本文介绍了一种优化的实验方案，用于制造微流控芯片以及建立微流控实验，以测量单个酵母细胞的寿命和细胞表型。
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本文内容
摘要
摘要
芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 是衰老研究中的重要模式生物。遗传学研究已发现许多在不同物种间对寿命具有保守作用的基因。然而，衰老和死亡的分子机制仍不明确。为了系统性地理解酵母衰老背后的分子机制，我们需要高通量的方法来测量寿命，并在单细胞水平上量化各种细胞和分子表型。此前，我们开发了微流控装置，可在整个母细胞寿命期间对其进行追踪，同时冲走新生的子细胞。本文介绍了一种制备微流控芯片及建立微流控实验的方法。该装置可利用多个通道同时追踪不同条件下或不同酵母菌株的细胞。典型的实验设置可实现每个通道数百个细胞的追踪，并在整个细胞寿命期间进行高分辨率显微成像。我们的方法还可对单个细胞的寿命、分子标记物、细胞形态以及细胞周期动态进行详细表征。此外，我们的微流控装置能够捕获大量新生的母细胞，这些细胞可通过后续的图像分析加以识别，从而实现更高精度的寿命测定。
引言
芽殖酵母是衰老研究中一种强大的模式生物。然而，传统的酵母寿命检测依赖于显微解剖，不仅劳动强度大，而且通量较低1,2此外，传统的显微解剖方法无法提供单个母细胞在衰老过程中各种细胞和分子特征的详细信息。微流控装置的发展使得测量酵母寿命以及追踪母细胞整个生命周期中的分子标记物和多种细胞表型成为自动化过程。3,4,5,6,7,8将酵母细胞载入微流控装置后，可在显微镜下通过自动延时成像进行追踪。借助图像处理工具，可提取多种细胞和分子表型特征。3,6,8包括寿命、大小、荧光报告基因、细胞形态、细胞周期动态 等等。其中许多信息难以甚至无法通过传统的显微解剖方法获得。自数年前成功开发以来，微流控装置已在酵母衰老研究中发挥重要作用3,4,6,7此后，多个研究团队相继发表了对早期设计的改进方案5许多酵母实验室已采用微流控装置进行相关研究。
在处于指数生长期的细胞培养物中，可供观察的衰老母细胞数量极少。因此，用于寿命测定的微流控装置的总体设计原则是保留母细胞并去除子代细胞。其中一种设计利用了酵母进行不对称细胞分裂的特性：装置中的结构可截留体积较大的母细胞，同时使较小的子代细胞被冲洗去除。本文所描述的微流控芯片采用柔软的聚二甲基硅氧烷（PDMS）垫（垂直悬柱）来捕获母细胞（图1）。类似设计的装置此前已有报道3,4,6,7。本实验方案采用更简化的微流控装置制备流程，以及一种优化后的细胞加载方法，适用于延时成像实验。微流控装置中的一个关键参数是用于捕获母细胞的PDMS垫的宽度。本装置采用更宽的PDMS垫，可在每个垫下保留更多的母细胞，其中包括大量新生母细胞，可对其整个生命周期进行追踪。除了寿命测定外，当需要对细胞进行多代追踪或必须完成整个生命周期观察时，本实验方案也适用于单细胞延时成像实验。
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方案
1. 硅片模具的制备
注意：光刻掩模使用 AutoCAD 软件设计，并由商业公司制造。该设计包含三层不同的图案（补充文件 1）。第一层、第二层和第三层的高度分别约为 4 µm、10 µm 和 50 µm。硅晶片模具通过软光刻技术由光刻掩模制备9,10。
- 将硅片在 200 °C 下烘烤 10 分钟，以蒸发水分。在硅片上旋涂负性光刻胶 SU-8。
注意：以5,000 rpm转速旋涂SU-8 3005 30秒，形成第一层；以3,000 rpm转速旋涂SU-8 2010 30秒，形成第二层；以2,000 rpm转速旋涂SU-8 3025 30秒，形成第三层。 - 在图案转移前对涂覆的晶圆进行软烘。将晶圆对准并曝光于 "直接接触" 使用掩模对准器进行模式化。
注意：第一层在 95 °C 下软烘 2 分钟，第二层在 95 °C 下软烘 3 分钟，第三层在 95 °C 下软烘 15 分钟。曝光剂量使用 100 mJ/cm²。2 对于第一层，130 mJ/cm2 用于第二层，以及 200 mJ/cm2 第三层。 - 曝光后，将晶圆进行后烘，并使用SU-8显影液进行显影。用N₂吹干晶圆2 用枪吹干，并在 200 °C 下硬烤晶圆 30 分钟。
注意：使用透明胶带将硅晶片模具固定在直径为15 cm的塑料培养皿上，图案面朝上。通常，我们在同一模具上放置多个相同的芯片结构，以便同时制备多个微流控芯片。每个模具可重复使用多次以制备微流控芯片。
2. 微流控芯片制备
- 将一个洁净的称量舟放在天平上，并对天平进行去皮归零。向称量舟中倒入 50 g PDMS 基液。
- 向称量舟中加入 5 g PDMS 固化剂（与 PDMS 基液的质量比为 1:10）。
注意：该用量基于使用直径为 15 cm 的培养皿和模具。若使用不同尺寸的培养皿，请相应调整试剂用量。 - 使用一次性移液管搅拌 PDMS 基液和固化剂。从称量舟边缘开始，缓慢向内搅拌。充分搅拌数分钟，直至混合物中出现细小气泡；充分混合对 PDMS 的聚合至关重要。
- 缓慢将混合物倒入培养皿中，确保混合物完全覆盖硅晶片模具。
- 将培养皿放入真空环境中 10 分钟，以去除 PDMS 混合物中的所有气泡。若混合物表面仍有残留气泡，可用移液管吹除。
- 将带有 PDMS 的硅晶片模具置于 75 °C 烤箱中孵育约 2 小时。
- 小心地将聚合后的 PDMS 层从硅晶片模具上剥离，避免损坏模具结构。或者，使用单刃工业剃刀片，在图案周围保留至少 5 mm 的边缘，直接将 PDMS 从硅晶片模具上切割下来，然后轻轻剥离 PDMS 层。
- 将 PDMS 层放置在实验台上，使图案面朝上。使用单刃工业剃刀片小心切割出单个芯片，每个芯片边缘需保留足够边距，以避免损伤结构。
- 保持图案面朝上，使用打孔笔（内径 0.75 mm）垂直穿过通道两侧的进样口和出样口圆圈打孔。
注意：这些孔将作为培养基流动的通道。因此，必须准确穿过圆圈，并完全穿透 PDMS 层。确保清除孔中的 PDMS 柱状物。 - 再次将打孔针插入每个打好的孔中，检查孔的通畅性。确保针头能从另一侧穿出，表明无堵塞。在图案表面贴上透明胶带，然后轻轻撕下以清除灰尘颗粒。重复此步骤至少三次。最后在 PDMS 表面保留一块干净的透明胶带，以维持无菌状态。
- 在 PDMS 的另一侧重复此操作，并同样保留最后一块胶带。
- 准备一块尺寸为 24 mm × 30 mm、厚度为 0.13–0.17 mm 的盖玻片。喷洒 70% 乙醇于玻片表面，并用除尘纸擦干以实现表面灭菌；此外，也可用高压灭菌水清洗玻片后用除尘纸擦干。
- 将盖玻片和 PDMS 转移至塑料培养皿中。从 PDMS 上移除透明胶带，并将图案面朝上放置。转移过程中避免接触图案表面。
- 将塑料培养皿放入等离子体处理仪中。对 PDMS 和盖玻片进行氧气等离子体处理，使其表面具有亲水性，操作参数如下：处理时间 75 秒；气体流速 20 cc/min；压力 200；功率 100 W。
- 小心地将 PDMS 放置在盖玻片上，使两个亲水表面（即等离子体处理时朝上的表面）相接触。确保 PDMS 与盖玻片之间无气泡存在。
- 将 PDMS 芯片在 75 °C 烤箱中孵育至少 2 小时。
注意：微流控结构不完善可能导致实验过程中液体泄漏至显微镜上。因此，需用镊子轻轻从 PDMS 边缘提起，检查 PDMS 与盖玻片之间的键合情况。轻微提起时 PDMS 不应与盖玻片分离，表明键合成功。
3. 实验准备
- 准备导管。
- 在制备PDMS芯片前1天，分别将输入和输出导管浸入70%乙醇溶液中。
- 用5 mL注射器吸取灭菌水以冲洗导管。将导管连接至注射器，用水冲洗每根导管。
- 重复冲洗步骤至少3次，以清除残留的乙醇。
- 使用10倍物镜的光学显微镜检查PDMS通道，确保结构完整且一致。用透明胶带将PDMS芯片固定在显微镜载物台上。
注意：在步骤2中应一次性制备多个芯片，以确保有备用芯片，尤其是在首次制作该装置时。 - 用5 mL注射器吸取灭菌水，将注射器固定在注射泵上，并插入相应的输入和输出导管。设定清洗速度为750 µL/h，冲洗芯片约10分钟。在此期间，分支通道上的气泡应被冲洗掉；若仍有残留气泡，可手动调节流速以消除气泡。
- 酵母样品准备。
- 将1 mL已制备的酵母样品（OD600 0.6–0.8）转移至两个1.5 mL微量离心管中，在3,000 × g条件下离心5分钟。
- 吸除每管中的大部分上清液，并将剩余部分合并，形成0.5 mL样品。
- 暂停注射泵，并将输入导管从PDMS芯片上取下。
- 手动反转注射泵，使每个输入导管中吸入一小段空气泡（长度为1至2 cm）。继续操作，吸入酵母样品；空气泡将显示样品边界，并指示已吸入的样品量。
注意：避免将样品吸入注射器内。 - 将输入导管重新插入PDMS芯片，并重启泵，以750 µL/h的速度加载细胞。
- 保持注射泵运行10分钟，然后在显微镜下观察细胞加载情况；成功加载的标志是超过60%的悬垂柱下方捕获到细胞。
- 切换至营养液，并将流速调整为400 µL/h，用于细胞培养。
- 选择显微镜的观察位置。
注意：进行寿命测量时，使用40倍物镜的光学显微镜，每15分钟拍摄一次图像；进行荧光报告基因分析时，使用60倍油镜的荧光显微镜，每15分钟拍摄一次图像。
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结果
实验结束后，可以从记录的时间序列图像中提取细胞的寿命以及多种细胞和分子表型。由于可以从每个细胞中提取多种不同的特征，分析的第一步是对细胞和事件进行标注，包括细胞的位置与边界，以及所追踪的各种事件的发生时间，例如出芽事件。这些标注将有助于日后回溯同一组细胞并分析不同的特征。利用图像分析软件（如 ImageJ11）及其相关插件，可根据细胞的记录标注从图像数据中提取一系列表型信息。
以下是使用微流控装置测量表型的几个示例。通过计数每个被捕获的母细胞产生的芽体数量，并结合Kaplan-Meier估计法，可以获得酵母的寿命表型。最初被捕获在微流控装置中的细胞年龄未知。为了减少因这些未知年龄带来的寿命测量偏差，以往的方法采用被捕获细胞上芽痕的平均数量来校准寿命4,7。然而，芽痕的测量需要对细胞进行额外...
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讨论
PDMS 装置需要 freshly 制备，否则在将管路插入装置时产生的气泡将难以去除。步骤 3.4 通过浓缩细胞来提高细胞加载效率，至关重要。为了提高实验通量，通常在同一块 PDMS 芯片上使用 4 至 6 个模块，并连接至独立运行的泵，以同时进行 4 至 6 个不同的实验（不同菌株或培养基成分）。
与传统的酵母复制衰老检测方法（使用显微解剖）相比，本文介绍的微流控方法更省力且耗时更短。此外，微流控装置能够对多种细胞或分子参数进行详细定量分析，包括细胞大小、细胞周期动态、细胞形态以及各种分子标记物。该微流控方法通过在PDMS微垫下固定母细胞，同时自动冲走子代细胞，从而实现高分辨率显微镜下的长期细胞追踪。
该装置采用柔软的PDMS微垫来捕获母细胞4，其基本结构与Huberts et al. 在其研究中描述的类似7。但在装置设计和实验方案上存在若干差异。本装置中更宽的PDMS垫允许部分新生子代细胞被捕获并进行分析（
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 AG043080 和国家自然科学基金（NSFC）项目编号 11434001 的支持。我们感谢 Lucas Waldburger 对手稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3'' <111> 硅晶圆 | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 和 3000 系列 | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 硅橡胶弹性体套件 | ellsworth | 2065622 | 包含 Sylgard® 硅橡胶弹性体基料和固化剂 |
| 培养皿 | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ 打孔器（内径 0.75 mm） | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm × 40 mm SLIP-RITE® 盖玻片 | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch 胶带 | ULINE | S-10223 | |
| VWR® 剃刀刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 纯乙醇，Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster™ | VWR | 16650-027 | |
| 5 mL BD 注射器（鲁尔锁™ 接头） | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| 聚四氟乙烯标准壁管（100 英尺，AWG 规格：22，标称内径：0.028 英寸） | Component Supply Company | SWTT-22 | |
| 针头套装 | Component Supply Company | NEKIT-1 | |
| 干燥器 | HACH | 2238300 | |
| 实验室烘箱 | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| 尼康 TE2000 显微镜，配备 40X 和 60X 物镜 | Nikon | ||
| 蔡司 Axio Observer Z1，配备 40X 和 60X 物镜 | Zeiss | ||
| 注射泵 | Longerpump | TS-1B |
参考文献
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