本文介绍了一种简单而有效的方法，该方法利用磁性纳米颗粒来检测并富集抗原反应性B细胞，以进行功能和表型分析。
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本文内容
摘要
摘要
与特定抗原反应的B细胞通常出现的频率为 <淋巴细胞中占比0.05%。数十年来，研究人员一直致力于开发分离和富集这些稀有细胞的方法，以研究其表型与生物学特性。这些方法不可避免地基于以下原理：B细胞通过其细胞表面受体识别天然抗原，而这些受体的特异性与它们分化后子代细胞最终分泌的抗体特异性一致。解决该问题最直观的方法可能是使用荧光染料标记的抗原，并结合荧光激活细胞分选技术（FACS）。然而，这些方法的应用受限于细胞频率以及电子分选所能达到的分析和分离效率。本文描述了一种利用磁性纳米颗粒富集稀有抗原特异性B细胞的新方法，该方法可从大量起始细胞群体中高效富集抗原反应性B细胞。该技术使得在抗原反应性细胞分化前后对其表型和生物学特性进行更优监测成为可能。 体内 抗原接触，例如在免疫接种后或自身免疫疾病发展过程中。
引言
抗体分泌细胞前体频率的有限稀释分析表明，在正常B细胞库中，针对特定抗原的B细胞通常出现的频率为0.05%至0.005%，具体数值取决于疫苗接种状态以及抗原上存在的表位大小和数量。由于这些细胞频率极低，研究其在免疫应答发展过程中（如接种疫苗或接触外来抗原后）或自身免疫疾病发展期间的状态变化十分困难。以往，研究人员采用多种技术分离抗原反应性B细胞，包括抗原包被的培养板或层析柱吸附剂、抗原包被红细胞复位法以及荧光激活细胞分选技术1,2,3,4,5,6。尽管这些技术已成功用于识别和分离抗原反应性B细胞，但在得率、纯度和可扩展性方面结果差异较大。最近，我们开发了一种利用磁性纳米颗粒检测并富集稀有B淋巴细胞亚群的新方法。该方法能够从大量起始细胞群体中以相对较高的得率和纯度实现富集，并适用于对抗原应答的分析。通过从悬浮细胞群体中进行富集，该方法消除了抗原包被板或层析柱几何结构所带来的限制，从而提高了通量。此外，由于富集后的细胞仍与抗原及荧光报告分子结合，可进一步通过FACS分选实现更高纯度的分离。本文所述方法已用于研究人受试者在免疫接种前后外周血中破伤风....
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方案
1. 人外周血单个核细胞的分离
- 使用肝素抗凝采血管采集 30–50 ml 血液。
注意：所用血液量取决于具体的实验问题以及目标抗原特异性 B 细胞在血液中的频率。肝素抗凝血可立即处理，也可在室温下轻轻摇动过夜，次日进行处理。延迟处理对富集效率影响极小，且细胞活力损失可忽略不计。 - 将全血与无镁、无钙的磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 比例混合，PBS 需为无菌、室温状态。
- 在 50 ml 无菌锥形管中加入 10 ml 室温密度梯度溶液。已开封的密度梯度液瓶应避光保存于 4 °C，使用前需恢复至室温。
- 如有可能，将移液器调至慢速模式和/或施加轻微但稳定的按压力，缓慢将 30–35 ml 稀释后的血液叠加于密度梯度液上方，注意避免混合两层液体。
注意：添加稀释血液时，将移液器吸头紧贴 50 ml 锥形管管壁，有助于保持稳定、连续的液流。 - 在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 30 分钟，离心时关闭刹车。
- 小心移除上层液体（含血浆和血小板），注意不要扰动下方的单个核细胞层。
- 使用无菌移液器收集单个核细胞层（即血沉棕黄层，buffy coat），转移至另一无菌 50 ml 锥形管中。
- 加入 PBS 至细胞悬液终体积为 50 ml。在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟，开启刹车。
- 弃去上清液，将沉淀....
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结果
使用流式细胞术分析纯度、得率和富集倍数
如上所述富集的细胞群体不可避免地含有未结合链霉亲和素-远红外荧光染料但被截留在基质中的污染细胞。这些杂质可通过FACS分选从富集的细胞群体中去除。为评估富集群体的纯度，可根据前向散射和侧向散射和/或活/死细胞染色对活细胞设门，并分析远红外荧光染料阳性细胞的频率。该设门内的百分比可反映纯度。对这些细胞的特异性和抗原亲和力进行进一步分析，需要对单个细胞进行FACS分选，随后进行表达的免疫球蛋白基因的克隆与测序，以及重组抗体的表达与分析。
得率是指在A组分中回收的抗原结合性B细胞数量相对于起始群体中（D组分）的数量。由于D组分与A组分中的细胞数量相同，因此可直接计算得率（A组分中的抗原结合性B细胞数量 ÷ D组分中的抗原结合性B细胞数量）。
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讨论
本文介绍一种从人外周血中分离和富集抗原结合性B细胞的新型方法。该方法可轻松适用于小鼠及其他组织（如脾脏和淋巴结），并可与富集后细胞表型和功能的分析相兼容（相关论文正在撰写中）。
操作者应意识到多个可能影响本实验成功率的变量。根据经验，死细胞 tends to stick to the magnetic beads 并"take up" 荧光染料（例如链霉亲和素-远红外荧光染料），导致非特异性的背景信号升高。在开始本实验前，尽可能去除样本中的死细胞至关重要。使用能够区分活细胞与死细胞的染料以在分析中设门排除死细胞可能有所帮助，但死细胞的存在仍可能影响后续过继转移后对抗体分泌细胞频率和功能检测结果的解读。
此外，我们发现，精确滴定所添加的生物素化抗原对于区分抗原特异性结合与非特异性结合至关重要。抗原用量过少会导致对抗原结合细胞频率的低估，而抗原过量则可能引起假阳性检测或富集。抗原浓度过高时，样品中非B细胞出现明显的结合信号即可作为提示。此外，若检测到过高频率的阳性细胞（>1%）的抗原反应性细胞可能提示存在结.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了青少年糖尿病研究基金会（JDRF，项目编号：1-2008-994、27-2012-450）和美国国立卫生研究院（项目编号：R01DK096492-05、R21AI124488-01、T32OD012201 和 F30OD021477）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 目的抗原 | 可变的 | 可变的 | 至少 100 μg 易于生物素标记；若使用蛋白质，应选择经 ELISA 验证的蛋白质。该物质必须含有载体 无蛋白质。 |
| 用于标记的生物素； 例如 EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | 赛默飞世尔科技 | 21335 | 生物素有多种配方可供选择，例如含有 不同长度的间隔序列，具体使用类型应由研究人员确定 |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | 可从其他供应商处获取。 |
| 抗Cy5/抗Alexa Fluor 647微珠 | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS 手动分选仪 | Miltenyi Biotech | 可变的 | |
| 甲醛 | 用PBS稀释至2%；若下游实验需要活细胞，则此步骤为可选 | ||
| 不含钙和镁的 PBS | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| 肝素抗凝采血管中的全血 | |||
| FACS 缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.01% 叠氮化钠） | |||
| 分离缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA） | |||
| 50 ml 锥形管 | |||
| 15 ml 离心管 | |||
| 1.5 ml 离心管 | |||
| 表面标志物特异性抗体，Fc阻断剂，活/死细胞鉴别染料（如需要） | |||
| ELISPOT 试剂，如有需要 |
参考文献
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F.
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