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方法文章

通过液体中脉冲激光烧蚀法生产金属纳米颗粒：研究纳米颗粒抗菌性能的工具

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DOI：

10.3791/55416

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2017年6月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Rutgers University-Camden, 2Center for Computational and Integrative Biology, Rutgers University-Camden, 3Biology Department, Rutgers University-Camden

本文内容

摘要

铜和银等金属的抗菌特性已被认识数个世纪。本实验方案描述了液相脉冲激光烧蚀法，这是一种合成金属纳米颗粒的方法，可精确调控这些纳米颗粒的特性，从而优化其抗菌效果。

摘要

多重耐药细菌的出现已成为全球临床关注的问题，一些人甚至推测医学可能正在回归“抗生素前时代”。除了致力于发现新型小分子抗菌药物外，由于金属纳米颗粒具有抗菌特性，其作为医疗器械涂层、伤口敷料和消费品包装材料的应用也引起了广泛关注。目前已有多种纳米颗粒合成方法，这些方法会导致纳米颗粒在化学和物理性质上存在广泛差异，从而影响其抗菌效果。本文描述了液相脉冲激光烧蚀（PLAL）法用于制备纳米颗粒。该方法可通过辐照后处理以及添加表面活性剂或排阻剂，精确调控纳米颗粒的尺寸、组成和稳定性。通过控制颗粒的尺寸和组成，可以探索金属纳米颗粒多种多样的物理和化学性质，这些性质可能与其抗菌效能相关，从而为抗菌剂的开发开辟新的途径。

引言

纳米颗粒（NPs）通常被定义为至少有一个维度小于100 nm的颗粒。传统的化学合成纳米颗粒方法通常需要使用有害的还原剂，如硼氢化物和肼类化合物。相比之下，将固体金属靶材浸入液体介质中进行激光烧蚀（液相脉冲激光烧蚀——PLAL）提供了一种环境友好的纳米颗粒合成途径，符合绿色化学的全部12项原则1,2。在PLAL过程中，浸没的金属靶材受到重复激光脉冲的辐照。随着激光对靶材的烧蚀，大量原子团簇和蒸气被释放到液体介质中，并迅速凝聚形成纳米颗粒。通过PLAL制备的纳米颗粒可均匀分散在水相介质中，且通过调节水相烧蚀液体以及激光参数，可方便地控制纳米颗粒的尺寸、多分散性及组成1,2,3,4,5,6。

通过调节多种激光参数（包括：能量密度、波长和脉冲持续时间，详见参考文献7），可以调控纳米颗粒的特性。激光能量密度定义为脉冲能量除以激光在靶材表面光斑的面积。能量密度对纳米颗粒尺寸和多分散性的影响尚存在一定的争议。通常认为，对于“长脉冲”和“超短脉冲”激光系统，存在低能量密度和高能量密度两种不同区域，分别导致纳米颗粒尺寸呈负相关和正相关趋势8,9,10,11。纳米颗粒的尺寸分布可通过动态光散射和透射电子显微镜（TEM）等技术进行实证测量，如下文所述。

激光波长的选择会影响纳米颗粒（NPs）形成的物理机制。在较短的（紫外）波长下，高能光子能够断裂原子间化学键12。这种光烧蚀机制属于自上而下的纳米颗粒合成方法，因为它会导致材料释放出极小的碎片，这些碎片在浸没液体中淬火后往往形成粒径较大且多分散性较高的样品12,13,14。相比之下，近红外烧蚀（λ = 1,064 nm）则以等离子体烧蚀为主导，属于自下而上的合成机制12。靶材吸收激光后释放出电子，这些电子与束缚电子发生碰撞并使其进一步脱离。随着碰撞不断增多，材料被电离，从而引燃等离子体。周围的液体限制等离子体的膨胀，增强其稳定性，并进一步提高能量吸收效率12。当膨胀的等离子体被周围液体淬火时，纳米颗粒便以多种几何形态冷凝形成4,12,15。

激光脉冲持续时间的选择会进一步影响纳米颗粒（NP）的形成过程。常用的长脉冲激光器，其脉冲持续时间大于几皮秒，包括所有毫秒、微秒、纳秒以及部分皮秒脉冲激光器。在此脉宽范围内，激光脉冲持续时间长于电子-声子平衡时间，后者通常在几皮秒量级4,16,17,18,19。这会导致能量向周围烧蚀介质泄漏，并通过热机制（如热电子发射、汽化、沸腾和熔化）形成纳米颗粒1,20。

纳米颗粒（NPs）的抗菌活性受粒径影响显著21,22,23,24。为了进一步减小粒径并提高单分散性，可使用波长接近纳米颗粒表面等离子体共振（SPR）的激光对纳米颗粒进行二次辐照。入射激光通过激发SPR被纳米颗粒吸收。纳米颗粒的碎裂可能通过热蒸发25,26或库仑爆炸27,28两种机制发生。光激发使纳米颗粒温度升至熔点以上，导致颗粒外层脱落。已有研究表明，在溶液中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或十二烷基硫酸钠（SDS）等添加剂可显著增强辐照后的效应5。多种溶质添加的影响已在多篇文献中报道1,4,6。通过液相激光辐照法（PLAL）对纳米颗粒特性进行便捷调控，为开发新型纳米颗粒基抗菌剂提供了新途径。

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方案

1. 纳秒激光的聚焦与能量密度测量

  1. 将磁力搅拌子和多孔烧蚀平台放入一个50 mL玻璃烧杯中，组装烧蚀装置。
    注：烧蚀平台由一个直径3.81 cm、厚1.6 mm的不锈钢平台构成，其上按图1所示模式钻有十个直径0.65 cm的孔和六个直径0.50 cm的孔。这些孔的作用是允许液体流过靶材表面，防止颗粒在靶材正上方立即积聚。混合不充分会导致激光与已生成颗粒之间产生不利的相互作用。此外，在平台边缘附近设有三个#29（8-32）螺纹孔，用于安装紧定螺钉作为支脚，以抬高平台并为磁力搅拌子留出空间（图1A）。
    1. 将烧杯置于磁力搅拌器上，并将搅拌器放置在xy平移台上，以便在烧蚀过程中移动靶材（图1A）。
  2. 将Nd:YAG激光器设置为以1,064 nm的基本波长运行，脉冲持续时间为5 ns，脉冲重复频率为10 Hz。使用激光功率与能量计测量每个脉冲的能量。所需能量为240–250 mJ。
  3. 使用焦距为250 mm的会聚透镜（NA = 0.05）将激光束聚焦于烧蚀平台上的靶材下方。
    注：入射光束半径为4.025 mm，需将透镜高度设为161 mm以达到所需的光斑尺寸。最佳光斑尺寸通过实验确定。采用较大的光斑尺寸可降低溶液中纳米颗粒对激光的屏蔽效应，但需权衡的是，增大光斑尺寸需要更高的能量以维持足够的能量密度。
  4. 将金属靶材（见第2节）放置在平台上，用若干激光脉冲进行烧蚀，从而确定光斑尺寸。将烧蚀后的靶材与微米尺一同置于配备CCD相机的光学显微镜（4X物镜）下观察，测量光斑尺寸（图1A）。
    注：本装置的烧蚀系统产生的光斑平均面积为5.51 mm2。每次烧蚀的光斑尺寸均保持在此范围内。
  5. 通过将脉冲能量除以光斑面积来计算能量密度。本装置的能量密度为4.80 J/cm2。

2. 通过液体中脉冲激光烧蚀法合成银纳米颗粒

  1. 使用微量天平称量一块平面银靶，以获得其在消融前的质量。
  2. 使用双面导电胶带将银靶固定在多孔载物台上。在烧杯中加入 40 mL 消融液（图 1A），液面高于靶材表面 11 mm。
    注意：常用的消融液为含有 60 mM SDS 或 2 mM PVP 的水溶液，以提高纳米颗粒的单分散性。
  3. 在持续搅拌条件下，通过计算机控制的电动 xy 载物台以椭圆轨迹移动（尺寸：长轴 = 2.09 cm，短轴 = 0.956 cm，面积 = 1.57 cm2），移动速度为 0.42 cm/s，对靶材进行 20–40 分钟的消融。
    注意：纳米颗粒的浓度随消融时间延长而增加。应确保搅拌足够剧烈，使溶液中纳米颗粒浓度保持均匀，以尽量减少屏蔽效应7。

3. 金属纳米颗粒的表征

  1. 通过倾析法从烧杯中收集纳米颗粒溶液。通过测量其紫外-可见光光谱（200–1,100 nm）确认纳米颗粒的存在。
    注意：纳米颗粒在表面等离子体共振（SPR）波长处具有最大吸收峰。银纳米颗粒的SPR峰位于400 nm附近。高浓度的纳米颗粒溶液在测量紫外-可见光谱前需进行稀释，以确保吸光度读数处于分光光度计的线性响应范围内。
  2. 采用动态光散射（DLS）结合数均分布分析方法测定纳米颗粒的流体动力学直径29。
    1. 将纳米颗粒溶液用消解液稀释1:40，移取1 mL至1 cm塑料比色皿中。采用180°，的检测角度，在633 nm波长下测量光散射，依据斯托克斯-爱因斯坦方程计算纳米颗粒直径：
      粒子扩散的爱因斯坦-斯托克斯方程，扩散系数计算公式。
      其中，d为流体动力学半径，k为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，η为黏度，D为平移扩散系数或布朗运动速度。
  3. 采用透射电子显微镜（TEM）确认纳米颗粒的尺寸与形貌30。
    注意：由于纳米颗粒周围存在溶剂层，DLS测得的流体动力学直径通常大于TEM测得的尺寸。
    1. 将纳米颗粒溶液用双蒸水稀释1:40，以去除可能干扰成像的过量添加剂（例如 SDS或PVP）。取2 µL溶液滴加至预先镀有 lacey/薄碳膜的铜网（商品化产品；参见材料列表）上，置于干燥器中真空条件下室温干燥过夜。
    2. 按照参考文献30所述方法对纳米颗粒进行成像，评估其尺寸与形貌。
  4. 为计算纳米颗粒浓度，将激光烧蚀后的金属靶材（步骤2.3）置于盛有蒸馏水的超声水浴中1分钟，以去除靶材表面松散附着的纳米颗粒。
    1. 用压缩空气吹扫靶材1分钟使其干燥。使用微量天平测量靶材质量。通过烧蚀前后质量差值定量溶液中纳米颗粒的质量，该质量差值被认为是由金属纳米颗粒喷射进入溶液所致。

4. 照射后处理

  1. 将纳米颗粒（NPs）用与2.2步骤中相同的消融溶液稀释至最高浓度为100 µg/mL。此浓度限制对于确保均匀辐照至关重要。
  2. 将15–17 mL稀释后的纳米颗粒转移至含有搅拌子的石英比色皿中（图1B）。将比色皿置于磁力搅拌器上，并使其与入射激光平行对齐。
  3. 使用Nd:YAG激光系统产生25 ps、532 nm的激光脉冲，并使用焦距为75 mm的透镜将激光聚焦于溶液中心。根据所需粒径，对溶液进行30分钟至数小时的辐照。
    注意：输送的总能量取决于溶液浓度和辐照时间，范围可为0.5 mJ至3.5 mJ。对于本实验装置，对透明且低浓度样品（<50 µg/mL）进行30分钟辐照后，可获得直径为10 nm的银纳米颗粒。

5. 测定纳米颗粒的抗菌特性

注意：已测试银纳米颗粒对革兰氏阳性菌（Bacillus subtilis）和革兰氏阴性菌（Escherichia coli）的毒性31。该方法可轻松适用于任何物种；但纳米颗粒的有效剂量可能差异较大，需通过实验确定。此处以 E. coli 作为模型系统来描述该方法。

  1. 在含有 10 g/L Bacto 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和 10 g/L 氯化钠的 LB 培养基中，于 37 °C 过夜培养 E. coli 菌株（MG1655）。将过夜培养物用新鲜 LB 培养基稀释至光密度（λ = 600 nm）为 0.01。
  2. 如果纳米颗粒（NPs）是在含有添加剂（例如 SDS 或 PVP）的消融液中合成的，则需将相应的化学物质加入 LB 培养基中，以确保在加入纳米颗粒后该添加剂的浓度保持不变。
    注意：例如，在典型实验中，银靶被消融至 60 mM SDS 溶液中，得到浓度为 100 µg/mL 的纳米颗粒溶液。若纳米颗粒在培养基中的终浓度为 10 µg/mL，则应配制含 6 mM SDS 的 LB 培养基（即 消融液中 SDS 浓度的 1/10）。使用此类浓度时，对细菌生长无负面影响。这一点在 图 3 的 -AgNP 对照组中已得到证实。
  3. 将纳米颗粒以 0–50 µg/mL 的不同浓度加入稀释后的培养物中，并于 37 °C 振荡培养额外 2 小时。作为毒性的阳性对照，可用抗生素（例如 30 µg/mL 卡那霉素）处理 E. coli。
  4. 2 小时培养后，将培养样品用新鲜 LB 培养基进行连续 10 倍梯度稀释，并取每种稀释液 10 µL 点样于 LB 琼脂平板上。通常，104–108 倍的稀释度足以获得可分辨的单菌落。
  5. 待液滴完全吸收后，将平板于 37 °C 过夜培养，并于次日早晨计数菌落形成单位（cfu）。

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结果

使用银靶材、上述激光参数以及含有60 mM SDS的消融液，可生成具有特征性表面等离子体共振（SPR）紫外-可见光吸收峰的银纳米颗粒（图2A）。透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）测量结果显示，辐照后纳米颗粒的平均直径约为25 nm（图2B）。对银靶材进行30分钟的消融通常可获得约200 µg/mL的纳米颗粒浓度。在评估银纳米颗粒的抗菌毒性时，15 µg/mL浓度可显著抑制大肠杆菌（E. coli）的生长（图3）。

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讨论

纳米颗粒（NPs）需具有相似的尺寸和浓度，才能实现可重复的抗菌效果。因此，标准化激光参数（包括能量密度、波长和脉冲持续时间）至关重要。尽管动态光散射法是一种估算纳米颗粒尺寸的简便快速方法，但对其尺寸分布的精确定量仍需通过透射电子显微镜（TEM）进行直接测量。由于每束激光在模式分布和发散特性方面均具有独特性质，因此必须采用经验方法来确定相对于靶材的最佳能量密度和液面高度。由于纳米颗粒的尺寸可通过辐照后处理进行调节，因此可通过测量靶材的质量损失和光学密度来优化颗粒生成效率。

与传统的化学合成方法相比，液相激光烧蚀法具有能够在纯水或表面活性剂溶液中生成纳米颗粒的优势。该方法不存在会污染培养物并产生干扰的前驱化合物。研究人员可在短时间内于实验室中制备纳米颗粒，以便立即使用。该技术具有高度可重复性，且无需特殊培训或专业人员操作。然而，需要注意该方法的局限性。首先，液相激光烧蚀所生成的纳米颗粒在形态上具有较宽范围的多样性。若需获得特定长径比或其他形状参数的纳米颗粒，可能需要进行大量重复性处理，甚至在某些情况下难以实现。该技术最显著的局限性可能是：对于需要大量纳米颗粒的实验将面临困难。尽管可以实...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会（NSF资助编号CMMI-0922946授予D.B.，CMMI-1300920授予D.B.和S.O'M.，CMMI-1531789授予S.O'M.、D.B.和E.A.K.）以及Busch生物医学研究基金对E.A.K.和S.O'M.的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纳秒 Nd:YAG 激光器EksplaNL303
电动 xy 扫描平台Standa8MTF
紫外-可见分光光度计AgilentCary 60
动态光散射仪MalvernZetasizer ZS 90
微量天平MaktekTM 400
透射电子显微镜ZeissEM 902
银箔靶材Alfa Aesar12127
250 mm 焦距透镜Edmund Optics69-624
铜制透射电镜载网Pacific Grid-TechCu-400LD带lacey/薄膜涂层的载网
E. coli MG1655ATCC47076
胰蛋白胨BD Biosciences211705
酵母提取物BD Biosciences212750
氯化钠Fisher ScientificBP3581
细菌琼脂BD Biosciences214010
十二烷基硫酸钠Fisher ScientificBP166-100
聚乙烯吡咯烷酮Fisher ScientificBP431-100
不锈钢圆片（用于烧蚀平台）Metal Remnants, Inc.N/A直径 1.5 英寸，16 号规格
烧杯Fisher Scientific02-540G
磁力搅拌子Fisher Scientific14-513-57
磁力搅拌器Fisher Scientific11-100-49SH
激光能量与功率计Coherent1098579
导电碳胶带Shinto Chemitron Co. Ltd.STR Tape
超声水浴槽Branson1510
空气压缩机GMCSyclone 3010用于干燥烧蚀靶材
75 mm 焦距透镜Edmund Optics34-096用于辐照后聚焦的透镜
石英比色皿Precision Cells Inc21UV40光程 50 mm（用于辐照后测量）
卡那霉素Fisher ScientificBP906-5
光学显微镜Nikon50i该显微镜用于将激光聚焦在烧蚀平台上。此特定型号已不再供货，但任何配备 4X 物镜的光学显微镜均可使用。
CCD 相机AmScopeMT5000-CCD
千分尺载玻片Ted Pella2280-70

参考文献

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