减数分裂是一种发育过程，通过一轮DNA复制和两轮染色体分离，形成配子。可通过制备减数分裂染色体铺展的技术来研究哺乳动物的减数分裂。本文演示了一种从小鼠精母细胞制备表面铺展细胞核的方法。
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摘要
摘要
哺乳动物的减数分裂是一种发生在生殖细胞中的动态发育过程，可被研究和表征。我们采用一种将细胞核铺展在载玻片表面（而非从高处滴落）的方法，展示了一种于1997年首次报道的、针对小鼠精母细胞的优化技术。该方法在实验室中被广泛用于研究哺乳动物减数分裂，因其可获得大量处于减数第一次分裂前期各亚阶段的高质量细胞核。首先将曲细精管置于低渗溶液中，使精母细胞膨胀；随后将精母细胞释放至蔗糖溶液中形成细胞悬液，并将细胞核铺展在浸有固定液的玻璃载片上。经过免疫染色后，可检测多种与减数分裂过程相关的蛋白质。例如，联会复合体的蛋白质——一种将同源染色体的染色体轴/核心连接在一起的三部分结构——可被清晰地观察到。参与通过同源重组修复DNA双链断裂的减数分裂重组蛋白，也可通过免疫染色来评估减数第一次分裂前期的进程。本文中，我们详细描述并演示了这一广泛用于研究幼年或成年雄性小鼠精母细胞中哺乳动物减数分裂的技术。
引言
小鼠被广泛用作研究哺乳动物减数分裂的模式生物。可以评估减数分裂过程中正常的发育事件以及发生的缺陷。在野生型和突变型小鼠中，均可对减数分裂前期I及其亚阶段的关键事件的时间进程和动态变化，以及参与减数分裂调控关键过程的多种特定蛋白质进行表征。减数分裂I期间发生的若干特殊过程可被深入研究（详见Handel和Schimenti1的综述），包括DNA双链断裂（DSB）的形成与修复、重组、联会复合体的形成以及染色体分离。
研究减数分裂过程的一个重要方面是能够观察细胞核，其中同源染色体在视觉和光学上可被清晰分辨，从而更准确地区分和鉴定前期 I 的各个亚阶段。前期 I 包含 5 个亚阶段，其特征是具有特定的结构，包括联会复合体（SC）的形成。联会复合体是一种三部分组成的蛋白质支架结构，可促进同源染色体的配对以及 DNA 双链断裂的修复。在细线期，随着联会复合体轴向元件的组装，同源染色体开始排列。随后，在偶线期，中央元件与联会复合体连接，促进同源染色体之间的配对和物理连接（即联会）。在粗线期，同源染色体的联会完成，并通过同源重组修复部分选定的 DNA 双链断裂，从而形成 DNA 交叉。在双线期，联会复合体解体，使同源染色体去联会，但仍通过着丝粒和 DNA 交叉位点保持连接。最后，在终变期，同源染色体重新凝缩，细胞进入向中期转变的阶段1。
传统上....
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方案
所有涉及小鼠的实验方法均遵循高标准的伦理和福利规范，并已获得费城德雷塞尔大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 所需溶液和仪器的准备
- 在50 mL超纯实验室级水中配制低渗提取缓冲液（HEB），pH值为8.2–8.4（见表1）。每次实验前新鲜配制，置于冰上保存，并在制片后2小时内使用；这是为了优化DTT的还原活性和PMSF的蛋白酶抑制活性。每对小鼠睾丸使用10 mL HEB。
- 通过将0.342 g蔗糖加入10 mL超纯实验室级水中，新鲜配制100 mM蔗糖溶液。调节pH至8.2。
- 每月新鲜配制固定液（1%多聚甲醛（PFA）、0.15% Triton X-100，用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至9.2），于室温避光保存。将市售的16% PFA原液用1×PBS稀释至4%，作为工作储备液，然后将4% PFA分装后储存于-20 °C。
- 配制固定液时，将10 mL 4% PFA溶液和600 µL 10% Triton X-100加入30 mL 1×PBS中，充分混匀，并用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至9.2。将固定液储存于50 mL锥形管中，用铝箔包裹，于室温保存（不超过4周）。
- 在载玻片最后干燥的30分钟内，配制洗涤液：含0.4% Photo-Flo 200的PBS溶液（80 mL 1×PBS中加入320 µL Pho....
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结果
该方法能够获得大量包含完整同源染色体的表面铺展细胞核，其效果主要取决于三个因素：1）生精小管在低渗缓冲液（即 HEB）中孵育的时间需适当，以使初级精母细胞核充分膨胀，从而在破裂后仍保持完整，避免因 HEB 中孵育时间过长导致细胞核解体；2）使用微量移液器吸取蔗糖液滴中的细胞，获得分散的细胞核悬液，避免细胞核成团聚集；3）将涂有固定液的载玻片每次仅朝一个方向倾斜，不可来回倾斜。制备完成后，可对表面铺展的细胞核使用荧光标记的抗体进行免疫染色，随后通过显微镜成像（代表性结果见图1和图2）。图1展示了野生型粗线期细胞核铺展良好的示例（A），因 HEB 孵育时间过长导致免疫染色不均、形态破碎的同源染色体（B），铺展不佳且相互重叠的细胞核（C），以及因生精小管“过度剪切”导致同源染色体断裂的细胞核（D）。当技术操作得当时，可获得大量代表减数第一次分裂前期主要5个亚阶段的细胞核。
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讨论
为了获得数量多、铺展良好且质量高的精母细胞核，本实验方案中最关键的步骤包括：曲细精管在HEB缓冲液中的适宜孵育时间、曲细精管的适当剪碎，以及将蔗糖细胞悬液在固定剂包被的载玻片上进行铺展的技术。我们对出生后15天至成年期的野生型雄性小鼠睾丸中的曲细精管，在HEB缓冲液中孵育45分钟；而年龄相当的Chtf18基因敲除小鼠的睾丸由于体积仅为一半且生精细胞数量显著较少，仅需孵育30分钟8。根据我们的经验，若将Chtf18基因敲除小鼠的睾丸孵育超过30分钟，会破坏细胞完整性，导致同源染色体解析不清。曲细精管只需剪碎至形成浑浊的蔗糖细胞悬液即可，且在铺片前每张载玻片上必须预先滴加足量的固定剂（见步骤2.10）。载玻片应每次仅朝一个方向倾斜，不可来回倾斜。该方法非常适合研究减数第一次分裂，但主要局限于前期I的各个亚阶段。然而，已有报道可观察到处于减数分裂前S期、第一次及第二次分裂中期的细胞核7,9。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Abigail Harris提供的技术支持。同时感谢Paula Cohen和Kim Holloway在优化从小鼠精母细胞制备铺展核的实验方案方面给予的帮助。作者还感谢Karen Schindler对稿件提出的宝贵修改意见。
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM106262 项目资助，授予 K.M.B.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% 多聚甲醛（甲醛水溶液） | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | 用 1× PBS 将 16% 溶液稀释为 4% 工作液，并分装后于 -20 °C 冻存 |
| 聚四氟乙烯包被的三环载玻片 | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| 优质非带电磨砂端玻璃载玻片 | 多个商业品牌 | 使用乙醇或异丙醇清洗载玻片，滴干晾干后再使用；根据后续实验需要，用永久性记号笔或铅笔在磨砂端标记载玻片 | |
| 手术剪（尖头和钝头） | Fine Science Tools | 14001-12 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 细尖手术剪（尖头） | Fine Science Tools | 14058-11 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 直头细尖镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 弯头中号尖镊子 | Fisher | 16100110 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | 类似类型的其他品牌亦可使用 |
| 小鼠抗 SYCP3 抗体 | Abcam | ab97672 | 使用稀释比例为 1:300 |
| 抗着丝粒蛋白抗体（来源于人类 CREST 患者血清） | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | 使用稀释比例为 1:50 |
| 湿盒 | 我们使用 Nunc 方形培养皿（500 cm²/孔），内放湿润的纸巾以维持湿度 | ||
| 配备落射荧光装置的宽场显微镜 | Leica Microsystems | 任何标准型号均可 | |
| 柯林斯染色缸（Coplin jars） | 多个商业品牌 | 容量 50 ml；直径 40 mm（1.6 英寸），可容纳 10 张载玻片（背对背放置） | |
| 培养皿 | 多个商业品牌 | 直径 100 × 15 mm，未处理无菌聚苯乙烯材质 |
参考文献
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
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重印与许可
