前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。
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摘要
摘要
随着对疾病机制理解及生物标志物发现的需求日益增长，需要分析大量的生物样本。能够同时检测多个样本的定量蛋白质组学策略已得到广泛应用，显著降低了实验成本和时间。本实验室开发了一种名为前体同位素标记与等重标记联用（combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging, cPILOT）的技术，该技术增强了传统同位素标记或等重标记方法的样本多重分析能力。全局cPILOT可应用于来源于细胞、组织、体液或完整生物体的样本，并提供不同样本条件下蛋白质相对丰度的信息。cPILOT的工作原理包括两个步骤：1）在低pH缓冲条件下选择性地对肽段N端进行二甲基化；2）在高pH缓冲条件下使用商业化的等重试剂对赖氨酸残基的伯胺进行标记（见材料/试剂表）。可用的样本多重分析程度取决于所使用的前体标记种类和等重标记试剂的类型。本文展示了一种12重分析方法，结合轻型和重型二甲基化标记与六重等重试剂，用于在单次分析中检测来自小鼠组织的12个样本。增强的多重分析能力不仅有助于减少实验时间和成本，更重要的是，能够在多个样本条件（如生物学重复、疾病阶段、药物处理、基因型或纵向时间点）之间进行比较，从而降低实验偏差和误差。在本研究中，采用全局cPILOT方法分析了阿尔茨海默病小鼠模型和野生型对照组的脑、心脏和肝脏组织在生物学重复间的差异。全局cPILOT还可用于研究其他生物学过程，并可进一步优化以实现超过20个样本的多重分析。
引言
蛋白质组学通常涉及对大量样本的分析，以更深入地理解疾病过程、酶动力学、翻译后修饰、对环境刺激的响应、对治疗干预的响应、生物标志物的发现或药物作用机制。可采用定量方法来测量不同样本间蛋白质水平的相对差异，这些方法可以是无标记的，也可以涉及同位素标记（代谢标记、化学标记或酶法标记）。稳定同位素标记方法因其能够同时分析多个样本，并适用于来自不同细胞、组织、体液或完整生物体的样本，而日益受到青睐。同位素标记方法1,2,3,4,5,6,7能够提高实验通量，同时减少数据采集时间、成本和实验误差。这些方法利用前体离子质谱图，通过肽段峰来测量蛋白质的相对丰度。相比之下，等压标记试剂8,9,10会产生报告离子，这些报告离子在MS/MS或MS3 11....
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方案
伦理声明：小鼠购自一家独立的非营利性生物医学研究机构，并饲养于匹兹堡大学实验动物资源部。所有动物实验方案均经匹兹堡大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 蛋白质提取及用于化学标记的肽段制备
- 从组织、细胞或体液中提取蛋白质。
- 使用机械匀浆器将60–90 mg组织（例如脑、心脏和肝脏）在含8 M尿素的磷酸盐缓冲液（1× PBS）中匀浆（500 µL）。如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本项目中未使用此类抑制剂。匀浆参数如下：使用裂解基质A珠子，速度4 m/s，时间20 s。心脏组织可能需要最多9个匀浆循环。
注意：如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本研究中未使用。- 将组织匀浆液从裂解管中取出，转移至微量离心管中。用100–500 µL含8 M尿素的PBS冲洗裂解管，并将冲洗液与组织匀浆液合并。
- 将匀浆后的组织在9,447 × g、4 °C条件下离心15分钟，并收集上清液。
- 使用机械匀浆器将60–90 mg组织（例如脑、心脏和肝脏）在含8 M尿素的磷酸盐缓冲液（1× PBS）中匀浆（500 µL）。如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本项目中未使用此类抑制剂。匀浆参数如下：使用裂解基质A珠子，速度4 m/s，时间20 s。心脏组织可能需要最多9个匀浆循环。
- 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。
注意：若蛋白质浓度过高，可能需要用缓冲液进一步稀释。本实验中这些组织样品的最终浓度介于6–13 µg/µL之间。
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结果
cPILOT 采用基于胺基的化学方法，在肽段的N端和赖氨酸残基上进行化学标记，从而增强样本多重检测能力。 图2 展示了来自阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组脑、心脏和肝脏组织的12重cPILOT分析所获得的代表性质谱数据。如图所示 表1本12重分析中包含阿尔茨海默病小鼠和野生型小鼠的两个生物学重复。 图2A 显示一对双电荷峰，其间隔为 m/z 4 的间距表明肽段中引入了一个单二甲基基团。该对中的轻链和重链二甲基化峰被分别独立地进行隔离，并通过 CID 进行碎裂。每种二甲基化肽段的 MS/MS 数据如图所示 图2B 和 C搜索结果表明，这对峰属于 T(二甲基)ELNYFAK(同量异位素标签)6) 蛋白质磷酸甘油酸激酶1的肽段。强度最高的碎片离子为 y3+ 这与轻链和重链的二甲基化峰相似。这些峰进一步被用于HCD-MS分离3 .......
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讨论
cPILOT 可实现对 12 个以上不同样本的同时检测。为确保肽段的 N 末端和赖氨酸残基均能成功标记，必须为每组反应设置合适的 pH 值，并优先进行肽段标记的二甲基化反应。通过将 pH 控制在约 2.5（±0.2），可实现对 N 末端的选择性二甲基化。该方法利用了赖氨酸侧链氨基与肽段 N 末端氨基 pKA 值的差异。在 pH 2.5 条件下，赖氨酸残基处于非活性状态（pKA ~10.5）；然而，若 pH 呈弱酸性（即 pH 5–7）或碱性，则 N 末端和赖氨酸残基均会被二甲基化。此外，若在低 pH 条件下先进行等重标记，则 N 末端将被等重标签标记，而赖氨酸残基则被二甲基化。这可能导致在 MS3 分析中可选的碎片离子减少，因为需要选择 b 离子。与商业化的等重试剂相比，二甲基化反应的成本相对较低。虽然每 100 µg 样本可使用一整瓶等重试剂，但我们此前已成功使用每 100 µg 样本仅用半瓶试剂，且标记效率相当。这显著降低了单次 cPILOT 实验的成本，使可分析的样本数量增加。还需注意，其他等重标记试剂也可替代本方案中使用的等重试剂，我们此前已有验证14<.......
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致谢
作者感谢匹兹堡大学的启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）R01 资助（GM 117191-01）对 RASR 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水 - 质谱级 | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L 的量并非必需 |
| 乙腈 - 质谱级 | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L 的量并非必需 |
| 乙酸 | J.T. Baker | 9508-01 | |
| 氨水溶液（28 - 30%） | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| 甲酸铵 | Acros Organics | 208-753-9 | |
| 甲酸 | Fluka 分析 | 94318-250ML-F | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce 赛默飞世尔科技 | 23227 | |
| 尿素 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0731 | |
| Tris | 伯乐（Biorad） | 161-0716 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 碘乙酰胺（IAM） | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich，化学 | 168149-25G | |
| 经TPCK处理的牛胰蛋白酶 | Sigma Aldrich，生命科学 | T1426-100MG | |
| 甲醛（CH2O) 溶液；H 中含 36.5 - 38%2O | Sigma Aldrich，生命科学 | F8775-25ML | |
| 甲醛（13CD2O) 溶液；20 wt % 于 D2O，98 原子％ D，99 原子％ 13C | Sigma Aldrich，化学 | 596388-1G | |
| 氰基硼氢化钠；试剂级，95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| 氰基硼氘化钠；96 原子% D，98% 化学纯 | Sigma Aldrich，化学 | 190020-1G | |
| 强阳离子交换（SCX）离心柱样品制备试剂盒 | Protea BioSciences | SP-155-24试剂盒 | |
| 三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液 | Sigma Aldrich，生命科学 | T7408-100ML | |
| 等压标签试剂盒（TMT 6重标记）— 6次反应（1 × 0.8 mg） | 赛默飞世尔科技 | 90061 | |
| 盐酸羟胺 | Sigma Aldrich，化学 | 255580-100G | |
| 标准涡旋混合器 | Fisher Scientific | 2215365 | 任何混匀器均可使用 |
| Oasis HLB 1 cc（10 mg）萃取小柱 | Waters | 186000383 | 这些是 C18 盒式装置 |
| Visiprep SPE 真空萃取装置，DL（一次性衬管），24 孔型号 | Sigma Aldrich | 57265 | 12 端口型号也足够使用 |
| Speed-vac | 赛默飞世尔科技 | SPD1010 | 任何品牌的真空浓缩仪均可满足要求 |
| 水浴室 | 赛默飞世尔科技 | 2825/2826 | 任何品牌的 温度可控的水浴装置即可满足要求。 |
| 机械匀浆器（即 FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D 超高效液相色谱系统配备 Nano LC AS-2 自动进样器 | Sciex | - | 此型号已不再提供。任何配备自动进样器的纳米液相色谱仪均可满足需求。 |
| LTQ Orbitrap Velos 质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | - | 此型号已不再提供。其他高分辨率仪器（例如 Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos 均可使用。 |
| 蛋白质软件例如 Proteome Discoverer | 赛默飞世尔科技 | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | AL54 | |
| 磁力搅拌器 | VWR | 12365-382 | 任何品牌的磁力搅拌器均可满足要求 |
| pH计（Tris兼容） | Fisher Scientific（Accumet） | 13-620-183 | 任何品牌的pH计均可使用 |
| pH 10 缓冲液 | Fisher Scientific | 06-664-261 | 任何品牌的pH 10缓冲液均可满足要求 |
| pH 7 缓冲液 | Fisher Scientific | 06-664-260 | 任何品牌的pH 7缓冲液均可满足要求 |
| 1.5 mL 离心管，500 个/包 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 任何品牌的 1.5 mL 离心管均可使用 |
| 0.6 mL 离心管，500 个/包 | Fisher Scientific | 04-408-120 | 任何品牌的 0.6 mL 离心管均可使用 |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV 离心滤过装置 | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL 微量离心管，72 个单位 | 赛默飞世尔科技 | 69720 | |
| C18 填充材料（5 µ米，100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | 此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足要求 |
| C18 填充材料（5 µ米，200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | 此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足需求 |
参考文献
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.
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