本文提供了一种简便、低成本且省时的化学固定方法，使用丙烯醛固定剂固定灵长类动物脑组织，可实现长期保存，并适用于透射电子显微镜所需的包埋前免疫组织化学分析。
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本文内容
摘要
摘要
尽管光学显微镜技术取得了所有进步 在神经科学领域，电子显微镜仍是研究和表征神经元超微结构与形态细节（如突触连接）的唯一工具。通过严格的冷冻固定方法可实现脑组织在电镜观察中的良好保存，但这些技术成本较高，且限制了免疫标记的应用——而免疫标记对于理解特定神经系统的连接性至关重要。为此，已发展出冷冻置换技术，以实现冷冻固定与免疫标记的结合。然而，这些方法的可重复性通常依赖于昂贵的冷冻设备。此外，该技术获得可靠结果的过程耗时较长，且对操作技能要求较高。因此，传统的化学固定脑组织方法，特别是使用丙烯醛作为固定剂的方法，仍然是将电子显微镜与免疫组织化学相结合的一种高效、低成本的方案。本文提供了一种可靠的实验流程，采用化学丙烯醛固定法，可有效保存灵长类动物脑组织，并适用于包埋前免疫组织化学染色及透射电子显微镜观察。
引言
光学显微镜技术，包括共聚焦显微镜和双光子显微镜，已被证明是研究 体内 神经元突起等结构1,2尽管光学显微镜（LM）水平的典型空间分辨率约为200 nm，但近年来利用不同光源（如极紫外光和软X射线显微技术）的技术进步已显著将该分辨率提升至接近10 nm的空间分辨率。3,4,5其他成像技术的进步包括磁共振成像与组织学的结合，为测量髓鞘厚度提供了一种新方法 体内，这一参数传统上仅能在电子显微镜（EM）水平下测量6,7尽管在光学显微镜（LM）水平上的这些进展为研究生命过程提供了极佳的工具，但对突触接触等结构进行详细观察和表征仍需依赖电子显微镜（EM），其分辨率可达0.5 nm。然而，电子显微镜观察要求样品必须死亡并在一定程度上经过化学固定剂处理和脱水等处理方式，以保持细胞结构的完整性。因此，由于电子束引起的辐射损伤、对比度低、膜结构的形变，或在脱水及环氧树脂包埋后可能出现的假象，高分辨率下生物样品的观察仍具有挑战性。8,
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方案
伦理声明：所有涉及动物的实验方案均经拉瓦尔大学动物保护委员会（Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval）批准，并遵循加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》（第2版）的规定。本文所述方案针对体重约800 g的成年动物进行了优化。固定剂的用量应根据动物体型进行相应调整。
1. 心脏灌注溶液的制备
- 按照以下步骤配制1 L 50 mM磷酸钠缓冲盐溶液（PBS）。溶液应在灌注前最多24小时内配制，并于4 °C保存至使用。
- 用量筒量取800 mL蒸馏水倒入1 L烧杯中。加入5.87 g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）。2HPO4)，1.20 克一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）2PO4·H2O）和 9 g 氯化钠（NaCl）。搅拌至溶解。
- 用5 N NaOH逐步调节pH至7.4。加蒸馏水定容至1 L。
警告：NaOH 是一种腐蚀性化学化合物。请穿戴适当的个人防护装备（PPE；实验服、手套、护目镜）， 等等.).
- 按照以下步骤配制 2 L 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。该溶液应在手术前最多 24 小时内配制，并于 4 °C 保存至使用。
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结果
本部分展示了在透射电子显微镜下观察经3%丙烯醛和4%多聚甲醛混合液化学固定的灵长类脑组织免疫染色样本后获得的代表性结果。超微结构保存良好，表现为髓鞘相对完整，双层膜结构清晰可见（图2A）。突触接触以及来自微环境的神经元结构可被明确识别（图2B）。在电镜水平下，经二氨基联苯胺（DAB）免疫沉淀标记的神经元结构表现为胞质或轴浆内充满沉淀物。质膜以及细胞器外表面也通常可见电子致密沉淀物分布（图3）。
在本实验中，我们使用了针对5-羟色胺转运体（SERT）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）或酪氨酸羟化酶（TH）的抗体，以观察松鼠猴苍白球外侧部（GPe）或内侧部（GPi）中免疫标记的神经元结构（图3）。为此，我们采用了一种固定液组合，既能保持抗原性，又能保存超微结构，从而实现对形态学的详细研究。尽管上述经心脏灌注固定方案可适用于多种抗.......
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讨论
本文介绍了一种可靠的非人灵长类动物经心脏灌注及适用于电镜样本检测的包埋前免疫组织化学染色方案。尽管典型的冷冻电镜技术（如CEMOVIS）能够良好地保存脑组织超微结构，但其限制了免疫组织化学染色的应用12。其他技术，包括冷冻置换和Tokuyasu法，虽可实现包埋后免疫染色，但由于过程中需要额外设备，成本较高，且耗时较长、技术难度大12,14,15。此外，为了有效使用冷冻固定方法，样本必须相对较小（使用高压冷冻时厚度不超过200 µm28，常压下仅为10 µm29）。理想情况下，灵长类脑组织的冷冻固定需取自活检样本，这会导致难以准确定位目标区域。该问题必须通过立体定位坐标来规避。上述采用丙烯醛化学固定结合包埋前免疫染色的技术，为灵长类脑组织样本制备和电镜水平的免疫标记提供了一种简便、低成本、高效且可靠的方法。按照本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC，项目号 401848-2011，授予 M.P.）提供资助。M.P. 获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S)）的职业奖项。L.E. 获得了魁北克健康研究基金会的博士奖学金（FRQ-S 14D 29441）。我们感谢 Marie-Josée Wallman 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Fisher scientific | S374-500 | |
| 一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O） | EM Science | SX0710-1 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher scientific | S271-3 | |
| 羟甲基氨基甲烷（THAM） | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N 稀释液。产品具有腐蚀性。使用时应采取适当防护措施。 |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N 稀释液。产品具有腐蚀性。使用时应采取适当防护措施。 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | 4% 稀释液。粉末形式高度挥发且剧毒。应在通风橱内谨慎操作，并采取适当防护措施。 |
| 丙烯醛（90%） | Sigma | 110221 | 3% 稀释液。产品剧毒。应在通风橱内操作，并采取适当防护措施。 |
| 尸体解剖通风台 | Mopec | CE400 | |
| 电子灌注泵 | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| 灌注针头 | terumo | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| 针头 | terumo | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| 氯胺酮 | 20 mg/kg | ||
| 赛拉嗪 | 4 mg/kg | ||
| 乙酰丙嗪 | 0.5 mg/kg | ||
| 手术刀 | |||
| 手术刀片 | Feather lance | 201011 J9913 | 手术使用 No.22，电镜使用 No.11 |
| 手术剪 | |||
| 咬骨钳 | |||
| 振动切片机 | Leica | VT 1200S | 每次使用前校准刀片（在设备允许的情况下） |
| 振动切片机刀片 | Gillette | GIN 642107 | |
| 甘油 | Fisher scientific | G33-4 | 30% 稀释液 |
| 乙二醇 | Fisher scientific | E178-4 | 30% 稀释液 |
| 硼氢化钠（NaBH4） | Sigma | S-9125 | |
| 正常马血清（NHS） | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% 稀释液 |
| 冷鱼明胶 | Aurion | 900.033 | 0.5% 稀释液。原始产品浓度为 40% |
| 一抗，SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 稀释 |
| 一抗，ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 稀释 |
| 一抗，TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 稀释 |
| 生物素化二抗，山羊来源 | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000 稀释 |
| 生物素化二抗，小鼠来源 | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 稀释 |
| Vectastain Elite ABC 试剂盒 | Vector laboratories | PK6100 | 每毫升 A 和 B 各 8.8 µL |
| 3,3'-二氨基联苯胺（DAB） | Sigma | D5637 | 0.05% 稀释液。粉末形式高度挥发且有毒。废弃物不得倒入水槽。 |
| 过氧化氢（H2O2）30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% 稀释液 |
| 四氧化锇（OsO4） | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | 原始溶液可为 2% 或 4%。注意计算最终 1% 稀释液时所用的浓度。产品对光极为敏感。锇具有高度毒性。仅可在通风橱内使用，并采取适当防护措施。 |
| Durcupan 防水环氧树脂 | Sigma | A: M 环氧树脂（44611） B: 固化剂 964（44612） C: 加速剂 960（DY 060）（44613） D: 增塑剂（44614） | 聚合前在 58 °C 下加热 48 小时，之后方可作为废弃物处理。 |
| 铝制样品杯 | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| 乙醇 | commercial alcohols | 1019C | 用蒸馏水稀释至适当浓度 |
| 环氧丙烷 | Electron microscopic science | 20401 | 有机溶剂。高度挥发且有毒。应在通风橱内使用。 |
| 未镀膜中等载玻片 | brain research laboratories | 3875-FR | 用矿物油涂抹表面 |
| 塑料膜（Aclar 包埋膜） | Electron microscopic science | 50425-25 | 用矿物油涂抹表面 |
| 超薄切片机 | Leica UC7 | EM UC7 | |
| 钻石修块刀（ultratrim） | Diatome | UT 1081 | 也可使用玻璃刀替代 |
| 45° Diatome 钻石刀 | Diatome | MC13437 | 配备小舟 |
| 二甲苯 | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150 目铜网 | Electron microscopic science | G150-cu | |
| 铜网盒 | Electron microscopic science | 71138 | 最多可存放 100 个铜网 |
| 柠檬酸钠 | Anachemia | 81983 | |
| 硝酸铅 | Sigma | L-6258 | 将 1.33 g 硝酸铅和 1.76 g 柠檬酸钠溶于 42 mL 预先煮沸并冷却的蒸馏水中，待硝酸铅完全转化为柠檬酸铅后，加入 8 mL 1 N NaOH，配制成储备液。pH 值应约为 12。溶液应储存于密封塑料瓶中，并避光保存。 |
| 注射器 | terumo | SS-05L | 5 mL |
| 注射器滤器 | Corning | 431222 | 0.2 µm |
| 吸水纸（bibulous paper） | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm 封口膜 | Laboratory film | PM-999 | |
| 矿物油 | Sigma | M5904 |
参考文献
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
- Zhou, Y., et al.
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