方法文章

分析柱状和层状结构中的树突形态

DOI：

10.3791/55410

⸱

2017年3月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文展示了如何分析果蝇（Drosophila）髓质神经元在神经小柱和层状结构中的树突投射。该工作流程包括一种双视角成像技术，以提高图像质量，以及一系列计算工具，用于追踪树突分支、将树突结构配准至参考小柱阵列，并在三维空间中分析树突结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在中枢神经系统的许多区域，如果蝇视叶和脊椎动物大脑皮层，突触环路以层状和柱状结构排列，以促进发育过程中的脑连接以及成熟动物的信息处理。不同类型的突触后神经元在特定层内以类型特异性的模式形成树突，与适当的突触前末梢形成连接。果蝇髓质神经网由10层和约750个柱状结构组成；每个柱状结构均接受超过38种不同类型髓质神经元的树突支配，并以类型特异性的方式与大约7种传入神经元的轴突末梢相匹配。本报告详细描述了对髓质神经元树突进行成像和分析的操作流程。该工作流程包括三个部分：（i）双视角成像部分，将两个正交方向采集的共聚焦图像堆栈合并，生成树突的高分辨率三维图像；（ii）树突追踪与配准部分，在三维空间中追踪树突分支结构，并将树突轨迹注册至参考柱状阵列；（iii）树突分析部分，针对柱状和层状结构分析树突分布模式，包括树突分支在特定层的终止特征及其平面投射方向，并估算树突分支频率和终止频率。该技术方案利用基于开源MIPAV（医学图像处理、分析与可视化）平台开发的自定义插件，以及基于矩阵实验室语言（matrix laboratory language）开发的自定义工具箱。上述方法共同构成了一套完整的分析流程，可用于研究果蝇（Drosophila）髓质神经元在层状与柱状结构中的树突投射规律，识别细胞类型，并鉴定突变体中的结构缺陷。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在发育过程中，神经元会形成复杂但具有高度保守特征的树突分支模式，以与其突触前伙伴建立突触连接。树突的分支模式与神经元的身份和功能密切相关。树突树的分布位置决定了其所接收的突触前输入类型，而树突分支的复杂程度和树突野的大小则决定了输入信号的数量。因此，树突的形态学特性是决定突触连接性和神经元信息处理能力的关键因素。在许多复杂脑区中，例如果蝇视叶和脊椎动物视网膜，突触环路以柱状和层状结构组织，以促进信息处理1,2。在这种柱-层结构中，特定感觉模态的突触前神经元会将其轴突投射至特定的层（即所谓的层特异性靶向），并形成有序的二维阵列（即所谓的拓扑图谱）；而突触后神经元则在特定层内延伸出适当大小的树突，以接收正确类型和数量的突触前输入。尽管轴突对层和柱的靶向机制已被广泛研究3,4，但对于树突如何被引导至特定层，并扩展出适当大小的感受野以与正确的突触前伙伴建立连接，目前仍知之甚少5。对树突在层和柱结构中的靶向过程进行成像和定量分析的技术困难，阻碍了柱状和层状脑结构中树突发育的研究。

Drosophila 视叶神经元是研究柱状和层状结构中树突投射路径及神经环路组装的理想模型。果蝇视叶神经组织以三维晶格形式组织，包含10个层和约750个柱状结构。每个柱状结构由一组传入神经支配，包括光感受器R7/R8以及视网膜下神经节细胞L1-L5，这些神经元的轴突终末以层特异性方式形成拓扑图谱6。每个视叶柱中存在约38种不同类型的视叶神经元，它们在特定层内形成树突，并具有适当的树突野大小，以接收这些传入神经的输入信号7。视叶中的突触环路已在电子显微镜水平上完成重构，因此其突触连接关系已明确建立7,8。此外，目前已开发出多种可用于标记不同类型视叶神经元的遗传工具9,10,11。通过研究三类跨视叶神经元（Tm神经元，即Tm2、Tm9和Tm20），我们先前鉴定了两种细胞类型特异性的树突特征：（i）Tm神经元的树突在平面内朝向前方或后方投射（平面投射方向），该方向取决于细胞类型；（ii）视叶神经元的树突在特定视叶层终止，且具有细胞类型特异性（层特异性终止）12。平面投射方向和层特异性终止足以区分这三种Tm神经元类型，而干扰Tm神经元对层和柱线索响应的突变则会影响这些特征的不同方面。

本文介绍了一种完整的分析Drosophila（果蝇）视叶外髓神经元在柱状与层状结构中树突形态的实验流程（图1）。首先，我们展示了一种双视角成像方法，该方法利用定制软件将两组共聚焦图像堆栈进行融合，生成高质量的各向同性图像。该方法仅需常规共聚焦显微镜即可获得高质量图像，从而可靠地追踪树突分支，无需依赖STED（受激发射损耗）或结构光照明显微等超分辨率成像技术。其次，我们介绍了一种用于追踪树突树并将其神经突轨迹注册至参考柱阵列的方法。第三，我们展示了计算分析方法，用于提取树突在平面投影方向上的分布特征、特定层内的终止模式，以及估算树突分支频率和终止频率。综合这些方法，可实现对树突三维模式的表征、基于树突形态的细胞类型分类，以及在突变体中识别潜在的形态缺陷。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：本实验方案包含三个部分：双视角成像（第1-3节）、树突追踪与配准（第4-6节）以及树突分析（第7-9节）（图1）。代码和示例文件见材料/设备表。

1. 双图像采集

注意：此步骤旨在以两个正交（水平和冠状）方向获取目标神经元的两组图像序列。

  1. 按照先前所述方法准备果蝇脑组织，其中稀疏标记了髓质神经元（约每脑半球10个细胞），并表达膜定位的GFP标记物（mCD8GFP）12。使用兔抗GFP抗体（用于标记髓质神经元树突）和小鼠单克隆抗体mAb24B10（用于标记光感受器轴突）作为一抗，并用荧光二抗（Alexa 488标记的抗兔抗体和Alexa 568标记的抗鼠抗体）进行染色，具体步骤如前所述13。将脑组织置于含70%甘油的1×PBS中透明处理。
  2. 为以水平方向（图2A、B）封片，将经甘油透明处理的果蝇脑转移至载玻片中央的20 µL抗荧光淬灭封片剂液滴中。
  3. 在盖玻片的四个角上粘附小块黏土，以防止封片过程中盖玻片压碎脑组织样本。
    注意：黏土小块起到缓冲作用，避免压碎样本。每块黏土直径应约为1 mm。
  4. 在解剖显微镜下，将脑组织调整为腹面朝上位置，并将盖玻片轻轻覆盖其上以固定样本。利用脑组织凸起的背侧表面作为解剖标志，确定脑样本的方向（图2A）。
  5. 使用共聚焦显微镜获取第一组图像序列（水平视角）。采用高数值孔径物镜（如63倍、1.3 N.A.的甘油或油浸物镜），设置2.5倍数字放大（像素大小为0.105 µm/像素；平均扫描次数为2）。采集超过180个光学切片（512 × 512像素），步长为0.2 µm，确保覆盖整个髓质神经 Neuropil 区域。
  6. 按照步骤1.3–1.4重新封片，但将脑组织调整为前面朝上方向（前视视角）。
  7. 对同一神经元，按照步骤1.5获取第二组图像序列（前视视角）。
    注意：当视叶中标记了大量神经元时，识别同一神经元可能具有挑战性。为从两个方向准确匹配同一神经元，可能需要获取两个视角下的低倍图像序列（例如，使用0.7倍放大，步长0.45 µm，采集低分辨率图像序列）。若图像大于512 × 512像素，在图像合并前应裁剪至512 × 512，且在拍摄大视野时保持像素大小为0.105 µm/像素。深层组织成像时可能出现信号衰减问题。若信号较弱，可优先成像脑组织的腹侧半部。为减少扫描过程中的光漂白，应尽可能使用最低的激光功率。在采集图像序列前，使用范围指示器检查是否存在过曝现象。如条件允许，建议使用配备GaAsP检测器的共聚焦显微镜。
  8. 记录目标神经元相对于髓质神经 Neuropil 的位置（左右[R/L]和背腹[D/V]方向）。通过检查图像序列判断样本在成像过程中是否发生移动。
    注意：样本移动通常由封片不当引起。若发生移动，则该图像序列无法用于后续配准，应予以弃用。需重新封片并对同一神经元重新采集图像序列。

2. 图像去卷积

注意：去卷积步骤使用图像去卷积软件来恢复因模糊和噪声而质量下降的采集图像。虽然此步骤为可选，但能显著提高图像质量。建议在第3节的图像配准和合并中使用去卷积后的图像堆栈。

  1. 以交互模式启动反卷积程序。在主窗口中选择菜单：文件/打开（或按 Ctrl+O），加载图像堆栈（lsm 格式或特定显微镜格式）。
  2. 单击以选择已加载的图像堆栈，然后选择菜单：Ops 以打开图像操作窗口。使用默认设置 经典最大似然估计（CMLE）算法
  3. 在图像操作窗口中，单击 "参数" 输入镜头浸没介质的相应参数（例如， 油，甘油 等等.)，包埋介质（例如， 浸油 等等。）和数值孔径（NA；此处使用1.3）。检查其余参数，确保其准确反映成像条件。点击 "设置所有已验证" 按 Tab 键以确认参数设置。
  4. 在图像操作窗口中，单击 "操作" 选项卡。指定输出目标（例如， c). 输入相应的数字 "每通道信噪比" (例如， "12 12 12 12" 是一个良好的起点，而默认设置为 "20 20 20 20"）。其余参数使用默认设置。
  5. 点击 "运行命令" 按制表符开始反卷积图像堆栈；此过程可能需要数十分钟才能完成，具体时间取决于计算机性能。
  6. 在主窗口中，单击并选择去卷积后的图像堆栈。选择菜单：文件另存为，将去卷积后的图像以 ICS 图像文件格式（.ics 和 .ids）保存。
    注意：每个图像堆栈包含两个文件：ics 文件包含头部信息，ids 文件包含原始图像信息。
    1. 根据成像方向重命名图像堆栈文件例如， 将水平视角的图像堆栈命名为 H.ids 和 H.ics，将正面视角的图像堆栈命名为 F.ids 和 F.ics。

3. 双视角图像组合

注意：此步骤使用 MIPAV 软件将两个图像堆栈合并，以生成高分辨率的三维图像。

  1. 生成图像组合的矩阵。
    1. 启动 MIPAV 程序。通过选择菜单：文件/从磁盘打开图像 (A)（或按 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids，加载 H 和 F 图像序列；窗口将显示两幅图像。
    2. 单击 H 图像以选中它，然后选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度；窗口将显示 GrayG、GrayB 和 GrayR 图像。
    3. 关闭 GrayR 和 GrayB，仅在窗口中保留 GrayG。
    4. 单击 F 图像以选中它，然后选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度；窗口将显示 GrayG1、GrayB1 和 GrayR1 图像。
    5. 关闭 GrayR1 和 GrayB1，仅在窗口中保留 GrayG1。此时，窗口中仅剩 GrayG 和 GrayG1。
    6. 选中 GrayG（高亮显示），选择菜单：算法/配准/优化自动图像配准；将弹出"优化自动图像配准 3D"对话框。
      1. 在输入选项中，将"自由度"从默认的"仿射-12"更改为"特定重缩放-9"。在"旋转"部分，将"旋转角度采样范围"设为 -105 至 105（默认：-30 至 30 度），"粗略角度增量"设为 10（默认：15 度），"精细角度增量"设为 3（默认：6 度）。
    7. 点击确定；第一个矩阵"GrayG_To_GrayG1.mtx"将生成并保存在图像文件夹中。关闭所有图像窗口，进入下一步；此步骤至少需要 15 分钟。
    8. 通过选择菜单：文件/从磁盘打开图像 (A)（或按 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids，重新加载 H 和 F 图像序列，操作同步骤 3.1.1。
    9. 单击 H 图像以选中它，然后选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度；将弹出"RGB->灰度"对话框。点击确定；窗口将显示"HGray"图像。保留 HGray 并关闭 H 图像。
    10. 对 F 图像重复步骤 3.1.9；窗口将显示"FGray"图像。保留 FGray 并关闭 F 图像；此时窗口中仅剩 HGray 和 FGray。
    11. 选中 HGray 图像（高亮显示），进入菜单：算法/变换工具/变换；将弹出"变换/重采样图像"对话框。点击"重采样"选项卡，并将重采样目标尺寸从"HGray"更改为"FGray"。接着点击"变换"选项卡，并通过选择"从文件读取矩阵"加载"GrayG_To_GrayG1.mtx"。点击确定；窗口将显示 HGray_transform 图像。关闭 HGray 图像，使窗口中仅剩 HGray_transform 和 FGray。
    12. 选中"HGray_transform"图像（高亮显示），进入菜单：算法/配准/优化自动图像配准；将弹出"优化自动图像配准 3D"对话框。在"旋转"部分，将"旋转角度采样范围"设为 -5 至 5（默认：-30 至 30 度），"粗略角度增量"设为 3（默认：15 度），"精细角度增量"设为 1（默认：6 度）。点击确定。
      注：仿射矩阵（HGray_transform_To_FGray.mtx）将生成并保存在图像文件夹中，同时窗口将显示"HGray_Transform_register"图像。此步骤至少需要 40 分钟。
    13. 关闭"HGray_transform"图像；此时窗口中仅剩"HGray_Transform_register"和"FGray"。
    14. 选中"HGray_Transform_register"图像（高亮显示），进入菜单：算法/配准/B-Spline 自动配准 2D/3D；将弹出"B-Spline 自动配准-3D 强度"对话框。在成本函数中选择"最小二乘法"（默认为相关比）。
      1. 点击"执行两阶段配准"。在第一阶段部分，将"梯度下降最小化步长（采样单位）"设为 2（默认为 1），将"最大迭代次数"设为 10（默认为 10）。在第二阶段部分，将"梯度下降最小化步长（采样单位）"设为 1（默认为 0.5），将"最大迭代次数"设为 2（默认为 10）。
        注：非线性变换矩阵"HGray_transform_register.nlt"将保存在图像文件夹中，同时窗口将显示"HGray_transform_register_registered"图像。此步骤至少需要 5 分钟。
    15. 关闭窗口中的所有图像。
  2. 生成图像组合的参考图像。
    注：此步骤旨在生成用于组合的已配准水平图像。
    1. 通过选择菜单：文件/从磁盘打开图像 (A)（或按 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids，加载 H 和 F 图像序列；窗口将显示两幅图像。
    2. 选中 H 图像（高亮显示），进入菜单：算法/变换工具/变换；将弹出"变换/重采样图像"对话框。点击"重采样"选项卡，并将重采样目标尺寸从"H"更改为"F"。接着点击"变换"选项卡，并通过选择"从文件读取矩阵"加载"GrayG_To_GrayG1.mtx"。点击确定；H_transform 图像将出现在窗口中。关闭 H 图像，但保留 H_transform 和 F 在窗口中。
    3. 选中"H_transform"图像（高亮显示），进入菜单：算法/变换工具/变换；将弹出"变换/重采样图像"对话框。点击"重采样"选项卡，并将重采样目标尺寸从"H_transform"更改为"F"。接着点击"变换"选项卡，并通过选择"从文件读取矩阵"加载"HGray_transform_To_FGray.mtx"。点击确定；"H_transform_transform"图像将出现在窗口中。关闭 H_transform 图像；此时窗口中仅剩 H_transform_transform 和 F。
    4. 选中"H_transform_transform"图像（高亮显示），进入菜单：算法/变换工具/非线性变换；将弹出"非线性 B-Spline 变换"对话框。接着加载"HGray_transform_register.nlt"并点击确定；"H_transform_transform_registered"图像将出现在窗口中。将该图像保存为 ics 文件。关闭窗口中的所有图像。
  3. 合并图像序列
    注：此步骤旨在将两个在正交方向（水平和前位）采集的图像序列合并为一个高分辨率图像序列。
    1. 进入菜单：插件/通用/Drosophila 视网膜配准；将弹出"Drosophila 视网膜配准 v2.9"对话框。在图像 H 中上传"H.ics"，在图像 H-已配准中上传步骤 3.2.4 生成的"H_transform_transform_registered"，在图像 F 中上传"F.ics"，在变换 1-绿色（可选）中上传步骤 3.1.7 生成的"GrayG_To_GrayG1.mtx"，在变换 2-仿射中上传步骤 3.1.12 生成的"HGray_transform_To_FGray.mtx"，在变换 3-非线性（可选）中上传步骤 3.1.14 生成的"HGray_transform_register.nlt"。
      1. 在"将 H 重缩放至 F"中选择“SqRt(Intensity-H × Intensity-F)”和“不重缩放”。其余参数保持默认设置。点击确定；此步骤大约需要 3 分钟。
        注：处理完成后将生成三组图像：combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids（最终重组图像）、greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS（H、F 和最终重组图像的绿色通道）和 redChannelsImage-Rxreg-Ry-Rcomp.ids（H、F 和最终重组图像的红色通道）；所有输出文件将被调整为 512 × 512 × 512 尺寸。
    2. 在图像可视化软件中打开"combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids"。将图像序列保存为 ims 格式并重命名文件；该重组图像文件将用于神经突追踪和配准。

4. 神经突起追踪与参考点分配

注意：此步骤旨在使用图像可视化软件追踪神经突（4.1）并为配准分配参考点（4.2）。

  1. 追踪神经突
    1. 启动图像可视化软件。打开重组后的图像文件。进入菜单：编辑/显示调整，关闭感光细胞通道（红色）。
    2. 可视化图像 "超越" 模式。打开 "立体" 并使用 "四缓冲区" 如果计算机配备了立体成像系统，可使用该模式来可视化三维图像。
    3. 转到菜单：Surpass/Filaments 以添加新的丝状结构。点击 "跳过自动创建，手动编辑" 表。
    4. 点击 "吸取" 标签并选择 "AutoDepth"
    5. 选择 "设置" 检查 "线，" 并输入合适的像素数值以获得更好的可视化效果（本方案中使用4像素的线条）。检查 "显示树突" "起始点，" 和 "分支点"设置 "渲染质量" 至 100%。
    6. 选择 "吸取" 点击标签并开始追踪神经突。首先追踪轴突，然后转向树突（图 2D）。透髓神经元的轴突和树突易于区分。
      注意：Tm 神经元从胞体延伸出轴突，并一直投射到高级视觉处理中心——髓样叶。系统将自动将第一条长纤维定义为轴突，其余较短的纤维定义为树突。在追踪过程中，起始点应保持在纤维（轴突）的起始端，并确保所追踪的神经突之间相互连接。检查分支点和起始点；如果树突未连接，系统将在未连接的纤维上重新定义一个新的起始点。
    7. 描记完成后，返回到 "设置" 取消勾选 "起始点" 和 "分支点，" 进入菜单：Surpass/导出选定对象../，将纤丝保存为 Inventor 文件 (*.iv)。
  2. 分配参考点
    1. 选择 "显示调节设置" 打开两个成像通道。在此示例中，通道1为感光细胞染色，通道2为Tm20神经元（GFP）。
    2. 转到菜单：Surpass/测量。选择 "编辑" 标签并检查 "特定通道：" （选择感光通道[红色]）
    3. 为顶层分配参考点。前往菜单：/Surpass/测量点以创建新的测量点。将 M1 层的起始位置标记为顶层。各点的顺序如下：赤道、前-赤道、前、前-腹侧、腹侧、后-腹侧、后、后-赤道和中心图 3F）；将与最多树突过程相关的光感受器定义为中心光感受器。
    4. 按照步骤 4.2.3 中的方法指定 R8 和 R7 层（图 3G）。应在步骤 4.2.3 和 4.2.4 中创建三个独立的测量点。
    5. 导出每层点的坐标。单击 "统计学" 标签，选择 "详细地，" "特定值，" 和 "位置；" 并单击 "将标签页显示中的统计信息导出至文件。" 保存为 "逗号分隔值" （*.csv）
    6. 打开三个 csv 文件（来自步骤 4.2.3–4.2.4），通过复制和粘贴将 27 个参考点的坐标合并到一个新的 csv 文件中（顺序为 Top、R8 和 R7）。参见 材料/设备表 并遵循示例文件的格式。

5. 刚体与TPS非线性配准

注意：此步骤旨在使用 MIPAV 程序将神经突轨迹（iv 格式）配准到参考柱状阵列，并生成配准后的 swc 文件。本步骤需要以下文件：来自步骤 3.3 的重组图像堆栈（.ids 文件）、来自步骤 4.2 的参考点文件（.csv 文件），以及来自步骤 4.1 的神经突轨迹丝状文件（.iv 文件）。

  1. 进入菜单：Plugins/Generic/DrosophilaStandardColumnRegistration。将弹出"DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1"窗口。
  2. 加载图像文件（.ids）、参考点文件（.csv）和纤维文件（.iv）。
  3. 每层选择9个点。
  4. 选择成像神经元的位置（LV/RD 或 RV/LD）。
  5. 分别选择"Rigid Registration and TPS"和"Rigid Registration"进行非线性配准和刚体配准。
  6. 勾选"Create SWC file"以生成以下输出文件：注册后的神经突迹线文件（swc格式，参见具体材料/设备中的定义）、注册后的IV文件（.iv）、标准化神经突的坐标（.txt）、变换后的坐标（.txt）以及合并后的图像（.ids）。
  7. 更改swc文件的名称。在文件名末尾添加位置缩写（步骤1.7）。例如，对于位于右侧髓质腹侧半部的Tm20神经元#3，使用文件名"Tm20_3_RV.swc"。

6. 标准化至右腹侧构型

注意：此步骤是使用自定义脚本将神经突迹线（swc 格式）转换为标准 RV（右腹侧）构型 "RV_standardization.m" 此处脚本使用矩阵实验室语言编写。输入的 swc 文件名称应遵循以下格式： "NeuronName_数量_配置.swc" (例如， Tm20_3_LV.swc

  1. 打开 "RV_standardization.m" 脚本
  2. 编辑以下参数 "用户输入" 部分：
    1. 输入神经元的名称，无需编号（例如， Tm2，Tm20 等等。) 在 "神经元名称"
      注意：默认情况下 "文件结尾" 是 "*.swc" 查找文件名中包含 "*.swc" ("*" 是通配符，用于匹配任意数量的字符）。默认值为 "swc_file_end_out" 是 "_f.swc" 这将增加 "_" 标准化后添加到文件名末尾。
    2. 指定 swc 文件所在的目录 "目录中"指定标准化文件将要存放的目录 "目录_swcout".
  3. 运行脚本。
  4. 可选：使用 Vaa3D14 可视化 swc 文件并验证转换结果。

7. 计算树突分支与终止频率

注意：此步骤使用刚体配准的 swc 文件来计算树突段在不终止的情况下达到特定长度的概率的 Kaplan-Meier 估计值。该脚本使用了 Dendritic_Tree_Toolbox 中的两个函数：extractDendriticSegmentLengthDistribution 和 estimateDendriticSegmentLengthProbability。

  1. 打开 "分支末端_P.m" 脚本
  2. 编辑以下参数 "用户输入" 部分：
    1. 指定刚体配准后的 swc 文件的路径 "pathToSWCFiles" (例如， /Rigid_Registered_swc/）。指定用于存储图形输出的路径 "输出路径" 指定神经元或神经类型的名称 "神经元名称" (例如， Tm2，Tm20 等等。).
  3. 运行脚本；输出结果为树突分支与终止的Kaplan-Meier估计曲线。
    注意：可选：应用函数拟合方法，从 Kaplan-Meier 估计量中提取树突段发生分支或终止的局部概率。

8. 绘制树突树层特异性终止分布图

注意：此步骤将不同髓质层中树突末端的分布以柱状图形式绘制。该方法可应用于单个神经元、一组神经元或多个神经元组。该脚本使用 Dendritic_Tree_Toolbox 中的 extractDistributionAlongAxis 函数。

  1. 打开 "Layer_term.m" 脚本
  2. 编辑以下参数 "用户输入" 部分：
    1. 指定包含非线性配准后 swc 文件的目录 "pathToSWCFiles" (例如， /非线性配准_swc/）。指定图形输出的目录 "输出路径" 指定神经元或神经类型的名称 "神经元名称" (例如， Tm2，Tm20 等等。).
  3. 运行教程脚本。输出结果为特定髓质层中终末节点比例的直方图。

9. 绘制树突的平面投射方向

注意：此步骤将树突的平面投影方向以极坐标图形式绘制。该脚本使用 Dendritic_Tree_Toolbox 中的 extractAngularDistribution 函数。

  1. 打开脚本 "Planar_proj.m"
  2. 编辑以下参数 "用户输入" 部分
    1. 指定包含非线性配准后 swc 文件的目录 "pathToSWCFiles" (例如， /Non_linear_Registered_swc/）。在 "输出路径" 指定神经元或神经类型的名称 "神经元名称" (例如， Tm2, Tm20 等等。).
  3. 运行脚本；输出结果为平面投影方向的极坐标图。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用本文介绍的双视角成像方法，对包含稀疏标记Tm20神经元的果蝇大脑在两个正交方向上进行了成像。成像前，大脑组织使用适当的初级和次级抗体进行染色，以可视化膜锚定型GFP和光感受器轴突。成像时，首先将大脑以水平方向安装（图2A，B），然后使用共聚焦显微镜对一个GFP标记的Tm20神经元及其周围的光感受器轴突进行成像（图3A）。随后，重新调整大脑的方向（图2A，B），并在额面方向上对同一个Tm20神经元再次成像（图3B）。在成像过程中，该Tm20神经元的位置被确定为位于右侧髓质神经 Neuropil 的腹侧半部（RV构型）。这两个图像堆栈通过图像去卷积软件进行去卷积处理，并使用MIPAV软件进行重组（图3C），从而生成重组图像堆栈（图3C'）。与任一原始输入图像堆栈相比，重组后的图像堆栈在轴向畸变方面显著减少（图3A'，B'）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文展示了如何对黑腹果蝇（Drosophila）髓质神经元的树突树进行成像与分析。第一部分“双视角成像”介绍了如何将两组图像堆栈去卷积并合并为一组高分辨率的图像堆栈。第二部分“树突追踪与配准”描述了将髓质神经元的树突进行追踪，并将其配准至参考柱状阵列的方法。第三部分“树突分析”阐述了如何利用自定义脚本分析树突的分布模式。上述实验方案共同构成了一套完整的工作流程，可用于提取树突在神经层和神经柱中的分布信息，并确定树突分支与终止的频率。

本文介绍的双视角成像方法在概念上类似于光片显微镜中实现的多视角成像技术，即通过正交采集两个或多个图像堆栈并将其重组，以实现高轴向分辨率17,18。然而，由于成像细长树突需要两个高数值孔径（N.A.）的物镜，而将这两个物镜正交配置在技术上具有挑战性。因此，双视角方法需要在两个连续步骤中对同一脑样本进行成像，并在两次成像之间重新调整样本方向。图像组合失败最可能的原因是在成像过程中样本发生移动，或在操作过程中样本被压扁。此外...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作得到了美国国立卫生研究院院内研究计划、尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（资助号 HD008913，授予 C.-H.L.）以及信息技术中心（P.G.M.、N.P.、E.S.M. 和 M.M.）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
软件
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging16.05 版，用于图像反卷积 （https://svi.nl）。商业软件
MIPAV7.3.0 版，用于图像重组和配准 （http://mipav.cit.nih.gov/）;免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		免费软件
MIPAV 插件： PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		免费软件
ImarisBitplane，用于追踪神经突和为图像配准分配参考点 （http://www.bitplane.com）;商业软件
Vaa3D用于可视化 swc 文件 （https://github.com/Vaa3D/release/releases/）;免费软件
MatlabMathworksR2014b，用于树突的形态测量分析（http://www.mathworks.com）;商业软件
Matlab 工具箱：TREES1.14v1.14用于分析树枝状形态参数（http://www.treestoolbox.org/download.html）;免费软件
Matlab 工具箱：Dendritic_Tree_Toolboxv1.0用于计算形态测量参数 （https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration）。免费软件
名称Company目录号评论
样本文件
SWC 文件定义http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
图像组合和套准https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
参考点示例 https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
名称Company目录号评论
计算机系统
MS Windows Windows 7 x64 或 Macintosh OS X 10.7 或更高版本3GHz 64 位四核处理器，16G RAM（最小）
可选：Quadro4000 （或更高版本）显卡Nvidia用于树突的立体可视化。
可选：NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
可选：用于 NVIDIA 120D vision2 的 3 Hz LCD 显示屏2http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
名称Company目录号>Comments
成像试剂
24B10 抗体The Developmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP Tag 抗体Thermofisher ScientificG10362
山羊抗兔 （H+L）、Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
山羊抗小鼠 （H+L）、Alexa Fluor 568Thermofisher ScientificA21124
VECTASHIELD抗淬灭安装介质Vector LaboratoriesH-1000
 粘土 FisherS04179
70% 甘油溶于 1x PBS
盖玻片中，高性能，D = 0.17 毫米蔡司474030-9000-000
，的代码和示例文件 ，安装

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743(2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MIPAV MATLAB

相关文章