利用基于酶的生物传感器测量阿尔茨海默病小鼠模型中的紧张性和时相性谷氨酸

摘要

在此，我们介绍一种用于精确测量张力性和时相性细胞外谷氨酸变化的空间和时间分辨方法的实验装置搭建、软件操作及数据分析流程 体内 使用酶联微电极阵列（MEA）。

摘要

神经递质紊乱通常是中枢神经系统（CNS）疾病的关键组成部分，在阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症和焦虑症的病理过程中发挥重要作用。传统上，微透析是最常用（且备受推崇）的技术，用于检测这些疾病中发生的神经递质变化。但由于微透析只能测量在大范围组织中缓慢发生的1至20分钟的变化，因此存在侵入性强、可能破坏脑内固有连接以及采样速度慢等缺点。一种相对较新的技术——微电极阵列（MEA），在实时测量特定脑区内特定神经递质变化方面具有诸多优势，实现了空间和时间上的高精度。此外，MEA的使用具有最小侵入性，可在活体（in vivo）条件下检测神经递质的动态变化。在本实验室中，我们特别关注与阿尔茨海默病病理相关的神经递质谷氨酸的变化。因此，本文所述方法已被用于评估阿尔茨海默病转基因小鼠模型中海马区谷氨酸的潜在紊乱。简而言之，该方法涉及将一种对目标神经递质高度选择性的酶涂覆于多点位微电极表面，并利用自参考点位扣除背景噪声和干扰物质。在完成镀膜和校准后，可将MEA与微移液管组装，并通过立体定位仪精确插入目标脑区。本文所描述的方法包括对rTg(TauP301L)4510小鼠进行麻醉，并使用立体定位仪精确定位海马的亚区（DG、CA1和CA3）。

引言

测量大脑中神经递质的变化是神经科学家研究中枢神经系统（CNS）疾病的重要工具，因为这些疾病通常以神经递质失调为特征。尽管结合高效液相色谱法（HPLC/EC）的微透析技术一直是测量细胞外神经递质水平变化最常用的方法^1,2,3,4微透析探针在空间和时间分辨率上可能并不理想，难以准确反映谷氨酸等在细胞外空间受到严格调控的神经递质的变化情况^5,6由于遗传学和成像技术的最新进展，现已可采用其他方法来绘制谷氨酸图谱 在体. 利用基因编码的谷氨酸荧光探针（iGluSnFR）和双光子成像技术，研究人员能够同时可视化神经元和星形胶质细胞的谷氨酸释放过程 体外 和 体内^7,8,9. 值得注意的是，这种方法能够实现更大视野范围的记录，且不会破坏脑组织的内在连接。尽管这些新型光学技术能够可视化谷氨酸动力学，并测量感觉诱发反应和神经元活动，但它们尚无法定量测定特定脑区细胞外空间中谷氨酸的含量。

另一种方法是酶联微电极阵列（MEA），该方法可通过自参考记录方案选择性地测量细胞外神经递质水平，例如谷氨酸。MEA 技术已被用于研究创伤性脑损伤^10,11,12、衰老^13,14、应激^15,16、癫痫^17,18、阿尔茨海默病^19,20以及注射病毒模拟物²¹后细胞外谷氨酸水平的变化，相较于微透析技术在空间和时间分辨率上的固有局限性，MEA 是一种改进方法。微透析限制了在突触附近进行测量的能力^22,23，而 MEA 具有高空间分辨率，可实现对突触附近细胞外谷氨酸溢出的选择性测量^24,25。其次，微透析的时间分辨率较低（1–20 分钟），难以研究发生在毫秒至秒级范围内的谷氨酸释放与清除的快速动态过程²⁶。由于谷氨酸释放或清除的差异在张力性、静息状态下的谷氨酸水平测量中可能并不明显，因此直接测量谷氨酸的释放与清除可能是必要的。MEA 因其高时间分辨率（2 Hz）和低检测限（< 1 µM）而能够实现此类测量。第三，MEA 可用于研究特定脑区内神经递质的亚区域差异，例如大鼠或小鼠的海马体。例如，利用 MEA 可分别靶向海马体中的齿状回（DG）、阿蒙角3区（CA3）和阿蒙角1区（CA1），这些区域通过三突触回路相互连接²⁷，从而检测细胞外谷氨酸的亚区域差异。由于微透析探针尺寸较大（1–4 mm 长）以及植入过程中造成的组织损伤^28,29，难以有效研究亚区域差异。此外，光学系统仅能通过外部刺激（如胡须刺激或光闪烁）进行刺激，无法实现亚区域特异性刺激⁷。MEA 相较于其他方法的最后一个优势在于，能够在不破坏这些亚区域的外在和内在连接的情况下，对其进行活体（in vivo）研究。

此处，我们介绍如何使用记录系统（例如，FAST16mkIII）与多电极阵列（MEA）联用，该阵列包含基于陶瓷的多位点微电极，可在记录位点进行差异性涂覆，以识别并去除分析物信号中的干扰物质。我们还证明了这些阵列可用于基于安培法的研究 体内 麻醉状态下阿尔茨海默病常用小鼠模型rTg(TauP301L)4510小鼠海马DG、CA3和CA1亚区中的谷氨酸调节。此外，我们通过给予利鲁唑处理小鼠，验证了多电极阵列（MEA）系统对谷氨酸释放与清除快速动态过程的敏感性，该药物已被证实可影响谷氨酸能信号 体外 减少谷氨酸释放并增加谷氨酸摄取^30,31,32,33，并展示这些相应的变化 体内 在TauP301L小鼠模型中。

方案

1. 用酶或基质层包被微电极阵列

1. 制备蛋白质基质溶液
   1. 称取10 mg牛血清白蛋白（BSA），转移至1.5 mL微量离心管中。
   2. 向含有 BSA 的微量离心管中加入 985 µL 去离子水。通过手动振荡混合溶液（使用 1,000 µL 移液器反复吹打约 3 次，直至 BSA 完全溶解）。
      注意：请勿使用涡旋振荡器混匀溶液，以免将空气引入溶液中。同时，将移液器调至指定体积 <1,000 µL (例如 700 µL）以避免引入气泡。如有必要，可将溶液放入微量离心机中。
   3. BSA溶液溶解后，加入5 µL 25%戊二醛溶液，通过倒置封闭管3–5次混匀。所得溶液为含0.125%戊二醛的1% BSA溶液。
   4. 将蛋白基质溶液静置5分钟，溶液将呈现淡黄色。
2. 配制所需酶溶液（例如，谷氨酸氧化酶）
   1. 通过将过滤的去离子水加入冻干的纯化谷氨酸氧化酶中，制备谷氨酸氧化酶溶液（例如，将50 µL去离子水加入25单位谷氨酸氧化酶中，配制成0.5 U/µL的溶液。
      注意：分装储备液（例如，1 µL）并将等分试样储存于适当大小的容器中（例如，500 µL 微型离心管）中，于 -20 °C 保存。在此条件下，分装样品可保存长达 6 个月。
   2. 向含有谷氨酸氧化酶的微量离心分装管中加入 4 µL BSA/戊二醛溶液。通过手动振荡混合溶液（使用 10 µL 移液器重新吹打）。移液器应设定至相应体积 < 5 µL）。最终溶液含1% BSA、0.125% 戊二醛和0.1 U/µL 谷氨酸氧化酶。配制后立即用于包被。
      注意：谷氨酸氧化酶包被液必须在15分钟内使用完毕。 尽管一个配制好的溶液可用来涂覆多个MEA，但建议不要超过谷氨酸氧化酶的有效使用时间窗口。15分钟内可涂覆的电极数量因情况而异，通常一次可涂覆4至6个电极。
3. 包被MEA
   1. 通常，将微电极阵列（MEA）上的一对记录位点用所需的酶（谷氨酸氧化酶）包被，而另一对记录位点（“哨点”位点）则用非活性蛋白基质包被。
   2. 使用钝头 Hamilton 微量注射器 （例如） 使用10 µL L-谷氨酸氧化酶或非活性蛋白基质溶液（BSA+戊二醛）包被MEA。酶或非活性蛋白基质包被所采用的步骤相同。
   3. 使用前后均需清洗注射器（用去离子水冲洗3次，甲醇冲洗3次，再去离子水冲洗5次）。
      注意：使用专用注射器涂抹酶（谷氨酸氧化酶）或蛋白基质层。 不要对不同溶液使用同一支注射器。 建议先进行蛋白质-基质包被，再进行酶包被。
   4. 使用10 µL Hamilton注射器吸取谷氨酸氧化酶或蛋白基质。轻轻按压推杆，在注射器尖端挤出一小滴溶液（可通过解剖显微镜观察）。
   5. 使用解剖显微镜定位MEA记录位点，通过将溶液液滴/微珠短暂接触记录位点的方式将溶液施加至相应位置，此为一层。蛋白基质和酶涂层均以三层为宜。过厚的涂层会降低MEA的灵敏度。
   6. 将液滴垂直向上提起，脱离记录位点即 注射器尖端不应刮擦MEA表面。
   7. 设置计时器，计时1分钟。这是向记录位点施加涂层之间的最短时间间隔。将酶包被的MEA在4 °C下固化5-7天。
   8. 记录所涂覆的层数、涂覆所需时间、电极编号，以及姓名和日期于实验记录本中。

2. 使用间苯二胺电镀以提高选择性

1. 制备间苯二胺二盐酸盐（mPD）溶液
   注意：镀上排斥层 mPD 可防止多巴胺及其他大分子干扰物（例如，抗坏血酸）的氧化，从而提高传感器对谷氨酸/H₂O₂ 相对于其他潜在干扰分子的选择性。
   1. 用量筒量取 50 mL 的 0.05 M 磷酸盐缓冲液（PBS），转移至容量瓶中，并将 50 mL 的 0.05 M PBS 转移至较大的（150 mL）锥形瓶中。
   2. 使用连接至氮气罐的管路（例如，使用连接压力喷射器的管路），在管路的开口端连接一个移液枪头（例如 P200 枪头）。将带有枪头的管路插入 PBS 溶液中，并用封口膜松散覆盖溶液。打开氮气，缓慢通气鼓泡 20 分钟。
   3. 称取 0.045 g 的 mPD。
      注意：mPD 为潜在致癌物质。称量 mPD 时应在通风橱内的天平上进行。使用 mPD 时应佩戴手套和口罩。确保通风橱正常运行，且挡板处于适当的工作高度。立即清洁可能被 mPD 污染的表面，以避免永久性染色。
   4. 鼓泡结束后，将全部 mPD 转移至脱气后的 PBS 溶液中。用封口膜覆盖瓶口，轻轻摇动溶液使 mPD 溶解。避免剧烈混合或使用涡旋振荡器，以免将气体重新引入溶液中。
   5. 将溶液转移至 50 mL 烧杯中。无需使用搅拌子。
2. 电镀电极
   1. 取一支参比电极。仅使用专用于 mPD 电镀的参比电极。校准步骤应使用另一支不同的参比电极。
   2. 将参比电极支架的塑料臂置于烧杯上方。检查玻璃参比电极内部是否存在气泡（可能无法直接观察到）。轻轻敲击参比电极远端，以去除电极尖端处的气泡。
   3. 将参比电极穿过塑料臂上的开口，缓慢放入盛有 PBS 的烧杯中。确保参比电极不接触烧杯底部。
   4. 将参比电极连接至前置放大器（例如 2 pA/mV），并将待进行 mPD 电镀的 MEA 通过连接器（例如 DIP 连接器）连接至前置放大器。
   5. 将 MEA 缓慢浸入烧杯溶液中，仅使 MEA 尖端浸没于溶液中。切勿将 MEA 尖端浸入液面以下超过黑色“气泡”区域（位于 MEA 尖端上方的黑色绝缘层）。否则可能损坏 MEA。
   6. 运行一次“测试”校准，以验证电极通道及其与前置放大器连接的功能性。
      注意：尽管硬件设置应反映所用设备，但“测试”校准无需输入与分析物/干扰物类型及浓度相关的具体参数。“记录模式”应设为“安培法”，“施加电压”应设为 -0.7 V。确认所有通道均呈现典型记录信号。
   7. 当所有记录位点的连接均已确认后，选择“取消”退出。无需保存校准数据。
   8. 在桌面上选择 "电镀" 图标，电镀工具菜单将出现。请核对以下参数设置是否正确：
      峰-峰值（P-P amplitude）：0.25
      偏移量（Offset）：-0.5
      频率（Frequency）：0.05
      持续时间（Duration，min）：20
   9. 点击“暂停”按钮开始电镀。计时字段应开始倒计时。
   10. 当电镀完成（时间耗尽）后，在弹出菜单中选择“另一支 MEA”以开始对下一支 MEA 进行 mPD 电镀。将已电镀的 MEA 更换为待电镀的 MEA，并使用电镀工具重复电镀程序。
       注意：建议使用配制的 mPD 溶液不超过 2 次或在 1 小时内使用完毕。若需制备超过 2 支 MEA，请重新配制新鲜溶液。
   11. 选择“退出软件”以结束电镀过程。用去离子水冲洗经 mPD 电镀的电极尖端（以避免盐残留），并在校准前存放 24 小时。
   12. 将参比电极从溶液中取出，并用去离子水冲洗后，放入适当的储存液中（例如 3 M NaCl）。确保参比电极尖端完全浸没于溶液中。缓慢将玻璃参比电极放入溶液，以防损坏玻璃。
   13. 将 mPD 溶液弃置于贴有适当标签的危险废物容器中。

3. 谷氨酸检测与选择性的MEA校准（图1）²¹

1. 配制校准所需溶液。
   注意：请参阅 表1.
2. 在37 °C条件下，于磁力搅拌器（电池供电）持续搅拌下进行校准。打开加热垫或循环水浴，并取一个小型搅拌子。缓慢搅拌，但速度需足够快，以确保每次加入物质（见下文）后能迅速达到新的稳定值。
3. 将前置放大器（2 pA/mV）连接至记录控制系统，并将MEA探头插入盛有40 mL 0.05 M PBS的50 mL烧杯中，同时搅拌溶液。
4. 连接参比电极。轻弹末端以确保无气泡残留。
5. 打开记录程序并点击 "校准"确保设置正确（检查是否已选择哨点位点，因为不同电极可能导致选择变化），选择MEA编号，然后按下 "开始".
6. 静置5 - 10分钟以达到平衡；待基线稳定后开始操作（< 0.004 nA/分钟 变化）。
7. 选择 "基线" 加入500 µL 20 mM抗坏血酸（干扰物；终浓度[250 µM]）并选择 "干扰物" （AA 被认为是一种全脑范围的干扰物），一旦电流达到一个新的稳定平台（如有），每次添加之间应间隔 0.5 - 1 分钟。如果 MEA 已正确电镀，则几乎不应观察到任何变化。
8. 加入 40 µL 20 mM L-谷氨酸（终浓度 [20 µM]），待电流达到新的稳定平台期后，标记为 1^st 加样 "分析物"重复三次，共添加3次谷氨酸。
9. 加入40 µL DA。 不要选择 "分析物"；选择 "测试物质" - 多巴胺可能仅在含有多巴胺的区域中产生干扰。
10. 加入 40 µL 过氧化物。 不要选择 "分析物"；选择 "测试物质".
11. 点击 "停止" 校准完成后点击按钮。
12. 为确定MEA的功能，点击计算选项卡，并在实验记录本中记录以下参数。
    1. 对于MEA设计（3,000 µm）²) 用于这些校准的微电极阵列（MEA），应选用灵敏度斜率 ≥ 0.004 nA/µM 的电极；但在某些实验中也可使用斜率较低的 MEA。若酶包被位点与未包被位点之间的斜率差异小于 10%，则仅可将该 MEA 用于诱发释放实验，或对 MEA 进行清洗或弃用。
    2. 检测限（LOD）应 ≤ 1.5 µM。若检测限大于 1.5 µM，则仅可将这些微电极用于诱发性释放和摄取实验，不可用于记录张力性水平。
    3. 选择目标分析物的特异性（即，谷氨酸）相对于干扰物的 > 20任意单位。如果选择性低于20，则清洗或弃用MEA。
    4. 使用线性度（R²校准曲线的线性度应≥0.90。若线性度低于0.90，则清洗或弃用MEA。
13. 使用MEA编号、日期以及校准人员的姓名首字母缩写来保存文件。

4. 组装微量移液器

注意：微量移液器（毛细玻璃）的尖端内径应为 10 - 15 µm。

1. 将微量移液器置于四个铂记录位点的中央，使用粘性石蜡和油泥将其固定在MEA上方50-100 µm处。
2. 使用装有谷氨酸或KCl溶液的1 mL注射器、0.22-µm无菌注射器滤器以及97 mm长、28号规格的移液器填充针，从底部（即朝向MEA的一端）向微量移液器中灌注溶液，顶部插入针头，确保无气泡产生。
3. 将微量移液器连接至压力喷射系统，施加2 - 20 psi压力，持续约1秒。

5. 为体内使用制备微型参比电极的镀层

1. 配制镀膜溶液（在100 mL烧杯（镀膜槽）中加入50 g NaCl和90 mL 1 M HCl），并截取一段浴槽电极（约10 cm长的铂（Pt）丝（直径约0.02"））。
2. 截取一段10–15 cm长的聚四氟乙烯（Teflon）涂层银丝（裸丝直径0.008"），用剃刀刮去银丝两端各约1 cm的Teflon涂层。
3. 在其中一端焊接一个金针，并将银丝裸露的一端插入镀膜槽中。
4. 使用直流适配器（仅使用输出约为9–15 VDC最大值的直流适配器），将"红色"（+）导线夹在银丝（参比电极）的金针端。将"黑色"（-）导线夹在Pt镀膜槽阴极上。
5. 接通直流适配器电源。观察正确的镀膜过程——镀膜槽电极处应有气泡产生；参比电极变为银灰色。
   注意：切勿接反导线（黑色（-）与红色（+））——若发生接反，镀膜槽将被破坏，需重新配制新鲜镀膜溶液。劣质溶液会呈现黄色：切勿使用！
   注：镀膜反应通常需要2–5分钟：Ag⁰ + Cl^- → AgCl + e^-
6. 测试参比电极。
   1. 将万用表设置为100–200 mV直流档。
   2. 将一个基准电极（即先前已测试确认正常工作的参比电极）置于3 M NaCl溶液中，并与新镀制的参比电极进行测试对比。
      注：若使用新的参比电极，使用前应将其在3 M NaCl溶液中浸泡（建议12小时）。
   3. 将"红色" （+）导线连接至待测参比电极的金针上，将"黑色" （-）导线连接至基准电极。可接受的读数范围为±10 mV。两个参比电极之间的理想读数为0 mV。

6. 用于MEA记录的常规动物手术

1. 手术准备
   1. 前一晚将手术器械放入消毒液中。
   2. 将器械从消毒液中取出，彻底冲洗后放置于无菌手术垫上。准备一个加热垫。
   3. 按照步骤3和4所述校准两个电极，并连接微电极毛细管。
   4. 按照第5节所述方法制备参比电极。
   5. 配制200 µM谷氨酸和70 mM KCl溶液。参见表1。
   6. 取实验动物，并在手术记录单上记录其体重。
   7. 准备麻醉剂，并打开加热垫。
2. 进行MEA手术
   1. 使用异氟烷（在氧气中流量为4%）在诱导室中对动物进行麻醉，直至呼吸频率显著下降且动物对脚趾或尾部夹捏无反应。每15分钟记录一次呼吸频率和体温。
   2. 将动物置于立体定位仪中，使用耳杆固定头部。确保动物固定稳妥，头部无移动。将异氟烷流量降低至氧气中的1.5–3%。确保加热垫正确放置于动物下方并设定为37 °C，以提供辅助加热。若未提供辅助加热，可能导致严重低体温及动物过早死亡。
   3. 使用无菌棉签涂抹眼膏，并记录呼吸频率和体温。使用电池驱动的剃毛器剃除头顶毛发。使用小型手术剪剪除耳朵附近的毛发。
   4. 此时佩戴无菌手术手套。在头皮上涂抹碘伏，随后用酒精擦拭（重复三次）。
   5. 使用手术刀沿头皮正中线做一直线切口，并用止血钳撑开皮肤。使用无菌棉签吸除血液。使用过氧化氢帮助显露前囟（bregma）和后囟（lambda）。
   6. 通过测量前囟和后囟的背腹（D/V）和内外（M/L）坐标，检查头部是否正确放置。若头部处于水平平面，则坐标变化应为零。根据需要调整头部和耳杆，确保头部处于水平平面。
   7. 找到前囟位置，并将坐标归零。根据目标坐标向左右移动，并用永久性记号笔做标记。使用电灼器/标记笔围绕该标记画出一个较大的方框，确保有足够的空间到达目标区域。
   8. 使用无菌旋转工具沿方框标记钻孔。使用无菌棉签吸除血液。每次使用前需彻底消毒钻头。
   9. 将MEA连接至头端装置，并用所需的第一种溶液回填毛细管。务必在毛细管中留出一段无液体的空隙，以便观察排出的液体。将管路连接至玻璃微电极毛细管。
   10. 打开氮气罐和压力喷射装置（压力=5 psi，时间=0.6 s）。在开始前按下手动红色按钮进行测试，确保毛细管未堵塞。
   11. 校准微电极毛细管。从目镜刻度的0点开始，在头端装置上贴一片蓝色胶带以标记起始点。打开数字读数器并将其重置为零。向下移动1 mm（背腹方向DV），记录溶液在目镜刻度上移动的刻度数。10个刻度应等于1 mm（1 mm = 250 nL），因此1个刻度=25 nL。
   12. 将参比电极置于远离MEA的位置，但仍需保持与脑组织的液体接触，以完成电路。
   13. 在MEA连接状态下找到前囟位置，并将数字读数器归零。将MEA移动至目标坐标。缓慢降低MEA，直至其尖端接触脑组织。将背腹（DV）坐标归零，并缓慢将MEA插入脑内。
   14. 在记录程序中，点击目标已校准的电极，然后点击 "开始实验"。系统将在动物麻醉状态下开始记录目标分析物的基础水平。
   15. 调整至合适的坐标轴以观察基线，并让电极稳定基线20–45分钟。
   16. 基线稳定后，将压力喷射装置设置为0.6 s和5 psi，按下压力喷射装置上的红色按钮进行喷射。在注射记录单上记录时间、压力以及喷出液体的体积/移动的刻度数（图2）。记录所有必要备注（例如：峰形增大、稀释效应、毛细管堵塞、基线/示波器噪声高等）。
   17. 谷氨酸注射时，每次注射间隔3–5分钟；KCl注射时，每次间隔1–2分钟。使用相同的压力和时间至少注射3次。改变时间后重复实验。除非微电极毛细管堵塞，否则尽量不改变压力。
   18. 若微电极毛细管堵塞，可将压力增加至最高30 psi。
   19. 在目标脑区进行记录，使用不同溶液在脑的双侧重复实验。每个新区域记录20分钟的基础基线。
   20. 取下连接有微电极毛细管的MEA，用去离子水冲洗，并在PBS中浸泡过夜，直至所有血液被清除。
   21. 处死动物，将脑组织保存在预先标记的管中，置于-80 °C冰箱保存，或保留一侧用于固定。处死动物时，使用过量异氟烷（吸入法）实施安乐死。使用手术剪进行断头，并解剖出目标脑区。

7. 使用后清洁包被的微电极阵列

1. 若未使用微电极阵列（MEA），请勿进行清洁。若表面有绒毛或灰尘，可用甲醇清洁，并在包被前晾干24小时。
2. 打开水浴锅（80 °C），将MEA的尖端浸泡30分钟。用棉签小心擦拭电极尖端，以去除可能残留在电极尖端的碎屑。切勿使MEA的黑色"绝缘部分"沾水。
3. 使用三种不同的超声波清洗器，将MEA尖端依次浸泡于（1）Citrisolv（一种商用溶剂和清洁剂） 、（2）异丙醇和（3）去离子水中，每种各5分钟。每次浸泡后，用棉签小心擦拭电极尖端，以去除可能残留的碎屑。
4. 在解剖显微镜下检查尖端，确认各层已成功去除。

8. 分析

1. 要分析数据，首先通过双击已完成的实验并选择所需的实验来导出 "导出数据" 从文件下拉菜单中。
2. 将此数据保存至目标文件位置，然后打开分析程序。点击 "打开" 在分析程序中选择最近保存的文件。
3. 给程序几分钟时间上传文件，然后在事件标记选项卡下查看实验。在输出部分，勾选所需参数的复选框，例如基线、幅值、峰面积（曲线下面积）、T_上升，以及 T₈₀.
4. 单击刷新，然后单击分析，以将数据导出到电子表格（此过程可能需要几分钟）。程序将提示您将文件保存至指定位置。保存后，可在电子表格中编辑该文件。

结果

尽管该技术可用于测量多种动物模型中谷氨酸能信号的改变，例如创伤性脑损伤、衰老、应激和癫痫模型，但本文重点展示如何利用MEA技术研究人源tau蛋白病转基因小鼠模型中的谷氨酸能信号异常^19,20。rTg(TauP301L)4510小鼠表达与17号染色体连锁的额颞叶痴呆和帕金森综合征相关的tau蛋白P301L突变，该模型常用于研究阿尔茨海默病、神经退行性tau蛋白病及额颞叶痴呆相关的tau病理。我们还展示了药理学干预可调节谷氨酸能信号。我们使用利鲁唑处理TauP301L小鼠，利鲁唑是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的疾病修饰药物，可通过稳定电压门控钠通道的失活状态来调节谷氨酸能信号，从而减少谷氨酸释放，并通过上调谷氨酸转运体的表达增强谷氨酸摄取，促进谷氨酸清除^30,31,

讨论

MEA 技术可用于测量神经递质释放与摄取的快速动力学过程 体外 和 在体内 因此，该技术可产生多种数据输出，包括张力性神经递质水平、诱发性神经递质释放以及神经递质清除情况。然而，由于使用微电极阵列（MEA）是一种相对复杂的过程，为确保成功应用，可能需要优化诸多因素。例如，在校准过程中，可能会发现无信号波形（示波器屏幕无显示）或对刺激的响应微弱甚至缺失。这很可能源于系统故障，重启记录系统或计算机可能解决该问题。此外，问题也可能由连接错误引起。在校准前，务必仔细检查MEA和参比电极的连接是否正确。更换前置放大器头段上的DIP插座可能解决MEA连接问题。若MEA未完全浸入溶液中，或使用了维护不良的参比电极，也可能干扰校准期间的记录。校准时信号响应迟缓是另一常见问题，可能由过厚的BSA/戊二醛混合物或搅拌子转速过慢所致。若在校准过程中干扰物产生信号，则可能是电镀过程出现错误例如 电镀时间不足）导致mPD排斥层未形成。此时，必须重复电镀步骤。

手术过程中，一种麻醉深度可能并不适用于所有小鼠；一些小鼠可能需要更高水平的麻醉才能进入麻醉状态&...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FAST-16mkIII-8 通道	Quanteon	16mkIII
微电极阵列	CenMet	W4 或 8-TRK
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A-3059	10 g（1 个月后失效）
戊二醛	Sigma-Aldrich	G-6257	100 mL（6 个月后失效）
谷氨酸氧化酶	US Biological 或 Sigma Aldrich	G4001-01 或 100646	50 UI（6 个月后失效）
哈密尔顿注射器	Hamilton	#80383	2 支
甲醇	BDH	UN1230	4 L
间苯二胺二盐酸盐 (mPD)	ACROS Organics	1330560250	25 g
参比电极 (RE-5B)	BAS	MF-2079	3 支电极
电池供电磁力搅拌器	Cole-parmer	EW-04804-01	可从不同供应商购买
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G-1626	100 g
抗坏血酸	TCI	50-81-7	500 g
盐酸多巴胺	Alfa Aesar	62-31-7	5 g
高氯酸	VWR	UN2920	500 mL
氯化钾	VWR	7447-40-7	1 kg
氯化钠	VWR	7647-40-7	1 kg
氯化钙	MP	153502	100 g
氢氧化钠	BDH	1310732	500 g
玻璃压力喷射移液管	CenMet
粘蜡	Kerrlab	625	可从不同供应商购买
微量注射器	World Precision Instruments	MF28G-5
油泥	WalMart		可从不同供应商购买
Picospritzer III	Parker
银丝	AM systems	#786500
盐酸	BDH	7647010	2.5 L
铂丝	AM Systems	778000
焊枪	Lowes 或 Home Depot		可从不同供应商购买
万用表	WalMart		可从不同供应商购买
PhysioSuite	Kent Scientific		可从不同供应商购买
SomnoSuite	Kent Scientific		可从不同供应商购买
立体定位仪	Stoelting		可从不同供应商购买
数字实验室标准装置	Stoelting		可从不同供应商购买
Meiji EMZ 显微镜	Meiji	EMZ-5
钻头	Dremel	Micro
Metricide	Metrex	102800
手术刀	VWR		可从不同供应商购买
手术剪	VWR		可从不同供应商购买
无菌棉签	Puritan	25806	可从不同供应商购买
眼药膏	Puralube Vet Ointment		从兽医处获取
碘伏棉签	VWR	S48050	可从不同供应商购买
酒精棉签	本地药店		可从不同供应商购买
无菌手术巾	Dynarex	4410	可从不同供应商购买
无菌生理盐水	Teknova	S5815	可使用滤器自行配制溶液
过氧化氢 (3%)	本地药店		可从不同供应商购买
加热垫	WalMart		可从不同供应商购买