在此，我们介绍一种用于精确测量张力性和时相性细胞外谷氨酸变化的空间和时间分辨方法的实验装置搭建、软件操作及数据分析流程 体内 使用酶联微电极阵列（MEA）。
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本文内容
摘要
摘要
神经递质紊乱通常是中枢神经系统（CNS）疾病的关键组成部分，在阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症和焦虑症的病理过程中发挥重要作用。传统上，微透析是最常用（且备受推崇）的技术，用于检测这些疾病中发生的神经递质变化。但由于微透析只能测量在大范围组织中缓慢发生的1至20分钟的变化，因此存在侵入性强、可能破坏脑内固有连接以及采样速度慢等缺点。一种相对较新的技术——微电极阵列（MEA），在实时测量特定脑区内特定神经递质变化方面具有诸多优势，实现了空间和时间上的高精度。此外，MEA的使用具有最小侵入性，可在活体（in vivo）条件下检测神经递质的动态变化。在本实验室中，我们特别关注与阿尔茨海默病病理相关的神经递质谷氨酸的变化。因此，本文所述方法已被用于评估阿尔茨海默病转基因小鼠模型中海马区谷氨酸的潜在紊乱。简而言之，该方法涉及将一种对目标神经递质高度选择性的酶涂覆于多点位微电极表面，并利用自参考点位扣除背景噪声和干扰物质。在完成镀膜和校准后，可将MEA与微移液管组装，并通过立体定位仪精确插入目标脑区。本文所描述的方法包括对rTg(TauP301L)4510小鼠进行麻醉，并使用立体定位仪精确定位海马的亚区（DG、CA1和CA3）。
引言
测量大脑中神经递质的变化是神经科学家研究中枢神经系统（CNS）疾病的重要工具，因为这些疾病通常以神经递质失调为特征。尽管结合高效液相色谱法（HPLC/EC）的微透析技术一直是测量细胞外神经递质水平变化最常用的方法1,2,3,4微透析探针在空间和时间分辨率上可能并不理想，难以准确反映谷氨酸等在细胞外空间受到严格调控的神经递质的变化情况5,6由于遗传学和成像技术的最新进展，现已可采用其他方法来绘制谷氨酸图谱 在体. 利用基因编码的谷氨酸荧光探针（iGluSnFR）和双光子成像技术，研究人员能够同时可视化神经元和星形胶质细胞的谷氨酸释放过程 体外 和 体内7,8,9. 值得注意的是，这种方法能够实现更大视野范围的记录，且不会破坏脑组织的内在连接。尽管这些新型光学技术能够可视化谷....
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方案
1. 用酶或基质层包被微电极阵列
- 制备蛋白质基质溶液
- 称取10 mg牛血清白蛋白（BSA），转移至1.5 mL微量离心管中。
- 向含有 BSA 的微量离心管中加入 985 µL 去离子水。通过手动振荡混合溶液（使用 1,000 µL 移液器反复吹打约 3 次，直至 BSA 完全溶解）。
注意：请勿使用涡旋振荡器混匀溶液，以免将空气引入溶液中。同时，将移液器调至指定体积 <1,000 µL (例如 700 µL）以避免引入气泡。如有必要，可将溶液放入微量离心机中。 - BSA溶液溶解后，加入5 µL 25%戊二醛溶液，通过倒置封闭管3–5次混匀。所得溶液为含0.125%戊二醛的1% BSA溶液。
- 将蛋白基质溶液静置5分钟，溶液将呈现淡黄色。
- 配制所需酶溶液（例如，谷氨酸氧化酶）
- 通过将过滤的去离子水加入冻干的纯化谷氨酸氧化酶中，制备谷氨酸氧化酶溶液（例如，将50 µL去离子水加入25单位谷氨酸氧化酶中，配制成0.5 U/µL的溶液。
注意：分装储备液（例如，1 µL）并将等分试样储存于适当大小的容器中（例如，500 µL 微型离心管）中，于 -20 °C 保存。....
- 通过将过滤的去离子水加入冻干的纯化谷氨酸氧化酶中，制备谷氨酸氧化酶溶液（例如，将50 µL去离子水加入25单位谷氨酸氧化酶中，配制成0.5 U/µL的溶液。
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结果
尽管该技术可用于测量多种动物模型中谷氨酸能信号的改变，例如创伤性脑损伤、衰老、应激和癫痫模型，但本文中我们展示了如何利用MEA技术研究人源tau蛋白病转基因小鼠模型中的谷氨酸能改变19,20。rTg(TauP301L)4510小鼠表达与17号染色体连锁的额颞叶痴呆和帕金森综合征相关的tau蛋白P301L突变，常被用于研究阿尔茨海默病、神经退行性tau蛋白病及额颞叶痴呆相关的tau病理。我们还证明，谷氨酸能信号可通过药理学干预进行调节。我们使用利鲁唑处理TauP301L小鼠，利鲁唑是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的疾病修饰药物，可通过稳定电压门控钠通道的失活状态来调节谷氨酸能信号，从而减少谷氨酸释放，并通过上调谷氨酸转运体表达增强谷氨酸摄取，促进谷氨酸清除30,31,
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讨论
MEA 技术可用于测量神经递质释放与摄取的快速动力学过程 体外 和 在体内 因此，该技术可产生多种数据输出，包括张力性神经递质水平、诱发性神经递质释放以及神经递质清除情况。然而，由于使用微电极阵列（MEA）是一种相对复杂的过程，为确保成功应用，可能需要优化诸多因素。例如，在校准过程中，可能会发现无信号波形（示波器屏幕无显示）或对刺激的响应微弱甚至缺失。这很可能源于系统故障，重启记录系统或计算机可能解决该问题。此外，问题也可能由连接错误引起。在校准前，务必仔细检查MEA和参比电极的连接是否正确。更换前置放大器头段上的DIP插座可能解决MEA连接问题。若MEA未完全浸入溶液中，或使用了维护不良的参比电极，也可能干扰校准期间的记录。校准时信号响应迟缓是另一常见问题，可能由过厚的BSA/戊二醛混合物或搅拌子转速过慢所致。若在校准过程中干扰物产生信号，则可能是电镀过程出现错误例如 电镀时间不足）导致mPD排斥层未形成。此时，必须重复电镀步骤。
手术过程中，一种麻醉深度可能并不适用于所有小鼠；一些小鼠可能需要更高水平的麻醉才能进入麻醉状态&.......
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披露
GG 是 Quanteon, LLC 的唯一所有人，该公司生产本研究中用于谷氨酸检测的 FAST-16 记录系统。JEQ 为 Quanteon 提供有偿咨询服务。
致谢
本研究工作得到了美国普通医学科学研究所（MNR；U54GM104942）、美国国家老龄化研究所（MNR；R15AG045812）、阿尔茨海默病协会（MNR；NIRG-12-242187）、西弗吉尼亚大学教员研究参议院基金（MNR）以及西弗吉尼亚大学PSCOR基金（MNR）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FAST-16mkIII-8 通道 | Quanteon | 16mkIII | |
| 微电极阵列 | CenMet | W4 或 8-TRK | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g（1 个月后失效） |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL（6 个月后失效） |
| 谷氨酸氧化酶 | US Biological 或 Sigma Aldrich | G4001-01 或 100646 | 50 UI（6 个月后失效） |
| 哈密尔顿注射器 | Hamilton | #80383 | 2 支 |
| 甲醇 | BDH | UN1230 | 4 L |
| 间苯二胺二盐酸盐 (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| 参比电极 (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 支电极 |
| 电池供电磁力搅拌器 | Cole-parmer | EW-04804-01 | 可从不同供应商购买 |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| 抗坏血酸 | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| 盐酸多巴胺 | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| 高氯酸 | VWR | UN2920 | 500 mL |
| 氯化钾 | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| 氯化钠 | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| 氯化钙 | MP | 153502 | 100 g |
| 氢氧化钠 | BDH | 1310732 | 500 g |
| 玻璃压力喷射移液管 | CenMet | ||
| 粘蜡 | Kerrlab | 625 | 可从不同供应商购买 |
| 微量注射器 | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| 油泥 | WalMart | 可从不同供应商购买 | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| 银丝 | AM systems | #786500 | |
| 盐酸 | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| 铂丝 | AM Systems | 778000 | |
| 焊枪 | Lowes 或 Home Depot | 可从不同供应商购买 | |
| 万用表 | WalMart | 可从不同供应商购买 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | 可从不同供应商购买 | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | 可从不同供应商购买 | |
| 立体定位仪 | Stoelting | 可从不同供应商购买 | |
| 数字实验室标准装置 | Stoelting | 可从不同供应商购买 | |
| Meiji EMZ 显微镜 | Meiji | EMZ-5 | |
| 钻头 | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| 手术刀 | VWR | 可从不同供应商购买 | |
| 手术剪 | VWR | 可从不同供应商购买 | |
| 无菌棉签 | Puritan | 25806 | 可从不同供应商购买 |
| 眼药膏 | Puralube Vet Ointment | 从兽医处获取 | |
| 碘伏棉签 | VWR | S48050 | 可从不同供应商购买 |
| 酒精棉签 | 本地药店 | 可从不同供应商购买 | |
| 无菌手术巾 | Dynarex | 4410 | 可从不同供应商购买 |
| 无菌生理盐水 | Teknova | S5815 | 可使用滤器自行配制溶液 |
| 过氧化氢 (3%) | 本地药店 | 可从不同供应商购买 | |
| 加热垫 | WalMart | 可从不同供应商购买 |
参考文献
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al.
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重印与许可
