将点击器训练引入作为实验小鼠的认知丰富化方法

摘要

开发用于实验小鼠的新优化策略是一项具有挑战性的任务，有助于实现3R原则。本方案将点击器训练作为一种认知丰富化项目引入实验小鼠的饲养管理中。

摘要

在实验动物科学中建立新的优化策略，是满足欧盟指令2010/63/EU要求的核心目标。先前的研究已确定，温和操作方案对实验小鼠的福利具有深远影响。通过将响片训练引入小鼠饲养过程，我们不仅促进了对小鼠的友善对待，还使其获得认知层面的环境丰富化。响片训练是一种正向强化训练方法，利用条件性的次级强化物——响片发出的“咔哒”声——作为被强化行为与即将获得的奖励之间的时间桥梁。本研究对每个性别各12只BALB/c近交系小鼠实施响片训练方案，结果表明该方案操作简便。小鼠在接受响片训练任务挑战时学习速度较快，几乎所有受训小鼠均成功克服了所面临的挑战（雌性小鼠成功率为100%，雄性为83%）。本研究发现，小鼠接受响片训练与其在人-鼠互动过程中恐惧程度降低密切相关，表现为焦虑相关行为（例如排便、发声和排尿）减少，以及抑郁样行为（例如漂浮）减少。通过开发一种可轻松整合到实验小鼠日常饲养管理中的可靠方案，可显著改善小鼠一生的福利体验。

引言

开发针对实验小鼠的新优化策略是一项具有挑战性的任务，有助于实现实验动物科学中的3R原则（替代、减少和优化）。¹在优化领域取得的进展可进一步促进数以百万计实验动物的福利，因此该领域亟需开展深入研究。这也是欧盟指令2010/63/EU所明确的目标之一。该指令指出，必须改善实验动物整个生命周期的生存体验，并且 "实验机构应为动物、实验操作及项目持续时间制定适宜的适应性训练和培训方案" （第3.7条）².

实验动物在饲养和繁殖过程中可能会经历许多应激情况。通常，实验小鼠与负责人员之间的互动较为有限，因此难以建立信任关系。这可能导致动物在受到操作时产生更高的焦虑和应激反应，从而对动物的行为、生理状态及整体福利产生不利影响^3,4,5,6。此外，常规的实验室操作，如一般性抓取、固定以及采血或组织取样，均可能引发应激反应，这些反应可通过检测应激激素或行为等不同参数进行评估^7,8。已有研究表明，通过实施抓取训练程序可有效降低实验啮齿类动物对研究人员的焦虑反应^9,10,11。因此，抓取训练程序可改善动物的生存状态，并对动物福利产生显著促进作用⁵。

本研究的目的是将正向强化训练作为一种特定的抓取方案引入小鼠操作中。正向强化训练是一种操作性条件反射方法，使研究人员能够塑造动物行为。当动物表现出期望的行为时，即给予一种正向刺激（此处为食物奖励）。其目的是使动物将奖励与该行为关联起来。响片训练是一种正向强化训练形式，利用经过条件化的次级强化物——响片发出的"咔哒"声，已被证实可增强特定行为¹²。

更具体地说，咔哒声在行为与即将到来的奖励之间起到了"时间桥梁"的作用¹³。训练者在动物执行目标行为的瞬间精确地发出咔哒声，不延迟任何时间¹⁴，随后给予食物奖励。这会强化被奖励的行为，使其出现频率更高。响片训练在伴侣动物训练中被广泛使用，并已引入实验动物科学领域，已在非人灵长类动物中成功应用^13,15,16。由于小鼠在操作性条件反射范式中学习速度较快，引入第二种强化物不应超出其认知能力的负荷^5,17,18,19。

通过将响片训练引入小鼠饲养过程，我们使小鼠能够获得认知层面的丰富化体验。认知丰富化的设计必须使小鼠能够运用其认知能力解决问题，并获得对所处环境的控制权^20,21。多项针对不同物种的研究已证实，认知丰富化对圈养动物福利具有积极影响^22,23,24。增强动物成功应对环境挑战的能力，有助于提升其整体福祉^25,26。

此外，如果动物在一生中经历较低水平的压力，那么当面对生物医学研究中出现的压力源时，它们更不容易发展出有害的应对策略。因此，持续实施认知丰富化措施有助于使受试对象的表型趋于均一。这将有助于实现“3R”原则中的减少原则，因为可以减少满足统计学要求所需的受试对象数量²⁷。

通过建立一种可靠的方案，该方案可轻松整合到实验室小鼠日常饲养流程中，我们能够显著改善小鼠一生的福利状况。

方案

伦理声明：小鼠的处理及实验操作均遵循欧洲、国家及机构层面的实验动物护理指南。

注意：该方案包括连续五天的干预（周一至周五），周末（周六和周日）休息。该方案可轻松调整以满足特定需求。

1. 确定适合作为第二强化物的奖励

注意：使用符合食品安全标准的真空包装食品或动物饲料作为食物奖励。例如，各种坚果、巧克力、软糖熊或干果均适用。

1. 将一个装有不同食物奖励（每块体积为 0.5 cm³）的小型培养皿放入动物笼具中（图 1）。
2. 10 分钟后，检查是否有剩余食物。
3. 若 10 分钟内所有食物均被吃完，则缩短观察时间，直至可评估出偏好性。
4. 在第 4 天和第 5 天（例如，星期四和星期五），向笼具中添加少量偏好性更高（"winner"）的食物奖励，以使笼内所有小鼠均对该奖励产生偏好。
5. 若小鼠尚未适应小鼠隧道，需在开始训练前至少 2 天（例如，周末期间）向笼具中添加一条隧道。
6. 连续 3 天重复步骤 1.2 至 1.4（例如，星期一至星期三）。

2. 响片训练

1. 每次训练 session 的准备工作
   注意：本方案中每次需要抓起小鼠时，均应以平静轻柔的方式进行。将手置于小鼠身下将其托起。在最初几次操作中，小鼠可能会表现出躁动，但经过数天后即可完成适应过程。若此步骤操作困难，可参考相关方案 "在张开的手掌上进行拔罐"²⁸.
   1. 准备一个带有垫料的笼子。
   2. 将正在训练的小鼠笼子转移到安静的地方。
   3. 准备好奖励，并备好计时器以及点击器/目标棒组合。
      注意：如果小鼠已适应抓握操作并与实验人员建立了信任关系，则可直接用手喂食。否则，应将奖励物固定在棒状物或镊子上，使小鼠能够在与实验人员保持距离的情况下取食。
   4. 将所有物品从原本的饲养笼中移除，该笼现在用作训练区域（例如， 小鼠饲养盒，筑巢材料， 等等.).
   5. 将笼内同伴转移至已准备好的笼子中。
2. 所有培训环节均需遵守的通用规则
   注意：以下通用规则适用于所有实验环节，在本方案后续部分将不再重复说明。
   1. 每次训练小鼠5分钟，交替进行30秒训练和15秒休息。
   2. 让小鼠啃食奖励物的时间不超过1秒。然后将带奖励物的棒从笼中取出。
   3. 执行以下奖励模式：
      1 - 10 次行为表现：每次均给予奖励。
      11 - 21 次行为表现：每第二次给予奖励。
      每进行22次行为表现后，每第三次给予奖励。
   4. 训练4分钟后，当小鼠再次表现出目标行为时，给予 jackpot 奖励进行强化。让小鼠啃食食物奖励的时间比之前延长三倍。
3. 训练日 第1天： "将次级强化物与食物奖励相关联"
   1. 将计时器设为5分钟，按下启动按钮，然后将小鼠隧道放入饲养笼中。
      注意：利用小鼠天生的触壁性，将隧道放置在靠近墙壁的位置（图2）。在最初的几次实验中，这将提高小鼠进入隧道的概率。
   2. 等待小鼠探查隧道。一旦小鼠进入隧道，立即点击并在隧道末端呈现奖励。
   3. 让小鼠在隧道内静坐时摄取奖励。
   4. 在小鼠位于隧道中时，持续点击15秒。
   5. 小鼠一旦离开隧道，立即返回步骤 3.2。
4. 训练阶段第2 - 5天： "穿过隧道"
   1. 将计时器设为5分钟，按下开始按钮，然后将小鼠隧道放入鼠笼中。
   2. 当小鼠进入隧道后，立即点击并在隧道末端呈现奖励。
   3. 只要小鼠在隧道内，立即以相同方式点击并给予奖励。
   4. 重复此操作30秒，然后暂停15秒，将隧道从笼子中取出。
   5. 再次添加通道，当鼠标重新进入通道时立即点击。
   6. 在隧道末端呈现奖励。
   7. 让小鼠啃咬最多1秒。
   8. 移除奖励。
   9. 一旦小鼠开始自行重新进入隧道，立即将奖励物放置在隧道末端前方图3).
5. 培训课程第2周： "跟随目标棒"
   1. 将计时器设为5分钟，按下启动按钮，并将球体放置在笼子内目标杆的末端。
   2. 一旦小鼠对球体表现出兴趣，立即点击并在此球体旁呈现奖励图4 和 5).
   3. 仅当小鼠用鼻子触碰球体后才给予奖励。
   4. 当小鼠已将执行的动作与奖励建立关联后，在训练过程中改变球体的位置（图6).
   5. 等待小鼠完成这一最终挑战。
   6. 将眼球放入笼中。
   7. 在小鼠即将触碰到球体时，缓慢而小心地将球体位置移动1 cm。
   8. 当小鼠走过指定距离并触碰到球体时，点击并给予奖励。
   9. 重复此操作，直至小鼠能够稳定跟随。
   10. 缓慢增加小鼠需要跨越的距离。
6. 训练周期第3周： "跟随目标棒至实验者的手"
   1. 一手放入训练笼中，另一手持握点击器/目标棒组合，并用该手拿取奖励物。
   2. 将计时器设为5分钟，按下启动按钮，并将地球仪放置在目标杆末端靠近手的位置。
   3. 一旦小鼠对球体表现出兴趣，立即点击并在此球体旁给予奖励。
   4. 一旦小鼠完成此项挑战，即将滚轮向手的方向移动几步。
   5. 将眼球置于手掌上。当小鼠停留在手掌上时，点击并给予奖励（图7).

结果

第一步也是最重要的步骤之一是确定合适的食物奖励。因此，在培养皿中为小鼠提供了多种坚果、糖溶液、果酱以及不同种类的巧克力（图1）。根据我们的经验，小鼠明显偏好白巧克力。因此，我们在后续所有训练过程中均使用白巧克力。

实际训练使用每种性别的12只BALB/c近交系小鼠组成的队列进行。所有小鼠对训练均表现出浓厚兴趣。为评估训练效果，我们检查了小鼠是否正确执行了目标行为：“跟随目标棒”（图4）。绝大多数受训小鼠——所有雌性小鼠以及83%的雄性小鼠——均能跟随目标棒（图8）。总体而言，雌性小鼠的训练积极性更高，在整个训练过程中执行该行为的频率也更高。完成4天训练后，雌性小鼠平均每5分钟跟随目标棒64次，而雄性小鼠平均每5分钟仅执行该行为50次。在5分钟内，“跟随至手掌”这一任务平均被雌性小鼠执行55次，雄性小鼠执行35次（图9）...

讨论

对每个性别各12只BALB/c近交系小鼠群体成功实施该点击器训练方案被证明是简单易行的。先前的研究已证实点击器训练在多个物种中的有效性，而我们将此方法进一步扩展至小鼠。由于小鼠是实验动物中进化程度最低的哺乳动物，其能力常被低估。因此，数据中最令人惊讶的方面是几乎所有的小鼠均实现了训练成功。

该方案中的一个关键步骤是第二次强化物给予的时机，这对建立所展示行为与强化之间的关联至关重要。由于小鼠通常非常躁动，在其四处奔跑时准确标记特定行为略显困难。训练者经验越丰富，训练成功所需时间越短。我们观察到，即使由经验不足的训练者操作，小鼠也能较快学会。在点击器训练方案的实施过程中，即使出现轻微错误，通常也能得到弥补。常见的错误来源包括对错误行为进行了强化，以及在点击后小鼠对食物奖励缺乏兴趣。

一个不可控的因素是每只小鼠的个体性格。尽管本研究使用的是在相同条件下出生和饲养的近交系小鼠，它们仍会发展出多种不同的性格特征。根据以往的研究和我们自身的经验数据，我们知道这些差异包括不同的口味偏好、食欲表达以及探索行为的不同

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
开放式饲养盒盖子	Tecniplast	GM500LID117
开放式饲养盒密封盖（SealSAfe Plus 型）	Tecniplast	GM500400SU
II 型长款过滤顶笼具	Tecniplast	GM500PFSPC
白杨木垫料	Lab & Vet Service GmbH	H0234-300	环境丰富化材料
红色聚碳酸酯小鼠屋（Mouse House）	Tecniplast	ACRE011	环境丰富化材料
纸巾	Tork, SCA Hygiene Products GmbH	290179	环境丰富化材料
饲料 - ssniff M-H 挤压颗粒饲料	ssniff	V1126-000	自由取食
带响片的训练指示棒	Trixie	2282
PVC 管（隧道）	Thyssen Krupp	RTPVCU04003005
白巧克力/白色巧克力奶油			公司品牌不限，建议使用有机品质
镊子	FineScienceTools	e.g. 11150-10	用于固定巧克力的工具，或其他类似工具
Prism 6.0 for Windows 版本	GraphPad Software