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一种表征形态学变化的实验方案 艰难梭菌 对抗生素治疗的响应

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DOI：

10.3791/55383

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2017年5月25日

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1Department of Pharmacy Practice and Translational Research, University of Houston College of Pharmacy, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston

本文内容

摘要

抗生素疗效通常通过进行杀菌动力学研究并测定菌落形成单位（CFUs）来确定。通过将扫描电子显微镜（SEM）与这些标准方法相结合，我们可以区分不同抗生素治疗的药理学效应。

摘要

针对厌氧菌的新药研发中，评估抗生素作用具有较高难度且技术要求较高。为了深入了解可能的作用机制（MOA），可通过扫描电子显微镜（SEM）观察抗生素暴露后引起的形态学变化。将SEM成像与传统的杀菌曲线相结合，可能加深我们对药物作用机制的理解，并推动药物研发进程。为验证这一设想，本研究采用具有已知但不同作用机制的药物（万古霉素和甲硝唑）进行了杀菌曲线和SEM研究。C. difficile 细胞（R20291）在有或无抗生素的条件下培养长达48小时。在48小时的时间范围内，于多个时间点收集细胞，以评估抗生素效力并进行SEM成像。与既往报道一致，通过菌落形成单位（CFU）计数测定，万古霉素和甲硝唑在处理24小时后均表现出显著的杀菌活性。通过SEM成像分析发现，与对照组及万古霉素组相比，甲硝唑对细胞长度具有显著影响（每种抗生素均使其细胞长度减少超过>50%；P<0.05）。尽管此前尚未以这种方式系统记录过药物处理后的表型反应，但本结果与其已知药物作用机制相符，表明该成像与测量方法具有良好的通用性和可靠性，适用于其他实验性化合物的研究。

引言

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、可形成芽孢的细菌，每年在美国导致约50万例感染，被美国疾病控制与预防中心（CDC）列为威胁等级最高的紧急病原体，即最高风险级别。1 过去十年中，针对具有抗菌活性的抗菌药物研发取得了显著进展 C. difficile.2,3体外 研究是药物开发过程中的必要组成部分。4 传统上， 体外 敏感性与时间-杀菌研究用于验证未来的动物实验及其他研究 体内 研究。

尽管这些方法在评估杀菌作用方面具有重要作用，但它们无法捕捉细胞对药物处理的表型响应。通过将扫描电子显微镜（SEM）与标准的杀菌动力学研究相结合，可以更全面地表征抗生素的直接效应。5,6,7 本文介绍了一种利用SEM来分析抗生素治疗效果的方法。

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方案

1. 从不同环境或临床来源分离 C. difficile

  1. 环境分离物：使用预先灭菌的棉签（用0.85% NaCl轻微润湿），擦拭任何目标区域的表面（地面、门、把手、货架） 等。).8 确保佩戴无菌手套，采样完成后将拭子放入无菌管中。
  2. 临床分离株（粪便）：使用接种环将10至100 mg临床粪便样本划线接种于头孢西丁-环丝氨酸-果糖琼脂（CCFA）平板，于严格厌氧条件下培养48–72小时。保存分离的单个菌落于 C. difficile 将样品分装至冻存管中，于 -80 °C 保存，以备后续分析。7,9,10
  3. 将环境拭子样本在含0.05%牛磺胆酸钠的脑心浸液（BHI）肉汤中增菌，置于37 °C厌氧环境中培养5天。取1 mL培养物在10,000 x g离心，将沉淀重悬于100 µL乙醇中。
  4. 将重悬的细胞（50 µL）接种至环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（CCFA）平板上，置于厌氧培养箱中，37 °C 培养 40–48 小时。保存分离的菌落于 C. difficile 将样品分装至冻存管中，于 -80 °C 保存，以备后续分析。
  5. 测试疑似 C. difficile 使用乳胶凝集试剂或PCR鉴定菌落。

2. C. difficile 的培养及杀灭动力学实验步骤

  1. 在厌氧培养箱中，将纯化的环境或临床来源的 C. difficile 菌株接种于血琼脂平板上，37 °C 培养 48 小时。
  2. 用接种环挑取一个单菌落，转移至含有 5 mL BHI 培养基的 15 mL 离心管中，在厌氧培养箱中 37 °C 培养 24 小时。
  3. 将预培养物按 1:100 比例稀释至约 106 个菌落形成单位（CFU）/mL，稀释液为新鲜预还原的 BHIS 培养基（BHI 加 5 g/L 酵母提取物和 1% L-半胱氨酸），并添加 0.1% 牛磺胆酸钠及适当浓度的抗生素（T0 时点）。
  4. 在每个时间点（T0、T6、T24、T48），用移液器吸取 1 mL 样品，取少量等分试样（100 µL，进行系列稀释）涂布于血琼脂平板上。将平板置于厌氧培养箱中，37 °C 培养 48 小时，计数形成的菌落数量以确定 CFU。

3. 扫描电子显微镜样品制备

  1. 在微量离心管中收集每个时间点的1 mL细胞，于10,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并用PBS洗涤细胞。
  2. 再次于10,000 × g离心样品10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL的4%多聚甲醛中，在室温下孵育1小时。
  3. 再次于10,000 × g离心样品10分钟，弃去上清液。用蒸馏水洗涤细胞两次，然后重悬于100 µL蒸馏水中。根据溶液的浊度调整体积。
    注意：建议进行多个连续稀释。
  4. 标记盖玻片，并在其上加入40 µL样品。在通风橱中孵育15分钟，使液体蒸发，并使细胞附着于盖玻片上。若仍有液体残留，可使用吹风机去除。
  5. 将带有细胞的标记盖玻片放入台式溅射仪中并固定。将纯金安装至溅射仪内。开启仪器，在低压（50 mTorr）下开始溅射。在80 mA条件下溅射30秒，相当于形成20 nm厚的金涂层。
  6. 将镀膜后的样品转移至扫描电子显微镜中进行观察。

4. 在扫描电子显微镜下成像 C. difficile 细胞

  1. 通过点击计算机软件上的“vent”按钮，正确对扫描电子显微镜（SEM）进行放气。
  2. 使用碳导电胶带将镀膜的盖玻片固定在金属载物台上。当SEM完成放气后，舱门应能轻松打开。通过旋转将金属载物台锁入SEM腔室中。
  3. 点击计算机软件上的“PUMP”按钮。当系统显示"Vac OK"时，SEM即可使用。
  4. 在探测器选项卡下点击SE探测器。点击显示电压的按钮以开启电子束。成像时先从较低电压（5 kV）开始，再逐步升高电压（最高至15 kV）。开启电子束后，图像将出现在屏幕上。
  5. 利用追踪功能，在镀膜的盖玻片上寻找待成像区域。放大目标区域并寻找杆状结构；这些即为clostridium difficile。
  6. 进一步放大并聚焦图像以校准系统。此步骤应在多个工作距离下进行：15 mm、9 mm 和 5 mm。最终在5 mm的工作距离下获取图像。
  7. 开启超高清成像模式，并开始聚焦及优化像散。
  8. 在高倍率下开始聚焦。使用粗调和微调聚焦开关进行操作。同时调整像散，以获得更清晰的图像。
    1. 在高倍率下调整像散。为此，调节像散控制开关（其外观与粗/微聚焦开关相似），并通过计算机软件中的数字放大功能检查图像清晰度。
  9. 使用慢扫描功能采集高质量图像。将采集的图像保存为.TIFF文件，用于后续分析。若分析过程中需要进行测量，请确保选中数据标尺栏。
  10. 通过手动旋转SEM上的倾斜角度，采集不同角度的图像（最大可达52°）。倾斜成像通常能提供更多深度信息。
  11. 根据所成像的细胞类型调整电子束电压。所有实验中，电压应主要保持在5–15 kV范围内。
  12. 成像完成后，关闭电子束并将工作距离提升至20 mm。随后可对腔室放气并取出载物台。将所有图像复制到存储设备中，用于进一步分析。

5. 图像处理与分析

  1. 下载并安装免费提供的软件 FIJI（http://fiji.sc）到计算机上。
  2. 在 FIJI 中打开图像文件。
  3. 使用直线工具，精确地沿标尺（scale bar）描迹。
  4. 点击 FIJI 程序中的“Analyze”选项卡，然后选择“Set Scale”功能。此时将弹出一个窗口，要求根据标尺设置已知距离。同时更改长度单位，然后点击“OK”。
  5. 完成距离校准后，使用直线工具测量细胞长度。为获得长度值，需用直线工具完整描迹整个细胞。再次选择“Analyze”选项卡，然后点击“Measure”。长度值将以先前设定的单位显示。

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结果

Clostridium difficile 是一种产孢细菌，因此在进行任何功能分析之前，确定营养细胞与孢子细胞之间的形态学差异至关重要。图1展示了在生长曲线对数生长期拍摄的营养细胞和孢子细胞的代表性图像。如图所示，营养细胞呈细长、光滑的杆状结构，而孢子则为体积较小、外表面粗糙的椭圆形结构。从功能上看，营养细胞生长和分裂迅速，并通过分泌毒素介导C. difficile感染的致病性；而孢子通常处于休眠状态，代谢活性极低。因此，抗生素主要对营养细胞有效，而孢子由于具有多层保护结构包裹含DNA的核心，且缺乏生理活性，通常对抗药物治疗。基于上述原因，大多数形态学分析均集中于营养细胞。11,12

抗生素杀菌曲线是用于证明抗生素对生长中细菌杀灭效果的标准方法。对艰难梭菌R20291...

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讨论

本研究的目的是建立一种高通量方法，用于分离C. difficile并利用扫描电子显微镜（SEM）检测其对抗生素的敏感性，从而更全面地表征抗生素的药理作用。通过采用此处所述的实验方案，我们已证明，对细胞在抗生素处理后的表型反应进行成像，能够揭示药物药理作用的深入信息。总体而言，在收集细胞后，该方案的成像部分大约需要2小时，但其分辨能力远高于传统的杀菌动力学研究。尽管学习使用扫描电子显微镜在技术上具有一定挑战性，但样品制备过程相对简单且快速。我们认为，本文所述的这些实验方案将为评估抗生素治疗的药理作用提供一种客观的方法。

鉴于抗生素杀菌曲线之间的相似性（图2），我们试图确定细胞对药物处理的反应是否存在差异。通过扫描电镜（SEM）分析，我们发现甲硝唑在高于最低抑菌浓度（supraMIC）时对细胞长度产生影响。尽管这些表型此前未见报道，但它们与抗生素的作用机制一致，提示其对细胞代谢和生长具有影响。相比之下，万古霉素对细胞壁具有显著影响，这也与其已知的作用机制相符。13 尽管这些抗生素的杀菌动...

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披露

KWG 过去和现在均获得默克公司（Merck & Co.）和 Summit, PLC 的研究资助。

致谢

这些实验得到了默克公司和Summit PLC研究资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
棉质纱布 卡瑞PRM21408C
NaCl麦克朗7532
50 mL 离心管费尔康352098
脑心浸液培养基（BHI） 准则C5141
L-半胱氨酸阿尔法埃瑟A10389
酵母提取物准则C741
牛磺胆酸钠阿尔法埃瑟A18346
厌氧培养箱科伊乙烯厌氧培养箱
环丝氨酸-头孢西丁果糖琼脂（CCFA）平板厌氧系统AS-213
血琼脂平板哈迪诊断A-10
乳胶凝集试剂奥克oidDR1107AC. diff 检测试剂盒
微量离心管艾本道夫222363204
PBS吉布科10010-031
4% 多聚甲醛菲舍尔科技50-259-98
显微镜载玻片J. 梅尔文·弗里德品牌7525M75 × 25 mm
超净工作台莱博康科II 级 A2 型 生物安全柜
桌面溅射仪登顿真空Desk II
胶带塑料核心05072-ABSPI 双面导电碳胶带
金登顿真空TAR001-01582.375” 直径 × 0.002” 厚金箔
扫描电子显微镜FEIXL-30

参考文献

  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  2. Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
  3. Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
  4. Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
  5. Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
  6. Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
  7. Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
  8. Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
  9. Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
  10. Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
  11. Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
  12. Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
  13. Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
  14. McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).

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