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使用 体外 利用活细胞成像技术探究脂质纳米颗粒递送的化疗药物

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DOI：

10.3791/55405

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2017年11月1日

 , 
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

本文内容

摘要

活细胞成像是一种用于可视化动态过程的强大工具。对固定细胞的观察仅能提供静态图像，可能导致对过程的误解和混淆。本研究介绍了一种用于在活细胞中研究脂质体纳米颗粒的摄取、药物释放及细胞内定位的方法。

摘要

传统的成像技术可以提供有关细胞过程的详细信息。然而，这些信息基于在一个动态系统中的静态图像，因此容易忽略或误解连续的动态过程。活细胞成像和延时显微镜技术能够以近乎连续的方式对活细胞进行数小时甚至数天的追踪观察，因此具有很高的信息价值。本文所述的实验方案可用于研究化疗用纳米颗粒在活细胞中递送阿霉素（dox）后的去向。阿霉素是一种嵌入剂，必须从其纳米载体中释放出来才能发挥生物学活性。尽管阿霉素已在临床上使用超过二十年，但其摄取、降解及药物释放过程仍未被完全阐明。本文探讨了以下假设：基于脂质的纳米颗粒被肿瘤细胞摄取后会缓慢降解，释放出的阿霉素随后被转运至细胞核。为避免固定带来的假象，可采用本实验流程中描述的活细胞成像和延时显微镜技术。

引言

在活细胞和组织中追踪生物学过程（如细胞间相互作用、细胞间与细胞内运输、细胞毒性化合物摄取以及单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用）的能力在过去十年中受到广泛关注，因为它提供了额外的维度 "实时" 本文描述了一种追踪游离阿霉素（dox）及纳米颗粒载药阿霉素（Dox-NP）在细胞内命运的方法。

数十年来，纳米颗粒已被用于治疗某些癌症。阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）已获批准用于治疗艾滋病相关的卡波西肉瘤、晚期卵巢癌和乳腺癌以及多发性骨髓瘤1。它是最早开发并应用于临床的脂质体纳米颗粒之一。游离形式的阿霉素（dox）在血液中被迅速清除，限制了其到达肿瘤部位的足够剂量。此外，该药物治疗常伴随严重且剂量受限的副作用，例如口腔炎和心力衰竭。当其被包封于聚乙二醇化脂质体纳米颗粒中时，血液循环时间可从数分钟延长至数天2。这种含胆固醇的脂质体具有较高的稳定性，其稳定性决定了包封药物的药代动力学特性。

然而，这种刚性也存在缺点。化合物对肿瘤细胞的细胞毒性首先被评估 体外，且细胞毒性实验已表明，dox 的作用强于 Dox-NP3,4. 推测载体的稳定性阻碍了药物的释放和细胞摄取，值得进一步研究这一现象。脂质体固有的特性旨在抵御血液中的各种攻击性因素并完整到达肿瘤部位，但这也导致其细胞毒成分的生物利用度降低即， dox）在靶位点（即， 肿瘤细胞核）。尽管与游离形式相比，Dox-NP对治疗反应的改善有限，但仍具有临床价值，因为药物包封显著降低了心脏毒性作用5在随后的几年中，其他化合物被封装在纳米载体中6此外，对载体的修饰实现了药物的触发释放（即， 在肿瘤部位发挥作用，但在血液循环中保持稳定7,8尽管经过多年的深入研究和临床应用，诸如Dox-NP等纳米载体在肿瘤内部的命运仍未完全明确。在近期一项研究中发现，纳米颗粒以整体形式被细胞摄取，而其中的阿霉素（dox）则仍滞留在溶酶体中。9.

纳米颗粒的细胞摄取及药物释放是动态过程，最适合通过活细胞成像进行监测。此外，传统的组织学方法通常先孵育细胞再进行固定，但如果固定过程破坏了脂质体载体并引入人为假象，则可能导致错误结果。活细胞成像的主要要求是对目标过程进行可视化，最好通过荧光实现。某些化合物（如阿霉素，dox）具有内在的红色荧光。此外，可将荧光标记物引入载体中，同时利用活细胞标记物对细胞器进行可视化。通过这种方法，可以对一系列参数（如载体的摄取、药物释放以及载体和药物的细胞内定位）进行成像与分析。本文描述了一种实时追踪多种肿瘤细胞中阿霉素（dox）及其纳米颗粒制剂（Dox-NP）细胞内命运的方法。该方法还可轻松调整，以构建实现靶向（例如，带电荷的纳米颗粒10）和触发式（例如，热疗7）药物释放的理想条件。

方案

1. 准备

  1. 组装成像室，成像室由两部分组成。
    1. 将一个25 mm的盖玻片（图1A-1）放置在成像室的底部（图1A-2），然后将上部旋入底部（图1A-3）。切勿拧得过紧，以免玻璃破裂。对整个成像室进行高压灭菌（图1A-4）。
  2. 在无菌条件下，通过向不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%热灭活胎牛血清（FCS）和1 mM L-谷氨酰胺来制备细胞培养基。4 °C保存，使用前预热至37 °C。
  3. 采用标准细胞培养技术，使用细胞培养基在培养瓶中维持细胞生长。
    注：本实验中使用了两种小鼠细胞系，即黑色素瘤B16BL611和Lewis肺癌（LLC），以及两种人源黑色素瘤细胞系BLM和1F612。
  4. 称取明胶，加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37 °C条件下过夜溶解，配制成0.1%明胶溶液。使用0.22 µm滤器过滤除菌后，于4 °C保存。

2. 培养细胞

  1. 在超净工作台中从灭菌袋中取出成像腔室，小心拧紧腔室，并将其放入培养皿中。
    注意：为避免污染，在将腔室置于显微镜下之前，应始终将其保留在培养皿中。
  2. 在37 °C、5% CO2条件下，用1 mL 0.1%无菌明胶对成像腔室的玻璃表面进行包被，孵育20分钟。
    注意：这有助于细胞更好地贴附。
  3. 从细胞培养瓶中移除培养基（见步骤1.2和1.3），用1x PBS洗涤一次，使用0.25%胰蛋白酶消化使细胞脱落。加入细胞培养基以终止胰酶消化作用，收集细胞，在1,100 × g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于5 mL细胞培养基中。
  4. 取20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝混合（死细胞会摄取台盼蓝），使用血细胞计数板计数活细胞与死细胞数量；死细胞比例不应超过10%。
  5. 吸除明胶溶液，将细胞以适当稀释度接种，确保24小时内细胞覆盖率达到最多70%。例如，可使用5 × 104或10 × 104个细胞/1 mL的接种密度。将细胞置于5% CO2、37 °C条件下培养24小时，使其充分贴壁。

3. 时间序列显微镜（图2）

注意：此处使用了带有定制载物台支架的共聚焦显微镜，尽管大多数制造商提供多种适用于活细胞成像的培养箱，这些培养箱同样适用于纳米颗粒药物递送的研究。

  1. 在显微镜下评估细胞的融合度、细胞形态及污染情况。将培养腔放回 CO2 培养箱。
    注意：细胞融合度不应超过 70%。若细胞形态异常（即细胞无法贴壁）或检测到污染，请丢弃该成像腔。
  2. 打开共聚焦显微镜（图 1E-1）、荧光光源（图 1E-2）和计算机（图 1E-3）。
  3. 将镜头加热器连接至物镜，并设定为 35 °C（图 1E-4 + 插图）。
  4. 按照图 1B所示准备孵育装置。
    注意：该装置包括加热载物台（图 1B-1）、带 CO2 管路接头的流动载物台（图 1B-2）和 CO2 探针（图 1B-3），以及一个红色封闭贴片（图 1B-4）。该贴片用于在放置成像腔之前暂时封闭装置。
  5. 将孵育装置放置在显微镜载物台上，并连接进气和出气的 CO2 管路（图 1E-5）。打开主 CO2 阀门（图 1E-6），并开启 CO2 控制器（图 1E-7）。检查控制器是否设定为 5% CO2。
    注意：为实现湿度控制，CO2 气体需通过加湿器（图 1E-8）。对于缺氧实验，系统中还包括一个独立的 O2 调节器（图 1E-9）。
  6. 将载物台温度设定为 37 °C（图 1E-10）。对于高温实验，将温度设定为 42 °C。使孵育装置达到设定的温度和 CO2 浓度。
  7. 从主 CO2 培养箱中取出成像腔，并将其置于培养皿中运送至显微镜室。
  8. 将成像腔（图 1A-4）放入定制的直径为 35 mm 的载物台支架（图 1A-5）中，并用定制的密封盖（图 1A-6）封闭成像腔。
    注意：该盖子允许 CO2 通过，同时防止蒸发和污染。
    1. 打开孵育装置，用成像腔替换红色贴片，并关闭装置（图 1C）。此操作应尽快完成，以避免细胞冷却。确保载物台与显微镜之间无电缆卡住。
  9. 让装置平衡适应环境 30 分钟。
  10. 打开软件并开启激光器。
    注意：本实验中使用了 488 nm 氩离子激光器、543 nm 氦-氖激光器和 633 nm 氦-氖激光器。
  11. 点击“文件”选项卡下的 "新建" 创建一个新的数据库。为数据库命名并保存。
  12. 点击“采集”选项卡下的 "配置" 设置参数。选择 "通道模式" 和 "单轨" 以检测单一荧光染料，或选择 "多轨" 用于多个荧光染料。选择与荧光染料匹配的带通滤光片（例如，dox 和 Dox-NP 使用 560 至 615 nm 带通滤光片；更多示例见“代表性结果”部分）。在其中一个轨道中选择明场通道。
  13. 点击“采集”选项卡下的 "扫描" 设置扫描控制。点击 "模式" 设置帧尺寸（1,024 × 1,024）、扫描速度（最优）、扫描方向（8 位，单次）和扫描平均次数（4）。点击 "通道" 设置针孔（200 µm）、增益和偏移（例如，580、700 和 835；见 图 3），以及激光功率（488 = 10%，543 = 100%，633 = 100%）。
  14. 点击“配置”选项卡中的 "配置" 保存这些设置，并将其保存至配置数据库中。
  15. 点击“宏”选项卡中的 "多时间点 X"（图 1D）设置时间序列。点击 "单个位置"。
  16. 为保持细胞聚焦，点击 "自动对焦" 在宏中选择自动对焦功能。
    注意：自动对焦通过 633 nm 激光利用玻璃表面的反射作为参考点实现。
  17. 点击 "单轨" 或 "多轨"，在配置数据库中滚动至所需配置，设置时间间隔（例如，15 分钟）、扫描次数（例如，97），然后点击 "加载配置" 应用已保存的配置。
    注意：使用这些参数，将生成一个 97 × 15 分钟 = 24 小时的时间序列。
  18. 在 "基础文件名" 中为时间序列命名，并通过点击 "图像数据库" 选择数据库（步骤 3.11 创建）。通过点击 "临时图像文件夹" 设置临时文件夹。
    注意：若系统因任何原因停止或崩溃，图像将保存在此文件夹中。
  19. 打开孵育装置，提起成像环，在物镜上滴加一滴浸油，然后尽快关闭装置。对焦并选择成像腔中的一个位置。
    注意：该位置应包含单层细胞，融合度至少为 70%，以便对单个细胞进行成像。
  20. 检查背景的配置设置，并根据需要进行调整。
    注意：可通过降低增益或激光功率来校正背景。任何配置更改均需保存（见步骤 3.17）并在宏中重新加载（见步骤 3.18）。
  21. 在超净工作台中，用细胞培养基将游离药物或纳米颗粒稀释至药物浓度为 5 µg/mL 或脂质浓度为 0.05 µmol。若药物/纳米颗粒未灭菌，需通过 0.22 µm 注射器滤器过滤。
  22. 打开孵育腔，提起密封盖，移除细胞培养基，加入 1 mL 稀释后的药物/纳米颗粒，然后尽快关闭装置。
  23. 对细胞进行对焦，并在“多时间点 X”宏中点击 "开始时间" 启动时间序列采集。
  24. 定期检查细胞是否仍处于聚焦状态，或使用自动对焦功能（见步骤 3.16）。程序会自动将时间序列保存至数据库；运行过程中请勿关闭数据库。

4. 数据分析

  1. 根据原始研究问题，使用 ImageJ 等软件程序进行数据分析（示例见结果部分）。

结果

已有关于使用不同标记物对脂质体载体进行标记的描述9。本文展示了用远红染料二辛基十八烷基四甲基吲哚三羰花青高氯酸盐（DiD；Ex = 644 nm；Em = 665 nm）或绿色染料1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)（CF-PE；Ex = 490 nm；Em = 515 nm）标记的载体。为了揭示不同肿瘤细胞间在脂质体摄取、释放及细胞内定位方面的共性与差异，本研究选取了多种肿瘤类型进行分析，包括两种小鼠来源的肿瘤细胞系：B16BL6黑色素瘤11和Lewis肺癌（LLC），以及两种人源黑色素瘤细胞系：高转移性黑色素瘤（BLM）和非转移性黑色素瘤（1F6）12,13。所有实验均在活细胞中进行。实验中，分别使用5 µg/mL游离阿霉素（dox）、5 µg/mL阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）或0.05 µmol纳米颗粒处理细胞，作用时间为3小时或24小时。所检测和分析的阿霉素（以游离、释放、包封、隔离或嵌插形式存在）均统称为DXR。成像采用40X油镜（数值孔径：1.3），CF-PE和溶酶体标记物（LM）-绿色信号使用488 nm氩离子激光器（10%/0.2 mW功率）激发，并通过505至550 nm带通滤光片采集；阿霉素（dox）、Dox-NP和溶酶体标记物-红色信号使用543 nm氦氖激光器（100%/0.2 mW功率）激发，并通过560至615 nm带通滤光片采集；DiD信号使用633 nm氦氖激光器（100%/0.5 mW功率）激发，并通过640 nm长通滤光片采集。

由于其封装特性， 体外 阿霉素的细胞毒性、生物利用度和药代动力学均发生了显著改变3,9,14游离形式与包封形式给药时药物生物利用度的差异在下文中得到证实 图3Dox 是一种嵌入剂，必须进入细胞核才能发挥细胞毒性作用。 图3 以及相关的视频1和2展示了在相同条件下用dox或Dox-NP处理的BLM细胞的3小时延时成像。在接触dox数分钟内，即可观察到细胞核内的DXR信号（图 3A，视频1）并以较低增益（插图）可见其在细胞核内嵌入。相比之下，当暴露于Dox-NP时，在此时间段内几乎无法观察到细胞内的DXR图3B，电影2）。只有通过增加光电倍增管增益，才能观察到细胞质中的DXR（插图）。使用ImageJ对细胞质和细胞核中DXR的像素密度进行分析。由于在延时评估过程中细胞处于运动状态，因此必须将荧光图像与明场图像结合。这使得能够追踪单个细胞，并利用ImageJ中的特定插件稳定XY漂移。在下述分析中 图3，使用明场图像在细胞质（实线）和细胞核（虚线）周围绘制感兴趣区域（ROI）。ImageJ 中的 ROI 管理器可在菜单项“分析”中找到 > 工具 > ROI 管理器。这些 ROI 用于荧光图像中，通过“分析”菜单项分析像素密度 > 测量。细胞核内像素密度与细胞质内像素密度的差值图3C) 和细胞质（图3D) 对经dox或Dox-NP处理的细胞的定量分析结果与图像中观察到的现象一致。此外，细胞与dox或Dox-NP共孵育24小时后，更换为新鲜培养基，并立即以提高光电倍增管增益灵敏度的方式进行成像。图4）。其他设置（如激光功率、偏移、针孔和图像显示）均保持一致。与多柔比星（dox）处理的细胞相比，Dox-NP处理细胞中较低的DXR信号十分显著。当增益设为700时，Dox-NP处理细胞中的DXR信号变得可见，而多柔比星处理组的图像已过度曝光。这一简单 体外 该实验直观展示了游离药物与包封药物在生物利用度上的显著差异。

当细胞持续暴露于Dox-NP中24小时后，DXR会随着时间逐渐积累，如图5A及影片3和4所示。荧光信号首先在细胞质中增强，随后DXR也出现在细胞核内并发生嵌插。这些现象可通过像素密度图进一步证实（图5B）。由于细胞内分布的差异，BLM细胞的细胞质像素密度测量值低于1F6细胞。在1F6细胞中，DXR在整个细胞内分布较为均匀；而在BLM细胞中，DXR则更集中于靠近细胞核的一个细胞器中（图5C）。

因此，药物与载体在不同细胞系中的定位（图6) 进行了研究。细胞与Dox-NP/DiD共孵育24小时后进行成像。根据明场图像，在三种不同细胞系的荧光图像上叠加绘制出细胞膜（实线）和细胞核（虚线）。结果显示，以DiD标记的载体与DXR在细胞质内的分布模式一致：在BLM细胞中集中于靠近细胞核的某一细胞器内，在LLC细胞中围绕整个细胞核分布，在B16BL6细胞中则随机分散于整个细胞质中。在细胞核内仅可见DXR而无DiD信号，表明阿霉素已从载体中释放。通过降低光电倍增管增益，可观察到含有DXR及以DiD和CF-PE标记的载体的单个细胞囊泡图6B 和 6C可以看到。

胞质内的阿霉素（DXR）被隔离在小囊泡中，细胞用绿色或红色的活细胞溶酶体标记物进行标记。这些溶酶体在细胞内的运动可以被追踪（视频5）。胞质中的DXR与纳米载体在这些结构中共定位，细胞间DXR分布模式的差异如图6所示，在此进行解释。溶酶体在B16BL6细胞中随机分布于胞质中，而在BLM细胞中则位于细胞核附近（图7A）。使用ImageJ软件计算DXR与载体在溶酶体内的共定位情况（图7B）。将彩色图像转换为二值图像（Process > Binary > Make Binary），然后利用共定位插件（Analyze > Colocalization）生成DXR与DiD的共定位图像。该方法生成一幅绿-红-白三色图像，其中白色像素代表两幅图像中重叠的像素。通过菜单项Process > Binary > Make Binary，可将白色像素分离并转化为黑色像素，并测量其像素密度（Analyze > Measure）。随后，生成该DXR-DiD图像与溶酶体标记物（LM）二值图像之间的共定位图像，并测量像素密度。共定位数据表示同时对DXR-DiD和DXR-DiD/溶酶体标记物呈阳性的像素所占百分比（图7C）。此外，使用CF-PE和DiD双重标记的载体定位于溶酶体中，这一点也在图7D中得到证实。

用于声学成像的超声显微镜装置；仪器、控制面板、分析工作站。
图1：仪器与设备装置。 A) 成像室及相关配件。25 mm #1 盖玻片（1），腔室底部（2），腔室顶部（倒置放置）和O形圈（3），载物台支架（4），以及密封盖（5）。比例尺：2 cm。B) 培养单元。加热显微镜载物台（1），带CO2进/出流通道的流动腔室（2），CO2探针（3），以及封闭补片（4）。比例尺：2 cm。C) 显微镜下观察到的培养单元中的成像室。D) 多时间序列宏。E) 成像设备。倒置显微镜（1），荧光光源（2），计算机（3），环形加热器（4，插图）和控制器（4，主图），CO2流路管（5），CO2阀门（6），CO2控制器（7），CO2加湿器（8），O2阀门及控制器（9），以及载物台温度控制器（10）。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜工作流程图；设置包括激光器、成像室、纳米颗粒和时间推移法。
图 2：方案第 3 节中详述的显微镜参数示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

荧光显微镜图像，阿霉素摄取；曲线图显示随时间变化的像素强度。
图3：研究阿霉素（dox）及其纳米颗粒（Dox-NP）的短期摄取情况。 BLM细胞持续暴露于阿霉素（dox）或Dox-NP中3小时，并进行延时成像。（A）与阿霉素（dox）共同孵育的细胞延时图像的静态截图。（B）与Dox-NP共同孵育的细胞延时图像的静态截图。比例尺 = 50 µm。（C）经阿霉素（dox）和Dox-NP处理的细胞中细胞核内DXR的像素密度增加情况。（D）经阿霉素（dox）和Dox-NP处理的细胞中细胞质内DXR的像素密度增加情况。数据表示每视野3个细胞的平均值 ± 标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示BLM、1F6、LLC细胞中DXR摄取的荧光显微镜图像；与明场对比。
图4：在不同细胞系中研究阿霉素（dox）和阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）的长期摄取情况。将细胞暴露于dox或Dox-NP中，24小时后进行成像。图像在药物去除后立即采集，并采用三种不同的增益设置。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

通过共聚焦显微镜分析细胞摄取；图表显示随时间变化的像素密度；BLM 与 1F6 对比。
图5：研究脂质体药物的细胞摄取与释放。 细胞持续暴露于Dox-NP中24小时，并进行时间延时成像。（A）时间延时图像的静态截图。比例尺 = 50 µm。（B）细胞核与细胞质中DXR的像素密度随时间增加。数据表示每视野3个细胞的平均值 ± 标准差。（C）显示DXR在细胞内定位的图像。实线：细胞膜；虚线：细胞核。请点击此处查看该图的放大版本。

分析药物分布的荧光显微镜图像；DXR（Dox-NP）、DiD、CF-PE 通道。
图6：研究药物与载体在不同细胞系中的定位。 （A）细胞经Dox-NP/DiD处理24小时后成像。比例尺 = 50 µm。（B）细胞经Dox-NP/DiD/CF-PE处理24小时后成像，采用较低强度增益以区分单个囊泡。（C）明场与DXR叠加图像，显示DXR位于胞质囊泡中（箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

溶酶体细胞共定位分析；荧光显微镜图像、二值共定位、图表
图 7：药物与载体在细胞内的定位研究。 细胞分别暴露于 Dox-NP/DiD 或 CF-PE/DiD 中 24 小时，使用活细胞溶酶体标记物（LM）以绿色或红色显示溶酶体。(A) DXR 与载体（DiD）在细胞内的定位。箭头表示 DXR 与 DiD 定位于溶酶体中的三个示例。比例尺 = 50 µm。(B) 使用 ImageJ 对 DXR 与载体（DiD）在溶酶体（LM）中的共定位进行分析。(C) DXR 与载体在溶酶体中共定位的百分比。数据表示三次独立实验的平均值 ± 标准误。(D) 使用两种不同标记物可视化载体在溶酶体中的滞留。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像；红色染色细胞；细胞结构分析；比例尺：50 μm。
视频 1：关联于 图 3： BLM 细胞与柔红霉素孵育 3 小时。 时间序列：共 19 张图像，拍摄间隔为 10 分钟。帧速率为 3 fps。比例尺 = 50 µm。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

荧光显微镜图像，70分钟时的细胞分析，突出显示红色染色的细胞结构。
视频 2：关联于 图 3：BLM细胞与Dox-NP孵育3小时。 时间序列：共19张图像，间隔10分钟。帧速率为3帧每秒。比例尺 = 50 µm。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

荧光显微镜；细胞成像；蛋白质表达分析；6小时时的荧光发射。
视频 3：关联于 图 5：BLM 细胞与 Dox-NP 共同孵育 24 小时。时间推移：共采集 96 幅图像，时间间隔为 15 分钟。帧速率为 8 fps。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该视频。（右键可下载。）

显示红色荧光蛋白表达的细胞培养物荧光显微镜图像。
视频 4：关联于 图 5：1F6 细胞与 Dox-NP 共同孵育 24 小时。 时间序列：共 96 幅图像，拍摄间隔为 15 分钟。帧速率：8 帧/秒。比例尺 = 50 µm。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

荧光显微镜图像，细胞蛋白定位，绿色发射分析。
视频 5：关联于 图7： 使用活细胞标记物对B16BL6细胞的溶酶体进行染色。 时间序列：共10张图像，间隔10秒。帧率：3帧/秒。比例尺 = 50 µm。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）

讨论

正如以往观察到的，固定过程几乎会立即破坏脂质体纳米载体 ，而从这些被破坏的脂质体中释放出的阿霉素（DXR）仍有足够时间进入细胞核，这使得数据的解读变得极为困难，甚至产生误导。通过一些显微镜参数的调整，可常规地在活细胞和组织中研究化疗药物的命运，以验证或推翻组织学观察结果。最近一项研究利用活细胞延时成像技术，展示了游离型和包载型阿霉素（dox）处理细胞后，DXR的摄取、释放及定位过程9。本文更详细地描述了该实验装置。利用该模型，可以直观地观察到阿霉素被迅速转运至细胞核，并在其中持续积累，直至细胞最终死亡。相比之下，当使用Dox-NP时，仅在细胞核中检测到少量释放的阿霉素。尽管持续暴露会导致DXR不断积累，但Dox-NP处理组细胞中的荧光信号明显低于游离dox处理组，表明其细胞内浓度及后续细胞毒性存在差异。此外，通过使用活细胞标记物发现，在细胞暴露于Dox-NP时，DXR与纳米载体均定位于溶酶体中。这表明完整的脂质体被细胞摄取，并揭示了这些纳米颗粒的摄取过程涉及内吞途径。细胞核中的DXR显然来源于已释放的阿霉素。然而，由于该方法显示DXR与载体共定位且似乎被滞留在溶酶体中，目前尚不能确定溶酶体内的是包载状态还是已释放的阿霉素。有可能是纳米颗粒本身的固有稳定性导致其在溶酶体定位时抑制了阿霉素的释放。

在本方案中，使用特定的显微成像系统进行活细胞成像，配备定制的载物台支架（规格可应要求提供）。然而，大多数共聚焦显微镜制造商均提供多种适用于活细胞成像的培养箱。维持细胞培养条件（即， 温度，CO2pH、湿度和无菌性）是这些培养箱的主要性能指标，需通过初步测试来确定合适的培养条件，相关内容将在下文进一步说明。同一制造商还可提供自动数据采集程序。 "多位置" 该选项可实现对同一培养腔内多个位置进行成像，从而提升统计分析的精确性。然而，本文所述宏程序中的此选项需要固定的XYZ坐标，因而丧失了对Z轴漂移进行校正的可能性。虽然可在该宏中加入对Z轴维度的扫描，并采用焦平面进行分析，但这需要额外的扫描步骤，可能增加光毒性和荧光淬灭的风险。

与所有荧光检测一样，过曝是一个需要关注的问题，尤其是在比较两种细胞摄取能力不同的化合物时。荧光强度不仅取决于化合物本身的固有信号，还受到摄取速率、浓度以及药物作用时间的影响。如图3所示，经阿霉素（dox）处理的细胞中细胞核内的DXR信号已清晰可见，而在Dox-NP处理的细胞中则未观察到信号。只有通过提高增益才能观察到Dox-NP处理细胞中的DXR信号，但这会导致dox处理组细胞出现过曝现象。此外，即使在细胞内，Dox-NP的分布也是不均一的，这可能导致不可避免的曝光不足或过曝。特别是在研究细胞内DXR滞留情况时，需显著降低增益以区分单个细胞器（图5B 和 图5C）。因此，基于像素密度的定量结果必须结合代表性图像进行综合解读，以确保结果解释的准确性。

光毒性、荧光淬灭以及低信噪比也是荧光显微镜技术中的重要问题，必须在图像质量与图像采集之间取得平衡。然而，即使显微镜设置处于最佳状态，图像质量仍在很大程度上取决于细胞的质量以及所添加化合物的性质。DXR可产生强烈的荧光信号，只要采取适当预防措施，即使在较长时间（长达72小时）后也未观察到荧光淬灭现象。然而，荧光信号的减弱也可能由外排作用引起。外排作用是药物耐药性中的一个重要现象。15 当细胞将药物从细胞内作用位点泵出时会发生此现象。因此，随时间推移荧光信号的减弱也可能是柔红霉素外排的结果。9通过比较实验结束时未扫描位置的荧光信号与延时成像序列的最后一张图像，可证明光漂白现象即， 信号在未扫描位置会更高）或外排（即， 两个信号将完全相同）。多种校正选项（例如， 背景、漂移、漂白 等等。) 可在 ImageJ 等程序中获取16此外，由于荧光强度随时间逐渐增强，可在预实验中预先评估配置参数，以尽量减少延时成像结束时的过度曝光（步骤 3.21）。或者，也可使用已用药物处理目标时长的细胞样本的成像腔来初始化设置。最后，对于此类分析，应避免使用具有毒性的药物浓度（步骤 3.22），并事先通过常规生物测定方法确定适宜浓度。

细胞需在不含酚红的培养基中持续培养和维持。酚红在光谱的红色区域具有荧光特性，可在细胞器（最可能是溶酶体）中被观察到，从而产生假阳性信号（步骤 1.2）。为了便于对单个细胞进行监测，细胞汇合度不应超过 70%（步骤 3.1）。CO2 流速（步骤 3.5）应在设备购置或维护后通过验证实验进行调节。若流速过高，培养基会蒸发；若流速过低，培养基的 pH 值将升高，从而影响细胞生长。由于培养基中不含酚红 pH 指示剂，pH 的变化无法被直接观察，因此容易被忽视。一旦完成 CO2 流速的验证，这些设定参数可在后续所有实验中沿用。

利用本文所述方法，可通过活细胞成像和延时显微镜技术方便地研究纳米颗粒的命运。本实验中使用了市售的纳米颗粒。然而，热敏性17、阳离子脂质体10；富含短链鞘脂的脂质体18；以及包载其他药物的纳米颗粒8,19，也已通过该方法在肿瘤细胞和正常细胞中进行了研究。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

所使用的显微镜设施隶属于伊拉斯谟光学成像中心，我们谨向光学成像中心工作人员提供的技术支持表示感谢。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM（无酚红）SigmaD1145添加 1 mM L-谷氨酰胺和 10 % 胎牛血清
胰蛋白酶-versene（EDTA）LonzaBE17-161E
胎牛血清SigmaF752455 ºC 加热灭活 30 分钟
L-谷氨酰胺LonzaBE17-605E
牛皮明胶SigmaG9391用 PBS 配制 0.1% 溶液，无菌
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaD8537
Stericup 0.22 µm 滤器 - 500 ml MilliporeSCGPU05RE
台盼蓝SigmaT8154
细胞：Lewis 肺癌肉瘤ATCCCRL-1642
细胞：B16BL6Dr. P. Brouckaert，根特大学捐赠参考文献10
细胞：BLM 和 1F6Dr. van Muijen，奈梅亨大学捐赠参考文献11
培养皿Greiner664160
多柔比星Actavis 文中简称为 dox
Doxil/CaelyxJanssen-Cilag文中简称为 Dox-NP
注射器滤器 0.2 µmVWR international10462200
Lysotracker-绿色 DND-26InvitrogenL7526文中简称为溶酶体标记物（LM）-绿色
Lysotracker-红色 DND-99InvitrogenL7528文中简称为溶酶体标记物（LM）-红色
Attofluor 细胞环InvitrogenA7816
盖玻片 25 mm #1Thermo scientificCB00250RA1
载物台支架 + 密封盖定制
ZEISS LSM 510 显微镜Zeiss
软件 LSM 510 版本 3.2 SP2Zeiss
Image JNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/index.html

参考文献

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