含检测用培养基的样本。该对照有助于.......
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讨论
该表征有助于确定 先验的 在开展成本高昂且耗时的临床试验之前，该方法可用于评估一种在研分子的生物学行为。同时，它也适用于已获批药品的批间放行检测。值得指出的是，这类检测可用于判断分子是否具有与其作用机制相符的充分生物学效应。本教程所介绍的生物分析方法对于不同抗TNFα分子之间的比较具有至关重要的意义。尽管存在常规的理化检测方法，但该方法能够通过生物学手段测定药物的效价与效力，作为其质量属性，从而全面、完整地反映效应功能的真实意义。
通常，细胞对 TNFα 诱导凋亡的反应性检测对研究人员而言可能具有挑战性。在标准化该生物学方法之前，可通过表征日常使用的细胞库来进行故障排查。一个例子是细胞系在一定时间范围内的细胞反应变异性，这与细胞系的老化相关。12该问题可通过使用在 -80 °C 冻存的主细胞库来消除。工作细胞库的规模必须足以满足由 R 开展的一项 DOE 研究的需求&D 或一年期限内用于质量控制实验室。此外，在本方案的任何步骤中将溶液加入细胞之前，均可使用温度稳定的溶液来固定这种响应性。在进行中和试验.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）资助，项目编号为PEI CONACYT 2015 220333，但该机构未参与研究设计。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | 来自小鼠（Mus musculus）的纤维肉瘤细胞 |
| RPMI-1640 培养基 | ATCC | 30-2001 | 将培养基储存于 2 °C 至 8 °C |
| 无酚红 RPMI 1640 培养基 | GIBCO | 11835-030 | 将培养基储存于 2 °C 至 8 °C |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | GIBCO | 25200-056 | 将试剂储存于 -10 °C 至 -20 °C |
| 不含钙、镁的 DPBS | GIBCO | 14190-136 | 将培养基储存于 2 °C 至 8 °C |
| 重组人 TNF-α 蛋白 | R&D Systems | 210-TA-020 | 储存于 -20 °C 至 -70 °C |
| 胎牛血清（美国来源），超低 IgG | HyClone | SH3089803 | 储存于 -10 °C 至 -20 °C |
| 胎牛血清（美国来源），经鉴定 | HyClone | SH3007103 | 储存于 -10 °C 至 -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒 | Promega | G8093 | 将 Caspase-Glo 3/7 底物和 Caspase-Glo 3/7 缓冲液于 –20 ºC 避光保存 |
| EDTA 二钠盐二水合物，晶体，ACS 级试剂 | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| 待测单克隆抗体阿达木单抗 | Probiomed | NA | 在微孔板中的终浓度为： 0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 μg/mL |
| 参比和对照单克隆抗体阿达木单抗 | Abbvie | NA | 在微孔板中的终浓度为： 0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 μg/mL |
| 酶标仪 | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 多功能酶标仪 |
| 酶标仪软件 | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| 培养箱 | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB 强制通风 CO2 培养箱 |
| 超净工作台 | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | 高效，II 级 A2 型 |
参考文献
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al.
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