脑血流动力学与光散射特性的同步评估 体内 使用传统的多光谱漫反射成像系统演示大鼠脑组织。
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摘要
摘要
脑血流动力学与光散射特性的同步评估 体内 使用传统的多光谱漫反射成像系统演示大鼠脑组织。该系统由宽带白光光源、带有窄带干涉滤光片组的电动滤光轮、导光管、收集透镜、视频变焦镜头和单色电荷耦合器件（CCD）相机构成。在异氟烷麻醉下，于大鼠颅骨上制作椭圆形颅窗，以采集 体内 大脑皮层表面的多光谱漫反射成像。通过气体混合装置调节吸入氧浓度，可诱导产生不同的呼吸状态，如常氧、高氧和无氧状态。随后，基于蒙特卡罗模拟的多元回归分析被用于处理在九个波长（500、520、540、560、570、580、600、730 和 760 nm）下测得的多光谱漫反射图像，以可视化血流动力学及组织光散射特性的二维分布图 体内 大鼠脑
引言
多光谱漫反射成像技术是获取皮层组织内在光学信号（IOSs）空间分布图的最常用方法。在该技术中观察到的IOSs 在体 大脑中的变化主要归因于三种现象：由皮层血流动力学引起的光吸收和散射特性的变化、线粒体中细胞色素还原或氧化状态导致的吸收差异，以及由形态学改变引起的光散射特性变化1.
可见光（VIS）至近红外（NIR）光谱范围内的光会被生物组织有效吸收和散射。体内脑组织的漫反射光谱具有吸收和散射光谱的特征。脑组织在可见光至近红外波长范围内的约化散射系数μs'导致散射光谱呈单调变化，且在较长波长处幅度较小。约化散射系数光谱μs'(λ)可近似表示为幂律函数形式2,3，即μs'(λ) = a × λ-b。散射指数b与活体组织中生物散射体的尺寸相关2,3。组织的形态学改变以及活体皮层组织活力的降低均可能影响生物散射体的尺寸4,5,6,7,8,9。
多光谱漫反射成像的光学系统可由白炽光源、简单的光学元件和单色电荷耦合器件（CCD）轻松构建。因此，已有多种算法和光学系统被用于评估皮层血流动力学和/或组织形态10,11,12,13,14,15,16,17,18。
本文所述方法利用常规的多光谱漫反射成像系统，用于在活体条件下可视化大鼠脑组织的血流动力学和光散射特性。in vivo 该方法相较于其他技术的优势在于能够评估脑血流动力学和皮层组织形态的时空变化，且适用于多种脑功能障碍动物模型。因此，该方法适用于创伤性脑损伤、癫痫发作、中风和缺血等研究。
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方案
动物护理、准备及实验方案均获东京农工大学动物研究委员会批准。本方法中，大鼠饲养于受控环境（24 °C，12小时光照/12小时黑暗循环），自由饮水进食 随意摄取
1. 传统多光谱漫反射成像系统的构建
- 将中心波长分别为 500、520、540、560、570、580、600、730 和 760 nm 的九个窄带光学干涉滤光片安装至电动滤光轮的滤光片孔位。
- 使用宽带白光光源、装有上述窄带干涉滤光片的电动滤光轮、导光管、聚光透镜、视频变焦镜头和单色 CCD 相机构建多光谱成像系统。该构建过程可参考 图 2 所示的光学元件布局。
注意：照明角度相对于样品表面约为 45°。 - 打开卤素灯光源，通过干涉滤光片、导光管和聚光透镜照射样品表面。
- 启动 CCD 相机的操作软件。
2. 动物准备
注意：在本方案中，大鼠未用于后续实验， multispectral 成像测量完成后立即被处死。
- 用一根管子将诱导室的进气口连接至麻醉机的出气口，再用另一根管子将诱导室的出气口连接至麻醉机的进气口。
- 将大鼠放入诱导室，使用5.0%异氟烷诱导麻醉。维持麻醉深度至大鼠对脚趾夹捏无反应。通过麻醉机上的旋钮将异氟烷浓度降至2.0%。
- 将大鼠头部固定于立体定位仪中，并将麻醉用咬合器连接至立体定位仪。
- 用一根管子将咬合器的进气口连接至麻醉机的出气口，再用另一根管子将咬合器的出气口连接至麻醉机的进气口。
- 使用电动剃毛器剃除头部切口区域以外的毛发，直至皮肤表面暴露清晰。
- 使用手术刀沿头部中线做一条长约20 mm的纵向切口（图1(a)），暴露皮下结缔组织（图1(b)）。
- 使用锐利的刮匙或镊子去除皮下结缔组织，并将其向头部两侧牵拉，以暴露颅骨（图1(c)）。
- 使用高速钻头在颅骨缝（冠状缝、矢状缝和人字缝）内侧的颅骨上钻出一个椭圆形凹槽（图1(d)）。
- 使用高速钻头缓慢且均匀地挖掘凹槽内部的颅骨。
- 当脑血管显现后，用镊子尖端轻压变薄颅骨表面，以评估骨质厚度和强度。若变薄区域易于下陷，则停止使用高速钻头进一步减薄颅骨。
- 使用镊子尖端或小型手术剪逐段剪开变薄颅骨的椭圆形边界。
- 用镊子缓慢而轻柔地将变薄的颅骨从脑表面移除。
- 用生理盐水轻轻冲洗颅窗，并用一块约0.1 mm厚的透明玻璃盖片覆盖其上。
3. 调节吸入氧浓度
注意：通过调节吸入氧浓度（FiO2）可改变呼吸状况。
- 使用一根管子，将 Y 形管连接器（连接器 1）的第一个端口连接至另一个 Y 形管连接器（连接器 2）的第一个端口。
- 将咬嘴的进气端口连接至管连接器 1 的第二个端口。
- 使用一根管子，将管连接器 1 的第三个端口连接至氧浓度监测装置。
- 使用一根管子，将管连接器 2 的第二个端口连接至麻醉机的出气端口。
- 使用一根管子，将管连接器 2 的第三个端口连接至气体混合装置的出气端口。
- 使用一根管子，将气体混合装置的一个进气端口连接至高压 95% O2 - 5% CO2 气体钢瓶。
- 使用一根管子，将气体混合装置的另一个进气端口连接至高压 95% N2 - 5% CO2 气体钢瓶。
- 通过气体混合装置上的旋转旋钮调节 O2 和 N2 的气体流速。
- 使用氧浓度监测装置检查并调节吸入氧浓度（FiO2）。
4. 多光谱漫反射图像的采集
- 参考图像的获取
注意：本实验中使用的光学元件，例如光源、光纤和探测器，均具有各自的光谱特性。因此，应记录光通过这些元件后的强度作为参考图像。参考图像是指在光源照射下，使用标准白色漫射板所采集的图像。- 将标准白色漫射板水平放置于载物台上。
- 通过旋转镜头筒上的变焦环，使相机镜头聚焦在白色漫射板表面。
- 在相机操作软件中，从积分时间下拉列表中选择合适的数值，调整相机的积分时间，使最强光信号产生的响应值约为最大计数值的75%。在观察像素值直方图的同时，调节积分时间，直至信号强度水平达到最大计数值的约75%。
- 从文件菜单中选择“保存”命令，将图像保存为文件。
- 通过旋转滤光轮来改变滤光片位置。
- 根据上述步骤，在其他波长下保存图像。文件名应标明样品和所用波长（例如，W500、W520、W540 … W760）。
- 样品图像的获取
注意：在九个波长下采集的大鼠暴露脑组织的漫反射光强度图像，使用相同的采集条件保存至个人计算机硬盘中。- 将大鼠轻柔地放置在载物台上，并缓慢调节载物台高度，使相机能够聚焦于大鼠脑表面。
- 从文件菜单中选择“保存”命令，将图像保存为文件。
- 通过旋转滤光轮来改变滤光片位置。
- 根据上述步骤，在其他波长下保存图像。文件名应标明样品和波长（例如，R500、R520、R540 … R760）。
- 暗图像的获取
注意：CCD相机可响应电信号产生光强度信号。然而，即使无光进入探测器，电路和探测器内部噪声仍会产生微弱输出，称为暗电流噪声。为了准确测量光的光谱强度，应记录暗电流成分作为暗图像，并从测量信号中减去。暗图像是指在光路被遮挡时采集的图像。- 关闭卤素灯光源。
- 使用遮光板阻断光路，防止光线进入CCD相机系统。
- 从文件菜单中选择“保存”命令，将图像保存为文件。文件名应标明样品（例如，Dark）。
5. 可视化血红蛋白含量和光散射参数
注意：一组多光谱漫反射图像被保存至个人计算机的硬盘中，并进行离线分析。随后，借助蒙特卡罗模拟19，对九个波长（500、520、540、560、570、580、600、730 和 760 nm）下的多光谱漫反射图像进行多元回归分析，以生成氧合血红蛋白浓度、脱氧血红蛋白浓度、总血红蛋白浓度、局部脑组织氧饱和度以及散射指数的二维分布图。相关详细算法已在文献中发表17,18。
- 在每个波长下，从参考图像和样品图像中减去暗图像。
- 在每个波长下，使用参考图像对样本图像进行归一化 λ将归一化后的图像视为漫反射图像 R.
- 计算吸光度（或光密度）图像 A 通过取漫反射图像倒数的对数 R 在每个波长下 λ:
(1) - 通过按波长顺序堆叠吸光度图像来生成一个三维矩阵，其中 x-y 平面显示了获得的大脑表面结构信息以及 z-轴表示光谱信息。
- 对吸收光谱进行多元回归分析 A(λ在每个 x-y 坐标处。
- 利用吸收光谱 A(λ) 作为因变量，以及氧合血红蛋白的摩尔消光系数光谱 εHbO (λ) 和脱氧血红蛋白 εHbR (λ）作为第5.5步的自变量（已发表的数值 εHbO (λ）和 εHbR (λ) 在文中提供 表1).
- 检查三个多元回归系数的二维图（图像） aHbO, aHbR，以及 a0.
- 通过按顺序堆叠多个回归系数的图像生成三维矩阵 aHbO, aHbR，以及 a0，其中的 x-y 平面显示了获得的大脑表面结构信息以及 z-轴表示多元回归系数。
- 计算氧合血红蛋白浓度 CHbO，脱氧血红蛋白浓度 CHbR，以及散射能力 b 从多重回归系数集合中 aHbO, aHbR 和 a0 在每个x-y坐标处，使用以下经验公式（he值 βHbO,i, βHbR,i，以及 β0,i (i = 0,1,2,3）在下文中提供 表2):
(2)
(3)
(4) - 检查氧合血红蛋白浓度的二维图谱（图像） CHbO，脱氧血红蛋白浓度 CHbR，以及散射能力 b.
- 计算总血红蛋白浓度的二维分布图 CHbT 通过求和 CHbO 和 CHbR 在每个 x-y 坐标
- 计算脑区氧饱和度的二维图谱 rSO2 通过分割氧合血红蛋白浓度 CHbO 总血红蛋白浓度 CHbT 在每个 x-y 坐标
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结果
代表性漫反射光谱图像，采集自 体内 大鼠脑组织如图所示 图3. 在500、520、540、560、570和580 nm波长下，图像清晰地显示了大脑皮层中密集的血管网络。而在600、730和760 nm波长下，血管与周围组织之间的对比度下降，这反映了血红蛋白在较长波长及近红外（NIR）波段对光的吸收能力降低。
图4展示了大鼠暴露脑组织的代表性估计图像，包括氧合血红蛋白浓度、脱氧血红蛋白浓度、总血红蛋白浓度、局部脑组织氧饱和度以及散射功率。与图3中较短波长下的漫反射图像所预期的一致，血管区域的总血红蛋白浓度高于周围组织区域。另一方面，由于动脉血中的血红蛋白氧合程度远高于静脉血，小动脉中的氧合血红蛋白浓度高于小静脉。因此，在局部氧饱和度的估计图像中，小动脉与小静脉的分布可以被清晰地区分开来。
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讨论
该方案中最关键的步骤是去除变薄的颅骨区域以制作颅窗；此操作应谨慎进行，以避免意外出血。这一步骤对于获得高质量、高准确度的多光谱漫反射图像至关重要。如果可能，建议在手术过程中使用体视显微镜。明胶海绵小块可用于止血。
本文所述的光学系统通过位于光源前方的干涉滤光片传递单色光。也可通过将滤光轮置于视频相机镜头或CCD相机前方来实现该配置。然而，若使用不同厚度的干涉滤光片，焦平面可能会发生变化，从而导致图像质量下降。当将记录电极插入皮层组织以进行电生理学测量（如局部电场电位测量）时，必须移除颅窗上的玻璃片。在此情况下，成像系统可能会检测到来自皮层表面的不希望出现的镜面反射。该问题可通过使用一组正交尼科尔（crossed Nicols）排列的偏振片来避免。
本文展示的传统多光谱成像装置在使用时较为耗时，因为滤光轮中的滤光片位置需通过机械方式切换。这意味着成像系统在不同波长点上依次逐个采集漫反射图像。由于这一限制，该系统难以捕捉快速的内在光学信号（IOSs），例如由神经元活动引起的反射光谱变化20
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作的部分研究得到了日本学术振兴会科学研究费补助金（C）（25350520、22500401、15K06105）以及美国陆军ITC-PAC研发项目（FA5209-15-P-0175）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 150 W 卤素灯光源 | 日本东京市，林手表制造有限公司 | LA-150SAE | |
| 光导管 | 日本东京市，林手表制造有限公司 | LGC1-5L1000 | |
| 收集透镜 | 日本东京市，林手表制造有限公司 | SH-F16 | |
| 500 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65088 | |
| 520 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65093 | |
| 540 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65096 | |
| 560 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #67766 | |
| 570 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #67767 | |
| 580 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65646 | |
| 600 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65102 | |
| 730 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #65115 | |
| 760 nm 干涉滤光片 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | #67777 | |
| 电动滤光轮 | 美国新罕布什尔州安多弗公司 | FW-MOT-12.5 | |
| 8位单色CCD相机 | 德国 THE IMAGINGSOURCE | DMK21BU618.H | |
| 视频变焦镜头 | Edmund Optics Japan Ltd，东京，日本 | VZMTM300i | |
| 99% 漫反射率的Spectralon白色标准板 | Labsphere 公司，美国新罕布什尔州北萨顿 | SRS-99-020 |
参考文献
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