本文介绍了一种通过每周腹腔注射经细胞因子转导的基质细胞系，在患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中产生外源性细胞因子的方法。该方法拓展了PDX模型的应用范围，并为在多种PDX模型中实现外源性细胞因子的瞬时或持续递送提供了选择。
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本文内容
摘要
摘要
由患者来源的异种移植（PDX）小鼠是通过将人类细胞移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的模型。这类模型是研究正常与恶性造血机制的重要工具，也是筛选多种恶性肿瘤有效化疗药物的金标准。PDX模型得以实现的原因在于，许多小鼠的细胞因子同样可作用于人类细胞。然而，并非所有细胞因子都具有这种跨物种活性，其中包括一些对研究人类细胞正常与恶性造血至关重要的细胞因子。构建可表达人类细胞因子的转基因或基因敲入小鼠模型虽可行，但需投入大量经费，且在验证其有效性之前成本较高。其他方法则劳动密集，例如注射重组细胞因子或慢病毒，某些情况下还需较高的技术门槛（如DNA的水动力注射）。本报告介绍一种简便的方法，用于构建表达外源性人类细胞因子（TSLP，胸腺基质淋巴细胞生成素）的PDX小鼠模型。 通过 每周一次腹腔注射经转导后过表达该细胞因子的基质细胞。该方法的使用可提供一种 体内 持续产生细胞因子的来源，可在小鼠体内实现循环人源细胞因子的生理水平。通过调整注射的基质细胞数量，可调节人源细胞因子的血浆浓度，并可在实验的任意时间点启动细胞因子的产生。该方法还包括细胞因子阴性对照小鼠，其制备方式相似，但通过腹腔注射经对照载体转导的基质细胞实现。我们先前已证明，与对照PDX来源的白血病细胞相比，来自表达TSLP的PDX的白血病细胞表现出更接近原始患者样本的基因表达模式。综上，通过该方法产生的细胞因子阳性与阴性PDX小鼠共同构成一个模型系统，已被我们成功用于研究TSLP在正常与恶性造血中的作用。
引言
患者来源的异种移植模型（PDX）是一种强大的体内模型，可用于在“天然”的哺乳动物环境中研究正常和恶性造血细胞的生成。通常通过将人类细胞注射或移植到免疫缺陷小鼠体内来建立PDX模型。利用正常人造血干细胞构建PDX模型，可实现对人类正常血液和免疫细胞发育的体内研究。而由白血病或其他癌细胞建立的PDX模型则使得研究人员能够在人类群体中存在的多种遗传背景和突变条件下，研究致癌机制并筛选有效的治疗方法。1 因此，PDX模型目前已成为转化生物医学研究中的金标准，用于识别有效疗法，同时也是理解癌症进展机制的重要工具。PDX模型对于研究由特定基因损伤引起的健康差异相关疾病，或任何患者遗传背景的变异可能显著影响肿瘤发生及治疗效果的疾病，均具有不可或缺的作用。
人鼠异种移植模型（PDX）之所以可行，是因为许多小鼠细胞因子在小鼠体内能够有效模拟其人类对应物，激活人类细胞的细胞因子受体。例如，白细胞介素-7（IL-7）为人类B细胞的发育提供了关键信号。2 在此情况下，小鼠 IL-7 与人类 IL-7 具有足够高的同源性，因此小鼠细胞因子可激活人类 B 细胞前体中的信号通路。2,3,4 ....
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方案
研究严格按照洛马林达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及机构审查委员会（IRB）批准的方案，并依照所有联邦指南进行。
警告：应按照安全操作规程处理PDX和人源组织，以防止血液传播病原体的传染。
1. 细胞因子转导基质细胞的培养与扩增
注意：每次传代基质细胞时，收集培养上清液（1 mL等分试样），并于-80 °C保存，用于后续细胞因子水平的定量检测 通过 ELISA 检测
- 按照材料表中的说明配制 R10 培养基和冻存液。
- 生成10,11 或获取对照基质细胞（用空载体转导）和细胞因子产生型（TSLP+）基质细胞。6 在液氮（LN2) 直至使用。按所述方法解冻基质细胞12 并分别接种于含有5 mL R10培养基的T-25细胞培养瓶中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2。这是解冻后的 "传代 #1".
- 一旦基质细胞达到汇合（24–48 小时），使用 1× 胰蛋白酶 EDTA（0.25%）进行消化传....
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结果
该模型的概述见图1。在获得可产生细胞因子的基质细胞（TSLP+基质）和对照基质细胞后，需在体外进行扩增培养。在将基质细胞注射入小鼠体内之前，需通过ELISA检测基质细胞上清液，以确认细胞因子的产生（图2），并采用磷酸化流式细胞术（方案#3）验证基质细胞所产生细胞因子的活性。上清液在基质细胞传代时，从融合生长的细胞培养物（对照基质和TSLP+基质）中收集。在早期、中期和晚期传代过程中，至少各进行一次ELISA检测，以监测上清液中TSLP的浓度。对照基质细胞的代表性数据见图2A。若对照基质细胞培养物中检测到TSLP表达（及其冻存的细胞管），应予以弃用。TSLP表达不可检出的对照培养物则进行扩增并冻存，以供后续实验使用。如图2B所示，TSLP+基质细胞培养物中若TSLP产量较低（及其冻存的细胞管），也应予以弃用。仅选择TSLP产量稳定且高水平的TSLP+基质细胞进行扩增和冻存，用于后续实验。对照基质和TSLP+基质多个培养物上清液中TSLP的平.......
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讨论
本文描述了一种简单、快速且相对低成本的方法，用于构建表达外源性人源细胞因子的PDX模型。该策略基于每周腹腔注射经基因工程改造后表达人源细胞因子TSLP的基质细胞系。在实施本文所述方法之前，已预先构建了能够高水平表达目标细胞因子（TSLP）的工程化基质细胞，以及经类似改造的对照基质细胞。在本文提供的实验方案中，基质细胞在体外扩增，并检测其是否能够长期稳定地高水平分泌细胞因子（对照基质细胞则检测其无细胞因子分泌）。通过功能检测验证了基质细胞所分泌细胞因子的生物学活性，并制定了基质细胞注射的时间进程，以建立具有生理水平人源TSLP的PDX模型（以及不表达人源TSLP的对照小鼠模型）。文中还提供了监测小鼠血浆中人源TSLP水平并验证其功能的实验步骤 体内 对细胞因子应答细胞群体的功能效应进行了检测。
在选择本方案中所使用的基质细胞和载体时，应考虑多个因素。基质细胞系不应内源性地高水平产生细胞因子，也不应对所关注的细胞因子产生反应。本研究中选用人骨髓基质细胞系 HS-27A，因其在培养中生长 robust，且细胞因子产生水平较低。8
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R21CA162259、NIH R01CA209829、NIH P20 MD006988、NIH 2R25 GM060507、Hyundai Hope on Wheels 学者希望基金、洛马林达大学医学院病理学与人体解剖学系、基础科学系以及健康差异与分子医学中心，以及洛马林达大学促进协作与转化研究基金（KJP）资助。本内容完全由作者负责，不代表NIH的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>湿实验试剂 | |||
| T-25 Nunc 细胞培养处理 EasYFlasks，容量 7 mL 25 cm² 培养区域 | 赛默飞世尔科技 / 费舍尔 | 156367 | |
| T-75 Falcon 细胞培养处理烧瓶，250 mL 容量，75 cm²² 培养区域 &和通气盖 | 康宁公司 / 费舍尔 | 353136 | |
| T-150 Falcon 组织培养处理培养瓶，600 mL 容量，150 cm²² 培养区域 &和通气盖 | 康宁公司 / 费舍尔 | 355001 | |
| 10 mL 血清移液管 | Falcon | 357551 | |
| 15 mL 聚丙烯锥形管 | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管 | Falcon | 352054 | |
| 50 mL 聚丙烯锥形管 | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL 冻存管，外螺纹 | 康宁公司 / 费舍尔 | 4230659 | |
| 1 mL 移液器吸头 | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL型移液器吸头 | 德文特科学公司 | P3020-CPS | |
| 10 μL型移液器吸头 | 丹维尔科学 | P-1096-CP | |
| 带SFCA膜的无菌一次性过滤装置，Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| 杜尔贝科’不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），1× | Corning cellgro / Mediatech | 21-031-CV | |
| 人TSLP ELISA Max Deluxe试剂盒 | BioLegend | 434204 | |
| 3%乙酸与亚甲蓝 | Stemcell Technologies | 7060 | |
| 台盼蓝 | 康宁 | 25-900-Cl | |
| "胰蛋白酶" 1x 0.25% 胰蛋白酶 2.21 mM EDTA（溶于HBSS中） | 赛默飞世尔科技 | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| <强>“R10” 细胞培养基，占总体积的百分比（配制565 mL） | - | <强>- | <强>实验方案 |
| RPMI，88.5%（500 mL） | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS，9.9%（56 mL） | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-谷氨酰胺，0.99%（5.6 mL） | Mediatech | 25-005-Cl | |
| 青霉素-链霉素，0.50%（2.8 mL） | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-巯基乙醇，0.10%（560 µL | MP | 190242 | |
| <强>“R20” 细胞培养基，占总体积的百分比（配制195 mL） | - | - | <强>实验方案配方 |
| RPMI，76.84%（150 mL | 见上文 | 见上文 | |
| FBS，20.49%（40 mL） | 见上文 | 见上文 | |
| 2 mM L-谷氨酰胺，1.02%（2 mL） | 见上文 | 见上文 | |
| 1 mM Na-丙酮酸盐，1.02%（2 mL） | 见上文 | 见上文 | |
| 青霉素-链霉素 0.51%（1 mL） | 见上文 | 见上文 | |
| 2-巯基乙醇，0.10%（0.1 M） 0.10% (200 µL | 见上文 | 见上文 | |
| <强>“冻存液”，占总体积的百分比 | - | <强>- | <强>实验方案 |
| “R10” 培养基，45% | 见 "R10" 配方 | - | |
| FBS，20% | 见上文 | 35-011-CV | |
| DMSO，10% | 康宁 | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-海藻糖二水合物，5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>目录编号 | <强>评论 |
| <强>生物制剂 | |||
| "HS-27" HS-27A 人源间质细胞系 | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4细胞系，人B细胞前体白血病 | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG小鼠” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ，雄性或雌性，6周龄 – 8 周 | 杰克森实验室小鼠 | # 005557 | |
| MUTZ-5细胞系，人类B细胞前体白血病 | DSMZ | ACC 490 | |
| 重组人TSLP蛋白 | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>流式细胞术抗体（克隆）* | |||
| 抗小鼠 CD45 FITC（30F11） | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE（MB15-18C9）（别名为 IL-7R）α) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC（8G12） | BD 生物科学 | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" 可固定的活力染料 eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ 轻链 FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ 轻链FITC（JDC-12） | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE（IA6-2） | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5（G20-127） | BD 生物科学 | 551079 | |
| pSTAT5 PE， 小鼠抗-STAT5（pY694） | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>其他材料 &和设备 | |||
| 带套管的动物可植入式纳米应答器 | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA 利多卡因麻醉乳膏（通过动物护理机构凭处方获取） | 处方 | 处方 | |
| BD ½ cc 低剂量U-100胰岛素注射器 28G½ | BD | #329461 | |
| 含 K 的 BD Microtainer 管2EDTA | BD | #365974 | |
| 离心 | 贝克曼库尔特 | Alegra X-15R | |
| FisherBrand 毛细管（肝素化） | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| 血细胞计数板 | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| 小鼠Pie笼 | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| 小鼠尾部照明固定器 | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| 手枪式植入器 | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µ定量 | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo 流式细胞术分析软件 | FlowJo, LLC | 版本 10 | |
| *所有抗体均为抗人源，除非另有说明。 |
参考文献
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
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