减数分裂是一种发育过程，通过一轮DNA复制和两轮染色体分离，形成配子。可通过制备减数分裂染色体铺展的技术来研究哺乳动物的减数分裂。本文演示了一种从小鼠精母细胞制备表面铺展细胞核的方法。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物的减数分裂是一种发生在生殖细胞中的动态发育过程，可被研究和表征。我们采用一种将细胞核铺展在载玻片表面（而非从高处滴落）的方法，展示了一种于1997年首次报道的、针对小鼠精母细胞的优化技术。该方法在实验室中被广泛用于研究哺乳动物减数分裂，因其可获得大量处于减数第一次分裂前期各亚阶段的高质量细胞核。首先将曲细精管置于低渗溶液中，使精母细胞膨胀；随后将精母细胞释放至蔗糖溶液中形成细胞悬液，并将细胞核铺展在浸有固定液的玻璃载片上。经过免疫染色后，可检测多种与减数分裂过程相关的蛋白质。例如，联会复合体的蛋白质——一种将同源染色体的染色体轴/核心连接在一起的三部分结构——可被清晰地观察到。参与通过同源重组修复DNA双链断裂的减数分裂重组蛋白，也可通过免疫染色来评估减数第一次分裂前期的进程。本文中，我们详细描述并演示了这一广泛用于研究幼年或成年雄性小鼠精母细胞中哺乳动物减数分裂的技术。
引言
小鼠被广泛用作研究哺乳动物减数分裂的模式生物。可以评估减数分裂过程中正常的发育事件以及发生的缺陷。在野生型和突变型小鼠中，均可对减数分裂前期I及其亚阶段的关键事件的时间进程和动态变化，以及参与减数分裂调控关键过程的多种特定蛋白质进行表征。减数分裂I期间发生的若干特殊过程可被深入研究（详见Handel和Schimenti1的综述），包括DNA双链断裂（DSB）的形成与修复、重组、联会复合体的形成以及染色体分离。
研究减数分裂过程的一个重要方面是能够观察细胞核，其中同源染色体在视觉和光学上可被清晰分辨，从而更准确地区分和鉴定前期 I 的各个亚阶段。前期 I 包含 5 个亚阶段，其特征是具有特定的结构，包括联会复合体（SC）的形成。联会复合体是一种三部分组成的蛋白质支架结构，可促进同源染色体的配对以及 DNA 双链断裂的修复。在细线期，随着联会复合体轴向元件的组装，同源染色体开始排列。随后，在偶线期，中央元件与联会复合体连接，促进同源染色体之间的配对和物理连接（即联会）。在粗线期，同源染色体的联会完成，并通过同源重组修复部分选定的 DNA 双链断裂，从而形成 DNA 交叉。在双线期，联会复合体解体，使同源染色体去联会，但仍通过着丝粒和 DNA 交叉位点保持连接。最后，在终变期，同源染色体重新凝缩，细胞进入向中期转变的阶段1。
传统上，减数分裂染色质的表面铺展技术所获得的细胞核数量很少，尤其是来自前期 I 早期阶段的细胞核2。因此，该方法经过改进，以提高从组织（如睾丸或卵巢）中分离细胞的效率、优化减数分裂染色质的铺展技术，并增加可用于评估的高质量减数分裂细胞核的产量2,3,4。此外，已有研究通过免疫定位技术证明，该方法在保存减数分裂细胞核中的核结构及染色质结合蛋白方面具有良好的效果5,6,7。因此，本实验所展示的、最初由 Peters 描述的方法2，能够获得大量独立的破裂精母细胞核，其中包含处于前期 I 各亚阶段——细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期——的同源染色体。
制备表面铺展细胞核（也称为染色质铺展分析）的技术在生殖生物学和细胞生物学领域被广泛用于研究减数分裂。含有表面铺展细胞核的载玻片可随后用针对目标蛋白的抗体进行免疫染色，或进行银染，再通过显微镜进行分析。该方法在雄性和雌性小鼠中基本相似，尽管已有针对雌性小鼠的改良方案被报道2。制备过程中切忌过度剪碎曲细精管。细胞核必须充分铺展开，以便在免疫染色后通过显微镜清晰观察同源染色体及其相关蛋白。表面铺展细胞核的制备仅需数小时，可立即进行免疫染色，或在-80 °C保存最多3周后再解冻并进行免疫染色。然而，对于某些蛋白而言，若在制备表面铺展细胞核后立即或两周内进行免疫染色，效果最佳。载玻片可采用标准流程进行免疫染色：先使用针对目标蛋白的抗体孵育，再与荧光蛋白或荧光染料标记的二抗孵育，最后通过荧光显微镜成像8。在出生后第15至21天，每对野生型睾丸组织足以制备6至10张载玻片，而更年长的小鼠（包括成年鼠）可获得更多的载玻片。然而，6周龄及以上的野生型小鼠在免疫染色后的载玻片上会含有更多的减数分裂后细胞（即精子细胞）。此外，在幼年和成年小鼠中均可观察到前期I的各个亚阶段。出生后第10至15天雄性小鼠的睾丸组织可获得大量细线期和偶线期细胞，而出生后第14至15天以上的小鼠则会产生更多的粗线期和双线期细胞核。
本文介绍并演示了一种广泛使用的小鼠精母细胞表面铺展细胞核的制备方法。
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方案
所有涉及小鼠的实验方法均遵循高标准的伦理和福利规范，并已获得费城德雷塞尔大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 所需溶液和仪器的准备
- 在50 mL超纯实验室级水中配制低渗提取缓冲液（HEB），pH值为8.2–8.4（见表1）。每次实验前新鲜配制，置于冰上保存，并在制片后2小时内使用；这是为了优化DTT的还原活性和PMSF的蛋白酶抑制活性。每对小鼠睾丸使用10 mL HEB。
- 通过将0.342 g蔗糖加入10 mL超纯实验室级水中，新鲜配制100 mM蔗糖溶液。调节pH至8.2。
- 每月新鲜配制固定液（1%多聚甲醛（PFA）、0.15% Triton X-100，用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至9.2），于室温避光保存。将市售的16% PFA原液用1×PBS稀释至4%，作为工作储备液，然后将4% PFA分装后储存于-20 °C。
- 配制固定液时，将10 mL 4% PFA溶液和600 µL 10% Triton X-100加入30 mL 1×PBS中，充分混匀，并用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至9.2。将固定液储存于50 mL锥形管中，用铝箔包裹，于室温保存（不超过4周）。
- 在载玻片最后干燥的30分钟内，配制洗涤液：含0.4% Photo-Flo 200的PBS溶液（80 mL 1×PBS中加入320 µL Photo-Flo 200）和含0.4% Photo-Flo 200的dH2O溶液（40 mL超纯实验室级水中加入160 µL Photo-Flo 200）。使用装有40 mL溶液的50 mL Coplin染色缸，每次清洗10张或更少的载玻片。
- 准备以下仪器：手术剪刀1把（用于切开皮肤），精细尖头手术剪刀1把（用于切开腹膜），直头精细镊子2把（用于分离每侧睾丸），直边剃须刀片1片（用于切开每侧睾丸），弯头镊子2把（用于固定睾丸并挤出曲细精管），50 mL Coplin染色缸，聚四氟乙烯涂层三环载玻片，带11号刀片的手术刀1把，湿盒，100 mm × 15 mm培养皿，精细永久性记号笔或铅笔，以及平台式旋转摇床。
- 将优质未带电、预清洁、磨砂端玻璃载玻片直立放置于装有固定液的50 mL Coplin染色缸中，直至使用。
注意：若载玻片后续将用于需要乙醇处理的实验步骤（如荧光in situ杂交），建议使用铅笔标记。
- 将优质未带电、预清洁、磨砂端玻璃载玻片直立放置于装有固定液的50 mL Coplin染色缸中，直至使用。
2. 精母细胞核铺展
- 根据机构指南对雄性小鼠实施安乐死（例如，采用颈椎脱位法，可单独使用或联合 CO2 窒息法）。
- 使用 P10–P20 阶段的雄性小鼠评估第一次精子发生波中的减数分裂细胞；我们常规使用 P15–P17 阶段的雄性小鼠以获取减数分裂前期 I 所有亚阶段的细胞。成年睾丸也可提供前期 I 的细胞，但同时会含有更多减数分裂后的细胞，例如精子细胞。
- 取出并称量睾丸（记录双侧睾丸总重量）；随后将其放入含有少量冷 HEB 液体的培养皿中以保持湿润。
- 用弯头镊子将睾丸固定在培养皿底部，使用直边剃刀刀片在睾丸被膜上做一个小的垂直正中切口。在用一把镊子继续将睾丸压在培养皿底部的同时，用另一把弯头镊子或直边剃刀刀片轻轻挤压睾丸，使生精小管被挤出。
- 将挤出的生精小管放入含有 10 mL 冷 HEB 的 15 mL 锥形管中，注意避免将被膜碎片带入管中。对另一侧睾丸重复上述步骤。
- 将去被膜的生精小管置于含有 HEB 的锥形管中，在冰上孵育 30–60 分钟，具体时间取决于睾丸大小。对于双侧睾丸总重 ≤30 mg 的样本，孵育 30 分钟；总重 31–50 mg 的样本，孵育 30–45 分钟；更大样本则孵育 60 分钟。单侧睾丸的孵育时间不得调整。
注意：最佳孵育时间可能因实验人员经验、所用试剂及分析的小鼠品系而异。 - 在生精小管于 HEB 中孵育期间，使用记号笔或铅笔在预清洁载玻片的磨砂端标记小鼠编号、载玻片编号和日期。随后将预清洁的载玻片放入盛有固定液的 Coplin 染色缸中。
- 孵育结束后，将生精小管和 HEB 倒入洁净的培养皿中，将小管分离成直径约 3 mm 的团块。每个团块可制备 2 张载玻片，总载玻片数量取决于睾丸大小。
注意：我们通常从野生型小鼠获得 8 张载玻片，从亚生育力的 Chtf18 基因敲除 P16 小鼠（因减数分裂和有丝分裂生殖细胞数量减少导致睾丸较小）获得 6 张载玻片8。一个重量 ≥100 mg 的成年睾丸预计可制备 16 张载玻片。 - 在特氟龙涂层的三环载玻片的一个环内加入 23 µL 的 100 mM 蔗糖溶液，并将一个生精小管团块放入该环中。 用弯头镊子固定团块，使用 11 号剃刀刀片轻轻剪切小管，直至溶液变浑浊。
注意：避免过度剪切，否则会导致染色体断裂。需注意，染色体断裂也可能提示突变表型。 - 去除碎片，再加入 23 µL 蔗糖溶液，使用移液器轻轻吹打混合液数次，以帮助悬浮液中的细胞充分分散。
- 从盛有固定液的 Coplin 染色缸中取出一张载玻片，倾斜载玻片使一滴较大的液体聚集在载玻片的一个底角处。
- 从特氟龙三环载玻片的一个环中吸取 20 µL 蔗糖细胞悬液，加入到优质磨砂玻璃载玻片上的固定液滴中，并吹打 2–3 次。
注意：固定液滴的体积应足够大，以便加入 20 μL 蔗糖细胞悬液后，在后续铺展时混合液可覆盖整个载玻片表面（见步骤 2.11）。
- 从特氟龙三环载玻片的一个环中吸取 20 µL 蔗糖细胞悬液，加入到优质磨砂玻璃载玻片上的固定液滴中，并吹打 2–3 次。
- 缓慢将载玻片向液滴相反方向倾斜，使细胞悬液沿载玻片长度方向铺展；然后缓慢将载玻片回倾，使悬液沿宽度方向铺展，以完全覆盖载玻片。避免在同一区域反复铺展，否则会导致细胞重叠。
- 立即将载玻片平放于加湿密闭容器中，并重复步骤 2.8 至 2.11，直至所有生精小管团块均用于制片。在干燥过程中切勿移动加湿容器，以免造成细胞撕裂或重叠。
- 将载玻片置于加盖的加湿密闭容器中，室温孵育 2.5 小时，使其缓慢且不完全干燥。此步骤中高湿度和缓慢干燥对染色质的良好铺展至关重要。随后移去容器盖，再让载玻片在空气中完全干燥 30 分钟。
- 将载玻片（背对背或锯齿状排列）放入盛有 0.4% Photo-Flo 200/1X PBS 溶液的 Coplin 染色缸中，于旋转摇床上轻轻振荡，每次 5 分钟，共洗涤两次。每次洗涤使用新鲜溶液，并将不同小鼠的载玻片分开放置在不同的染色缸中。
- 将载玻片放入盛有 0.4% Photo-Flo 200/dH2O 溶液的 Coplin 染色缸中，振荡洗涤一次，每次 5 分钟。
- 从 Coplin 染色缸（最后一次洗涤）中取出载玻片，小心擦拭载玻片边缘和底部以去除多余液体，并将载玻片以倾斜、近乎直立的位置放置晾干。熟练掌握该技术的实验人员可在一天内处理并制备 4 至 5 只小鼠的表面铺展细胞核样本。
- 干燥后（15–20 分钟），应立即进行免疫荧光染色，或在避光、密封的载玻片盒中于 -80 °C 保存，最长不超过 3 周（具体时间取决于目标蛋白；若在当天或两周内染色，通常可获得最佳结果）。
- 若在 -80 °C 保存，则需先将载玻片恢复至室温，再于盛有 1X PBS 或封闭液的 Coplin 染色缸中洗涤 5 分钟，然后进行染色。
注意：多种不同的免疫荧光染色方案均可获得良好结果；可参考 Berkowitz 等人提供的免疫染色方案8。
- 若在 -80 °C 保存，则需先将载玻片恢复至室温，再于盛有 1X PBS 或封闭液的 Coplin 染色缸中洗涤 5 分钟，然后进行染色。
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结果
该方法能够获得大量包含完整同源染色体的表面铺展细胞核，其效果主要取决于三个因素：1）生精小管在低渗缓冲液（即 HEB）中孵育的时间需适当，以使初级精母细胞核充分膨胀，从而在破裂后仍保持完整，避免因 HEB 中孵育时间过长导致细胞核解体；2）使用微量移液器吸取蔗糖液滴中的细胞，获得分散的细胞核悬液，避免细胞核成团聚集；3）将涂有固定液的载玻片每次仅朝一个方向倾斜，不可来回倾斜。制备完成后，可对表面铺展的细胞核使用荧光标记的抗体进行免疫染色，随后通过显微镜成像（代表性结果见图1和图2）。图1展示了野生型粗线期细胞核铺展良好的示例（A），因 HEB 孵育时间过长导致免疫染色不均、形态破碎的同源染色体（B），铺展不佳且相互重叠的细胞核（C），以及因生精小管“过度剪切”导致同源染色体断裂的细胞核（D）。当技术操作得当时，可获得大量代表减数第一次分裂前期主要5个亚阶段的细胞核。
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讨论
为了获得数量多、铺展良好且质量高的精母细胞核，本实验方案中最关键的步骤包括：曲细精管在HEB缓冲液中的适宜孵育时间、曲细精管的适当剪碎，以及将蔗糖细胞悬液在固定剂包被的载玻片上进行铺展的技术。我们对出生后15天至成年期的野生型雄性小鼠睾丸中的曲细精管，在HEB缓冲液中孵育45分钟；而年龄相当的Chtf18基因敲除小鼠的睾丸由于体积仅为一半且生精细胞数量显著较少，仅需孵育30分钟8。根据我们的经验，若将Chtf18基因敲除小鼠的睾丸孵育超过30分钟，会破坏细胞完整性，导致同源染色体解析不清。曲细精管只需剪碎至形成浑浊的蔗糖细胞悬液即可，且在铺片前每张载玻片上必须预先滴加足量的固定剂（见步骤2.10）。载玻片应每次仅朝一个方向倾斜，不可来回倾斜。该方法非常适合研究减数第一次分裂，但主要局限于前期I的各个亚阶段。然而，已有报道可观察到处于减数分裂前S期、第一次及第二次分裂中期的细胞核7,9。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Abigail Harris提供的技术支持。同时感谢Paula Cohen和Kim Holloway在优化从小鼠精母细胞制备铺展核的实验方案方面给予的帮助。作者还感谢Karen Schindler对稿件提出的宝贵修改意见。
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM106262 项目资助，授予 K.M.B.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% 多聚甲醛（甲醛水溶液） | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | 用 1× PBS 将 16% 溶液稀释为 4% 工作液，并分装后于 -20 °C 冻存 |
| 聚四氟乙烯包被的三环载玻片 | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| 优质非带电磨砂端玻璃载玻片 | 多个商业品牌 | 使用乙醇或异丙醇清洗载玻片，滴干晾干后再使用；根据后续实验需要，用永久性记号笔或铅笔在磨砂端标记载玻片 | |
| 手术剪（尖头和钝头） | Fine Science Tools | 14001-12 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 细尖手术剪（尖头） | Fine Science Tools | 14058-11 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 直头细尖镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 弯头中号尖镊子 | Fisher | 16100110 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 小鼠抗 SYCP3 抗体 | Abcam | ab97672 | 使用稀释比例为 1:300 |
| 抗着丝粒蛋白抗体（来源于人类 CREST 患者血清） | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | 使用稀释比例为 1:50 |
| 湿盒 | 我们使用 Nunc 方形培养皿（500 cm²/孔），内放湿润的纸巾以维持湿度 | ||
| 配备落射荧光装置的宽场显微镜 | Leica Microsystems | 任何标准型号均可 | |
| 柯林斯染色缸（Coplin jars） | 多个商业品牌 | 容量 50 ml；直径 40 mm（1.6 英寸），可容纳 10 张载玻片（背对背放置） | |
| 培养皿 | 多个商业品牌 | 直径 100 × 15 mm，未处理无菌聚苯乙烯材质 |
参考文献
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- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
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