脑血流动力学和的光散射特性的同步评估体内大鼠脑使用多光谱漫反射成像

摘要

脑血流和体内大鼠脑组织的光散射特性的同时评估用常规多光谱漫反射成像系统证明。

摘要

使用常规多光谱漫反射成像系统证明了脑血流动力学和体内大鼠脑组织的光散射特性的同时评估。该系统由宽带白光源、带有一组窄带干涉滤光片的电动滤光片轮、光导、收集透镜、视频变焦镜头和单色电荷耦合器件 （CCD） 相机构成。在异氟醚麻醉下，在大鼠的颅骨中制作一个椭圆形颅窗，以捕获皮质表面的体内多光谱漫反射图像。使用气体混合装置调节吸入氧的分数，可以诱导不同的呼吸状态，例如常氧、高氧和缺氧。然后对九个波长（500、520、540、560、570、580、600、730 和 760 nm）的测量多光谱漫反射图像进行基于蒙特卡洛模拟的多元回归分析，以可视化血流动力学的二维图和体内大鼠大脑的光散射特性。

引言

多光谱漫反射成像是用于获得在皮质组织固有的光学信号（IOSS）的空间图的最常用的技术。 IOSS在体内脑电波中所见的主要归因于三个现象:在光吸收的变化和由于皮质血流动力学散射特性，这取决于降低或线粒体细胞色素氧化在吸收变化和变型中通过形态学改变诱导的光散射特性^1。

在可见光（VIS）到近红外（NIR）的光谱范围内的光被有效地吸收，并通过生物组织散射。 体内脑的扩散反射光谱的特征在于，吸收和散射光谱。减小的散射系数μ在VIS到NIR波长范围内的结果的脑组织的_S'以单调散射光谱表现出在较长波长荷兰国际集团较小幅度。减小的散射系数μ频谱_S"（λ）可以近似为在幂律函数^2，3的形式为^{_{μS"（λ）=α×λ-b。}}散射能力b为在活组织^2,3与生物散射体的大小。组织和减少活皮层组织的生存能力的形态改变可影响生物散射体^{4，5，6，7，8，9}的大小。

多光谱漫反射成像光学系统，可以从白炽灯里容易地构建GHT源，简单的光学部件，和一个单色电荷耦合器件（CCD）。因此，各种算法和多光谱漫反射成像光学系统已被用来评估皮质血流动力学和/或组织形态^{10，11，12，13，14，15，16，17，18。}

这篇文章中描述的方法，被用于可视化两者血液动力学和体内使用常规多光谱漫反射成像系统的大鼠脑组织的光散射性质。这种方法比其它技术的优点是，以评估在两个脑血流和皮层组织时空变化的能力形态，以及它适用于各种脑功能障碍的动物模型。因此，该方法将是适当的创伤性脑损伤，癫痫发作，中风和缺血调查。

方案

动物保健，准备和实验方案是由东京农工大学的动物研究委员会的批准。对于这种方法，将大鼠圈养在受控环境中（24℃，12小时光照/黑暗周期），与食物和水可随意获得。

1.传统多光谱漫反射成像系统的构建

1. 摩9个的窄带光学干涉滤光器具有的中心波长500,520，540，560，570，580，600，730，和760纳米至机动滤光轮的过滤孔。
2. 构建使用宽带白色光源，机动滤光轮与上述组窄带干涉滤光片，光导，聚光透镜，视频变焦透镜，和一个单色CCD照相机的多光谱成像系统。光学元件，在图 2中所示的布局，可以被称为用于第是施工程序。
   注:照明的角度是大约45°相对于样品表面。
3. 转动卤素灯光源经由一个干涉滤光器，光导，和聚光透镜来照射样品的表面。
4. 打开CCD相机的操作软件。

2.动物的制备

注:在这个协议中，并没有用于未来的实验大鼠和它多光谱图像的测量后，立即处死。

1. 感应腔室的入口端口连接到麻醉机的与管出口端口。感应腔室的出口端口连接到麻醉机的进气口与第二管。
2. 放置老鼠进入吸气室和诱导具有5.0％异氟烷麻醉。在深度，使得老鼠并没有脚趾捏回应维持麻醉。大号奥尔〜2.0％异氟烷使用麻醉机上的旋钮。
3. 在立体定位框架固定所述大鼠头部。附上麻醉喉舌的立体框架。
4. 吸嘴的吸入口连接到麻醉机用管出口端口。吸嘴的出口端口连接到麻醉机用管入口端口。
5. 剃光头区域使用外推剪，直到出现在皮肤表面的预期切口部位。
6. 使形成纵向切口长大约20mm沿着所述头部的使用外科手术刀中线（ 图1（a））和暴露的皮下结缔组织（ 图1（b））。
7. 使用锋利刮匙或钳子去除皮下结缔组织并将其拉向头部两侧，以暴露颅骨（ 图1（c））。
8. 挖颅骨椭圆形沟颅sutur内es（冠状缝合，矢状缝合和羊角缝合）使用高速钻（ 图1（d） ）。
9. 使用高速钻机慢慢均匀地挖掘沟内的颅骨。
10. 用钳子的尖端轻轻地压在稀疏头骨的表面上，以估计脑血管出现后的骨厚度和强度。如果变薄的颅骨区域容易下压，则用高速钻机终止颅骨骨折。
11. 使用钳子或小手术剪刀切割瘦骨头碎片的椭圆形边界线。
12. 从脑表面缓慢地轻轻地使用钳子去除稀疏的头骨。
13. 用生理盐水轻轻沐浴颅窗，并用约0.1毫米厚的透明玻璃板覆盖。

3.调节启发氧的分数

注意:呼吸系统灰可以通过调节吸入氧的（ _吸入氧浓度）分数来改变。

1. 使用管，一个Y形管连接器（连接器1）的第一端口连接到另一个Y形管连接器（连接器2）的第一端口。
2. 吸嘴的吸入口连接到管连接器1的第二端口。
3. 使用的管，管连接器1的第三端口连接到一个氧浓度监视器装置。
4. 用管，管连接器2的第二端口连接到麻醉机的出口。
5. 使用的管，管连接器2的第三端口连接到一个气体混合物装置的出口端口。
6. 气体混合物装置的一个进气口连接到一个高压95％O ₂ - 5％使用管的CO ₂气体圆柱体。
7. 气体混合物的设备的另一入口端口连接到一个高压95％N ₂ -使用管5％CO ₂气瓶。
8. 改变气体的流速Ø˚FO ₂和N ₂使用气体混合物的设备上的旋钮。
9. 检查并使用氧浓度监视器装置调节_吸入氧浓度。

4.多光谱漫反射图像采集

1. 参考图像采集
   注意:在这个实验中使用的光学部件，例如作为光源，光纤，和检测器有自己的光谱特性。因此，光的通过这些部件通过了强度应记录为参考图像。参考图像是用来自光源的光照亮的标准白色扩散器所拍摄的图像。
   1. 放标准白色扩散板在舞台上水平。
   2. 通过在桶旋转变焦环聚焦白色扩散器的表面上的相机镜头。
   3. 通过选择适当的值来调整摄像头的积分时间下拉的积分时间列表中相机的操作软件，使最大的光量产生的信号是最大计数的约75％。一边看像素值的直方图，调整积分时间，直到信号强度电平是最大计数的约75％。
   4. 从文件菜单中的"保存"命令，将图像保存到文件中。
   5. 通过旋转滤光轮改变滤波器位置。
   6. 根据上述方法在其它波长保存的图像。文件名应识别样品和使用的波长（ 例如，W500，W520，W540 W760 ...）。
2. 样本图像采集
   注意:在9个波长暴露的大鼠脑的漫反射光强度的图像被捕获并保存使用相同的采集条件的个人计算机的硬盘驱动器上。
   1. 轻轻地放在将R在舞台上，慢慢调整阶段水平，使相机可以对焦的大鼠脑的表面上。
   2. 从文件菜单中的"保存"命令，将图像保存到文件中。
   3. 通过旋转滤光轮改变滤波器位置。
   4. 根据上述方法在其它波长保存的图像。文件名应识别样品和波长（ 如，R500，R520，R540 R760 ...）。
3. 深色图像采集
   注:CCD照相机可以响应于电信号产生的光强度。然而，有一些小的输出由于在电气电路和检测器噪声，即使光不进入到检测器;这就是所谓的暗电流噪声。为了精确测量光的光谱强度时，暗电流成分应记录为暗图像，然后从所测量的信号中减去。黑暗的图像是取n，其中的光路阻断。
   1. 关闭卤素灯光源。
   2. 阻挡光路，以利用屏蔽板的CCD摄像系统。
   3. 从文件菜单中的"保存"命令，将图像保存到文件中。文件名应确定，样品（ 例如，暗）。

5.可视化血红蛋白含量和光散射参数

注:一组多光谱漫反射的图像保存到个人电脑的硬盘驱动器和离线分析。通过在9个波长（500，520，540，560，570，580，600，730，和760纳米）的多光谱漫反射图像的蒙特卡罗模拟¹⁹辅助的多回归分析然后进行以可视化的二维氧化血红蛋白浓度，脱氧血红蛋白浓度，总血红蛋白浓度，局部脑氧饱和度，和SCAT的地图的TeringBay动力。具体算法已发表在文献^17，18。

1. 来自两个参考图像，并在每个波长处的样本图像中减去暗图像。
2. 在每个波长λ归一化由基准图像的样本图像。治疗的归一化的图像作为漫反射率图像R。
3. 通过取在每个波长λ的漫反射率图像R的倒数的对数计算的吸光度（或光密度）图像A:
   （1）
4. y平面示出了用于在脑表面所获得的结构信息，而z -轴示出光谱信息-通过在它们的波长的顺序，其中x堆叠的吸光度图像生成的三维矩阵。
5. PErform在每个xy坐标的吸收光谱A（λ）多元回归分析。
6. 使用的吸收光谱A（λ）作为因变量和氧合血红蛋白的摩尔消光系数光谱_εHbO2的 （λ）和脱氧血红蛋白_{εHBR（λ）}作为用于步骤5.5的独立变量（公布值_εHbO2的 （λ）和_{εHBR（λ）}在表1中提供）。
7. 检查三个多重回归的二维地图（图像）系数a _HBO， 一个_HBr和一个 _0。
8. 通过堆叠多重回归系数的图像的次序的_HBO， 一个_HBr和一个 _0，生成的三维矩阵，其中该y平面示出了用于在脑表面，而z轴所获得的结构信息示出了多重回归系数。
9. 计算氧合血红蛋白浓度C _HBO，脱氧血红蛋白浓度C _HBr和从该组的多个回归系数a _HBO， 一个_{HBr和 0}在每个xy坐标使用以下经验式（他值β的散射电压B _{HBO，I，βHBR，i}和_β0，I（I = 0,1,2,3）在表2中提供）:
   （2）
   （3）
   （4）
10. 检查氧化血红蛋白浓度C _HBO，脱氧血红蛋白浓度C _HBr和散射功率B的二维地图（图像）。
11. 计算由求和_ÇHbO2的和C _HBR在每个x总血红蛋白浓度C _HBT的二维地图- y坐标。
12. y坐标-通过在每个x除以氧化血红蛋白浓度C _HbO2的由总血红蛋白浓度C _HBT计算局部脑氧饱和度RSO ₂的二维地图。

结果

从体内大鼠脑获取的漫反射的代表性光谱图像示于图3中的图像，在500，520，540，560，570和580nm处清楚地看到血管的密集网络在大脑皮层。的血管，在600，730中的图像中观察到的周围组织，和760纳米之间的对比度恶化反射光中的时间更长，NIR波长下吸收血红蛋白。

图4示出了暴露的大鼠脑的用于氧化血红蛋白浓度，脱氧血红蛋白浓度，总血红蛋白浓度，局部脑氧饱和度，和散射功率代表估计的图像。如从漫反射图像预期在较短波长在图3中，在血液中的VES的总血红蛋白浓度SEL区域比在周围组织区域更高。在另一方面，在小动脉氧合血红蛋白浓度比在静脉由于动脉血液中的血红蛋白比静脉血更多含氧较高。因此，小动脉和小静脉的分布可以清楚地区域的氧饱和度的所估计的图像中区别开来。

讨论

在这个协议中最关键的步骤是去除减薄头骨区域，使颅窗口的;这应该小心进行，以避免意外出血。这个步骤是为了获得高品质的多光谱扩散高精度反射图像重要。建议手术过程如果可能的话，使用立体显微镜。明胶海绵小块止血有用。

这篇文章中描述的光学系统穿过位于所述光源的前面的干涉滤光器的单色的光。这可以通过将所述滤光轮在摄像机镜头或CCD摄像机的前面进行修改。在这种情况下，然而，焦平面可以是可变的，如果使用具有不同厚度的干涉滤光器，而这将造成图像质量的恶化。有必要从颅窗口取出玻璃板如果记录电极插入到皮质组织为电生理学测量，如电局部场电位的测量。在这种情况下，成像系统可以检测到来自皮质表面不期望的镜面反射。可以通过使用一组偏振板用正交尼科耳排列，可以避免此问题。

在这篇文章中展示了传统的多光谱成像设备是有点费时使用，由于在轮上的滤波器的位置被机械地改变。这意味着，所述成像系统捕获的每个漫反射图像依次以不同的波长点。由于此限制，该系统是不充分捕捉快速IOSS，如在反射光谱由于神经元的活动²⁰的变化。虽...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
150 W 卤素灯光源	Hayashi Watch Works Co.， Ltd，日本东京	LA-150SAE
光导	Hayashi Watch Works Co.， Ltd，日本东京	LGC1-5L1000
收集镜头	Hayashi Watch Works Co.， Ltd，日本东京	SH-F16
涉滤光片 l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd，日本东京#	65088
干涉滤光片 l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#65093
干涉滤光片 l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#65096
涉滤光片 l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#67766
干涉滤光片 l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#67767
干涉滤光片 l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#65646
干涉滤光片 l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#65102
干涉滤光片 l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#65115
干涉滤光片 l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd， Tokyo， Japan	#67777
电动滤光片轮	美国新罕布	FW-MOT-12.5
8 位单色 CCD 相机	THE IMAGINGSOURCE，德国	DMK21BU618。H
视频变焦镜头	Edmund Optics Japan Ltd，日本东京	VZMTM300i
Spectralon 白色标准，具有 99% 漫反射率	Labsphere Incorporated，北萨顿，新罕	SRS-99-020