稀有抗原特异性B细胞的检测与富集用于表型和功能分析

摘要

本文介绍了一种简单而有效的方法，该方法利用磁性纳米颗粒来检测并富集抗原反应性B细胞，以进行功能和表型分析。

摘要

与特定抗原反应的B细胞通常出现的频率为 <淋巴细胞中占比0.05%。数十年来，研究人员一直致力于开发分离和富集这些稀有细胞的方法，以研究其表型与生物学特性。这些方法不可避免地基于以下原理：B细胞通过其细胞表面受体识别天然抗原，而这些受体的特异性与它们分化后子代细胞最终分泌的抗体特异性一致。解决该问题最直观的方法可能是使用荧光染料标记的抗原，并结合荧光激活细胞分选技术（FACS）。然而，这些方法的应用受限于细胞频率以及电子分选所能达到的分析和分离效率。本文描述了一种利用磁性纳米颗粒富集稀有抗原特异性B细胞的新方法，该方法可从大量起始细胞群体中高效富集抗原反应性B细胞。该技术使得在抗原反应性细胞分化前后对其表型和生物学特性进行更优监测成为可能。 体内 抗原接触，例如在免疫接种后或自身免疫疾病发展过程中。

引言

抗体分泌细胞前体频率的有限稀释分析表明，在正常B细胞库中，针对特定抗原的B细胞通常出现的频率为0.05%至0.005%，具体数值取决于疫苗接种状态以及抗原上存在的表位大小和数量。由于这些细胞频率极低，研究其在免疫应答发展过程中（如接种疫苗或接触外来抗原后）或自身免疫疾病发展期间的状态变化十分困难。以往，研究人员采用多种技术分离抗原反应性B细胞，包括抗原包被的培养板或层析柱吸附剂、抗原包被红细胞复位法以及荧光激活细胞分选技术^1,2,3,4,5,6。尽管这些技术已成功用于识别和分离抗原反应性B细胞，但在得率、纯度和可扩展性方面结果差异较大。最近，我们开发了一种利用磁性纳米颗粒检测并富集稀有B淋巴细胞亚群的新方法。该方法能够从大量起始细胞群体中以相对较高的得率和纯度实现富集，并适用于对抗原应答的分析。通过从悬浮细胞群体中进行富集，该方法消除了抗原包被板或层析柱几何结构所带来的限制，从而提高了通量。此外，由于富集后的细胞仍与抗原及荧光报告分子结合，可进一步通过FACS分选实现更高纯度的分离。本文所述方法已用于研究人受试者在免疫接种前后外周血中破伤风类毒素反应性B细胞，以及来自多种自身免疫性疾病（包括1型糖尿病、格雷夫斯病和桥本氏病）患者体内自身抗原反应性B细胞⁷。该方法在小鼠和人类中均具有良好效果，并适用于从多种组织来源中分析抗原反应性B细胞（相关论文正在撰写中）。

在基本操作流程中，首先将外周血单个核细胞与生物素标记的抗原以及用于表型分析的细胞表面抗原抗体共同孵育。该标记步骤之后为洗涤和固定，并加入偶联远红荧光染料的链霉亲和素，以检测结合生物素化抗原的细胞（图1）。以往研究曾采用直接与荧光染料偶联的抗原，以类似方式鉴定抗原特异性B细胞^8,9,10,11。尽管这是一种有效的方法，但使用生物素化抗原联合链霉亲和素可实现更强的信号放大（从而更清晰地区分结合与非结合细胞），尤其适用于较小的抗原^12,13,14。另一个考虑因素是选择链霉亲和素而非亲和素，因为链霉亲和素经过去糖基化处理，可减少非特异性结合。此外，我们选用远红荧光染料作为荧光素，因其具有良好的光稳定性、较高的量子产率（亮度）以及较小的分子尺寸（约1.3 kD）。相比之下，蛋白类荧光素如藻红蛋白（约250 kD）和别藻蓝蛋白（约105 kD）¹⁵并非理想选择，因其可能含有多个抗原表位。使用仅含单一表位的小分子有机荧光染料（如远红荧光染料），可降低所分离细胞群体的复杂性。

细胞在吸附生物素化抗原和远红外荧光染料标记的链霉亲和素后，使用与远红外荧光染料偶联的磁性纳米颗粒进行富集。大多数流式细胞仪无法检测单个纳米颗粒，因此在进行FACS分选及后续实验前无需去除这些颗粒¹⁶。通过磁性筛选富集抗原特异性B细胞，可提高目标细胞群体的比例，避免使用流式细胞仪分选稀有事件所需的时间和成本。

以下展示了从一名受试者在破伤风类毒素加强免疫前后（免疫前及免疫后七天）富集破伤风类毒素特异性B细胞的代表性结果。我们选择这一特定应用作为示例，以展示该方法在急性免疫反应后富集抗原特异性B细胞的能力。 体内 刺激。当与流式细胞术联用时，该方法能够富集并区分抗原特异性的初始B细胞、记忆B细胞和浆母细胞，使研究者能够追踪这些细胞频率随时间的变化。此外，我们还提供了另一种可能的下游检测方法， 例如 ELISPOT 实验表明，细胞在富集后仍保留分泌抗体的能力。该方法的另一种应用可能涉及将富集后的细胞过继转移至宿主体内。我们先前已证实，细胞在分离和转移后仍能作为抗原呈递细胞激活抗原特异性T细胞（数据未显示）。因此，该方法可与多种下游实验联用，共同促进对抗原特异性免疫应答的理解。下文详细描述了该方法，包括用于评估总体得率、纯度、细胞特异性和富集倍数的对照设置。

方案

1. 人外周血单个核细胞的分离

1. 使用肝素抗凝采血管采集 30–50 ml 血液。
   注意：所用血液量取决于具体的实验问题以及目标抗原特异性 B 细胞在血液中的频率。肝素抗凝血可立即处理，也可在室温下轻轻摇动过夜，次日进行处理。延迟处理对富集效率影响极小，且细胞活力损失可忽略不计。
2. 将全血与无镁、无钙的磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 比例混合，PBS 需为无菌、室温状态。
3. 在 50 ml 无菌锥形管中加入 10 ml 室温密度梯度溶液。已开封的密度梯度液瓶应避光保存于 4 °C，使用前需恢复至室温。
4. 如有可能，将移液器调至慢速模式和/或施加轻微但稳定的按压力，缓慢将 30–35 ml 稀释后的血液叠加于密度梯度液上方，注意避免混合两层液体。
   注意：添加稀释血液时，将移液器吸头紧贴 50 ml 锥形管管壁，有助于保持稳定、连续的液流。
5. 在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 30 分钟，离心时关闭刹车。
6. 小心移除上层液体（含血浆和血小板），注意不要扰动下方的单个核细胞层。
7. 使用无菌移液器收集单个核细胞层（即血沉棕黄层，buffy coat），转移至另一无菌 50 ml 锥形管中。
8. 加入 PBS 至细胞悬液终体积为 50 ml。在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟，开启刹车。
9. 弃去上清液，将沉淀细胞重悬于 10 ml PBS 中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数并测定细胞活力。
10. 将细胞重悬至浓度为 10⁷ 个细胞/ml，并置于冰上保存，待后续实验使用。

2. 细胞染色

1. 去除 1-2 x 10⁶ 如适用，为每个荧光补偿/FMO对照准备相应细胞。其余细胞在4 °C条件下以400 × g离心10分钟，使用刹车。
2. 在无菌过滤的冷FACS缓冲液（PBS + 1% 牛血清白蛋白（BSA）+ 0.01% 叠氮化钠）中重悬细胞，细胞浓度为3–6 × 10⁶ 个/mL⁷ 细胞/毫升（在1.5 ml离心管中去除）。确保FACS缓冲液为预冷状态，并在整个染色过程中置于冰上。
   1. 优化检测时，将细胞群体均分为四部分（A-D）。使用A部分富集目标抗原特异性B细胞，使用B和C部分确定富集/染色的特异性（见下文2.5和2.6），使用D部分测定未富集群体中抗原特异性细胞的频率和数量，以用于计算得率和富集倍数。
3. 在冰上向组分A-D中加入人FcγR阻断试剂，以防止抗体与Fc受体结合。
   注意：请遵循制造商提供的说明，以确定合适的条件。
4. 向A-D组分中的目标细胞表面抗原加入荧光染料偶联抗体，在冰上避光孵育30分钟，注意避免使用可能与偶联在磁性纳米颗粒上的远红荧光染料抗体发生交叉反应的荧光染料。
   注意：这些包括与近红外荧光染料 Cy5、Cy5.5 和 Cy7 偶联的抗体。所添加的任何活细胞染色剂应与固定剂的使用相容。如果无需通过 FACS 分析细胞，而是通过 ELISPOT 等方法测定抗体分泌频率，则无需进行抗体表面染色。
5. 为检测该检测方法的特异性，将Fraction B与足量未标记抗原在冰上孵育30分钟，使大多数亲和力至少为10的受体被充分结合^-6 M 被阻断。
   注意：通常，一个合适的起始浓度是下文2.6中认为足够的抗原量的50至100倍例如 50–100 µM）。这将阻断高亲和力B细胞与未标记抗原的结合，从而防止其与后续2.6步骤中加入的生物素化抗原结合，以确认富集细胞的特异性。此步骤可与上述2.4步骤同时进行。
6. 向A、B和D组分中加入生物素标记的抗原，冰上孵育30分钟。
   注意：应通过滴定确定生物素化抗原的浓度，以明确实现特异性结合细胞与非特异性旁观细胞充分检测和分离所需的最适用量。通常可测试的起始浓度为1-5 µM。
   注意：对于A部分和D部分，此步骤可与上述2.4步骤同时进行。对于B部分，此步骤应在2.5步骤之后进行（步骤之间无需洗涤）。
7. 省略 Fraction C 中的生物素化抗原，以确定 B 细胞是否与方案中的其他试剂（如链霉亲和素-远红荧光染料和磁珠）发生非特异性结合。
8. 用 1 ml 冷 FACS 缓冲液重悬细胞，每 5 x 10⁶ 个细胞洗涤两次⁷ 细胞并在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。
9. 最后一次洗涤后，将浓缩的细胞悬液用1 ml 2%甲醛稀释，每5 × 10⁷ 细胞并在冰上避光静置5分钟。
   注意：此时对细胞进行固定，可确保在整个后续操作过程中，生物素标记的抗原仍与B细胞受体（BCR）结合。若需获得活细胞——用于后续分析，如ELISPOT或过继性转移实验，则省略固定步骤。
10. 用 1 ml 冷 FACS 缓冲液按每 5 x 10⁶ 个细胞洗两次⁷ 细胞，在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。每 5 × 10⁶ 个细胞用 1 ml 冷 FACS 缓冲液重悬⁷ 细胞
11. 加入 1–2 µg 链霉亲和素-远红荧光染料/ml，在冰上避光孵育 20 分钟。根据不同应用滴定链霉亲和素的用量。
12. 用 1 ml 冷 FACS 缓冲液按每 5 x 10⁷ 细胞在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。至此，D组分的制备已完成，因其将不使用磁珠进行富集。
    注意：该样本将用于确定样本中抗原特异性B细胞的频率和数量，进而评估富集后获得的得率和富集倍数。

3. 基于磁性纳米颗粒的富集

1. 每 5 × 10⁷ 个细胞用 1 ml 冷分离缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA）重悬 A–C 样本中的细胞，并通过 40 µm 滤膜过滤，以去除可能堵塞层析柱的细胞团块。
2. 加入抗 Cy5/远红荧光染料纳米颗粒。为获得最佳效果，每次使用时应滴定纳米颗粒的浓度，但可先以每 5 × 10⁷ 个细胞/ml 加入 50 µl 悬液作为合适的起始点。在 4 °C 避光旋转孵育 10 分钟。
3. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟，用 1 ml 冷分离缓冲液洗涤两次。每 5 × 10⁷ 个细胞用 1 ml 冷分离缓冲液重悬细胞。

4. 使用 LS 或 LD 柱进行磁性富集

1. 将三根 LS 或 LD 柱置于磁性分离器的磁场中，并加入 3 ml 分离缓冲液以润湿柱子（参见产品说明，以确定最适合的柱子类型）。让全部 3 ml 缓冲液流过柱子，收集后弃去。
   注意：尽管磁性纳米颗粒标记细胞的分离可使用任何市售的磁性分离装置完成，但本实验室在得率、纯度和富集效率方面发现使用 LS 柱效果最佳。
2. 在柱子下方放置三根已标记为 "Fraction A/(B)/(C) negative" 的 15 ml 圆锥形离心管，用于收集未被磁性保留的阴性选择细胞。将磁性颗粒标记的细胞加入相应的柱子中，并让全部体积流过柱子。
3. 在柱子上方加入 3 ml 冷的分离缓冲液，使其流过柱子，再重复加入 2 ml。收集阴性选择的细胞，并置于冰上备用。
4. 将柱子从磁场中取出，放置在标记为 "Fraction A/(B)/(C) positive" 的 15 ml 圆锥形离心管上方，用于收集阳性选择细胞。
5. 用约 6 ml 分离缓冲液加满柱子，立即使用提供的推杆将液体快速压过柱子，以收集原本结合在磁性柱上的细胞。
6. 为提高纯度，可使用第二根洁净的柱子重复上述步骤，对阳性选择的细胞进行进一步富集。
7. 将阴性和阳性选择的细胞组分均在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟，弃上清后重悬于所需终体积中。随后进行下游分析，如流式细胞术（FACS）、酶联免疫斑点（ELISPOT）或过继性细胞转移。

结果

使用流式细胞术分析纯度、得率和富集倍数

如上所述富集的细胞群体不可避免地含有未结合链霉亲和素-远红外荧光染料但被截留在基质中的污染细胞。这些杂质可通过流式细胞荧光分选（FACS）从富集的细胞群体中去除。为评估富集群体的纯度，可根据前向散射光和侧向散射光和/或活/死细胞染色对活细胞设门，并分析远红外荧光染料阳性细胞的频率。该设门内的百分比可反映纯度。对这些细胞的特异性和抗原亲和力进行进一步分析，需要对单个细胞进行流式细胞荧光分选，随后进行表达的免疫球蛋白基因的克隆与测序，以及重组抗体的表达与分析。

得率是指在A组分中回收的抗原结合性B细胞数量相对于起始群体中（D组分）的数量。由于D组分与A组分中的细胞数量相同，因此可直接计算得率（A组分中的抗原结合性B细胞数量 ÷ D组分中的抗原结合性B细胞数量）。

讨论

本文介绍一种从人外周血中分离和富集抗原结合性B细胞的新型方法。该方法可轻松适用于小鼠及其他组织（如脾脏和淋巴结），并可与富集后细胞表型和功能的分析相兼容（相关论文正在撰写中）。

操作者应意识到多个可能影响本实验成功率的变量。根据经验，死细胞 tends to stick to the magnetic beads 并"take up" 荧光染料（例如链霉亲和素-远红外荧光染料），导致非特异性的背景信号升高。在开始本实验前，尽可能去除样本中的死细胞至关重要。使用能够区分活细胞与死细胞的染料以在分析中设门排除死细胞可能有所帮助，但死细胞的存在仍可能影响后续过继转移后对抗体分泌细胞频率和功能检测结果的解读。

此外，我们发现，精确滴定所添加的生物素化抗原对于区分抗原特异性结合与非特异性结合至关重要。抗原用量过少会导致对抗原结合细胞频率的低估，而抗原过量则可能引起假阳性检测或富集。抗原浓度过高时，样品中非B细胞出现明显的结合信号即可作为提示。此外，若检测到过高频率的阳性细胞（>1%）的抗原反应性细胞可能提示存在结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
目的抗原	可变的	可变的	至少 100 μg 易于生物素标记；若使用蛋白质，应选择经 ELISA 验证的蛋白质。该物质必须含有载体  无蛋白质。
用于标记的生物素； 例如 EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin	赛默飞世尔科技	21335	生物素有多种配方可供选择，例如含有  不同长度的间隔序列，具体使用类型应由研究人员确定
链霉亲和素-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	可从其他供应商处获取。
抗Cy5/抗Alexa Fluor 647微珠	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS 柱	Miltenyi Biotech	130-042-401
MACS 手动分选仪	Miltenyi Biotech	可变的
甲醛			用PBS稀释至2%；若下游实验需要活细胞，则此步骤为可选
不含钙和镁的 PBS
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
肝素抗凝采血管中的全血
FACS 缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.01% 叠氮化钠）
分离缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA）
50 ml 锥形管
15 ml 离心管
1.5 ml 离心管
表面标志物特异性抗体，Fc阻断剂，活/死细胞鉴别染料（如需要）
ELISPOT 试剂，如有需要