使用高含量显微镜的细胞氧化还原分析

Summary

本文提出了一种高含量显微镜工作流程，用于同时定量细胞内ROS水平，以及线粒体膜电位和形态 - 共同称为线粒体形态功能 - 使用细胞透过性荧光报告分子5-（和 - 6） - 氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯（CM-H ₂ DCFDA）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。

Abstract

活性氧（ROS）调节基本细胞过程，包括基因表达，迁移，分化和增殖。然而，过量的ROS水平诱导氧化应激状态，伴随着对DNA，脂质和蛋白质的不可逆的氧化损伤。因此，ROS的定量为细胞健康状况提供了直接依据。由于线粒体是ROS的主要细胞来源和靶标，所以在同一细胞中线粒体功能和ROS产生的联合分析对于更好地了解病理生理条件的互连至关重要。因此，开发了基于高含量显微镜的策略，用于同时定量细胞内ROS水平，线粒体膜电位（ΔΨm）和线粒体形态。它是基于自动化的宽场荧光显微镜和生物贴壁细胞的图像分析，生长在多孔板和staine中d与细胞可渗透的荧光报告分子CM-H ₂ DCFDA（ROS）和TMRM（ΔΨm和线粒体形态）。与荧光测定法或流式细胞术相反，该策略允许在实验刺激前后具有高时空分辨率的个体细胞水平的亚细胞参数的定量。重要的是，该方法的基于图像的性质允许除了信号强度之外还提取形态学参数。组合特征集用于探索和统计多变量数据分析，以检测亚群，细胞类型和/或治疗之间的差异。在此，提供了测定的详细描述，以及证明其在化学扰动之后在细胞状态之间明确区分的潜力的示例性实验。

Introduction

通过ROS产生和ROS消除系统之间的动态相互作用，精细调节细胞内ROS的浓度。两者之间的不平衡引起氧化应激状态。线粒体的主要来源之一是线粒体¹ 。鉴于它们在细胞呼吸中的作用，它们负责大量的细胞内超氧化物（O ₂ ^{· -} ）分子² 。这主要是由于电子传输链的复合物1在强的负内线粒体膜电位（Δψm）， 即线粒体超极化的条件下，电子泄漏到O ₂ 。另一方面，线粒体去极化也与增加的ROS生产相关，指向多种作用模式^{3,4,5 ，}> ^6，7，8 。此外，通过裂解融合机理的蛋白质的氧化还原修饰，ROS共调节线粒体形态^9。例如，碎片与增加的ROS产生和凋亡相关^{， 10,11} ，而丝状线粒体已经与营养物质饥饿和保护相关mitophagy ¹² 。鉴于细胞ROS和线粒体形态功能之间的复杂关系，两者应理想地在活细胞中同时量化。为了做到这一点，基于自动化宽视野显微镜和用荧光探针CM-H ₂ DCFDA（ROS）和TMRM（线粒体Δψm和形态）染色的贴壁细胞培养物的图....

Protocol

对于NHDF细胞和使用材料文件中指定的多孔板，描述了下面的方案。有关工作流程的总体概述，请参见图1 。

1.试剂的制备

1. 通过用10％v / v胎牛血清（FBS）和100IU / mL青霉素和100IU / mL链霉素（PS）补充Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）来制备完整培养基。对于500 mL完全培养基，加入50mL FBS和5 mL PS至445 mL DMEM。
2. 通过用20mM HEPES补充汉克平衡盐溶液（含镁和钙，但不含酚红）制备HBSS-HEPES（HH）成像缓冲液。对于500 mL HH，加入10 mL 1M HEPES储备溶液至490 mL HBSS。验证pH值，如果需要，调整pH值为7.2。
3. 通过将50μgCM-H ₂ DCFDA冻干粉末溶解在86.5℃下制备1mM CM-H ₂ DCFDA储备溶液，＃181; L无水DMSO。通过涡旋或上下移液混合，并在棕色微量离心管中制备20μL等分试样。储存于-20°C的黑暗中，并在1周内使用。如果储存在N ₂大气保质期内可以增加至少1个月。
   1. 通过将25mg TMRM粉末溶于50mL无水DMSO中制备1mM TMRM储备溶液。通过涡旋或上下....

Results

该测定已经使用几个对照实验进行了基准测试，其结果在Sieprath et al。 ¹ 。简而言之，CM-H ₂ DCFDA和TMRM的荧光响应分别定量分析了细胞内ROS和Δψm的变化，以确定其动态范围。对于CM-H ₂ DCFDA，当用10μM至160μM范围内的增加的TBHP浓度处理时，NHDF显示出荧光信号的线性增加。同样，对于TMRM，当用1〜10μg/μL范围内增加浓度的寡霉素（其诱导Δψm超极化）处理时，NHDF细胞显示线粒体荧光线性增加。相反，实时添加诱导Δψm去极化的抗生素缬氨霉素导致逐渐的，定量的TMRM荧光的最终降低。

该测定法也用于各种实验，以揭示细胞类型或治疗之间的氧化还原状态差异1,15。为了说明这一点，结果显示了用HIV蛋白酶抑制剂沙奎那韦（SQV）处理NHDF的实验（

Discussion

本文介绍了用于同时定量NHDF中细胞内ROS水平和线粒体形态功能的高含量显微镜方法。通过对SQV处理的NHDF的案例研究证明其性能。结果支持早期的文献证据，其中在用1型HIV蛋白酶抑制剂治疗后已经观察到ROS水平升高或线粒体功能障碍，尽管在单独的实验19,20,21,22,23,24,25中。重要的区别是所描述的测定能够在相同的活细胞中同时测量这些参数，以及形态学数据。这种方法的主要优点在于它们在空间和t上的两个因素的明确确定ime，它允许精确定位因果关系。执行主成分分析，其允许产生特定扰动的敏感氧化还原谱。然而，更高级的数据挖掘技术和（监督）聚类算法也可以用于提取的数据，以实现预测氧化还原分析。这可能是数字病理学中诊断或预后分类工具的重要特征，也可用于筛选治疗靶点， 例如，一旦产生了强大的分类模型，可以筛选小分子文库以发现治疗候选物以抵消氧化应激，类似于最近的一个屏幕，有希望导致人类线粒体疾病的治疗发展。

该测定是针对NHDF而设计的，但可适用于其他贴壁细胞类型。这需要优化染色方案和报道染料浓度。数量r必须最小化载体染料，因为过载会导致由于淬火引起的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>试剂
四甲基罗丹明、甲酯、高氯酸盐 （TMRM）	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA（一般氧化应激指示剂）	ThermoFisher Scientific	C6827
二甲基亚砜	Sigma）Aldrich	D8418
MatriPlate 96 孔玻璃底微孔板 630 µL-黑色 0.17 mm 低玻璃盖	Brooks 生命科学系统	MGB096-1-2-LG-L
HBSS 不含酚红 500 mL	Lonza	BE10-527F
含 L-谷氨酰胺的 DMEM 高葡萄糖	Lonza	BE12-604F
不含钙和镁的磷酸盐水 （PBS）	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
胰蛋白酶-Versene （EDTA） 溶液	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F（ab'）2 片段 驴抗兔 IgG （H+L）	Jackson	711-166-152	抗体，用于采集平场图像
Alexa Fluor 488 AffiniPure F（ab'）2 片段 驴抗兔 IgG （H+L）	Jackson	711-546-152	抗体，用于采集平场图像
名称	公司	目录号	注释
设备
尼康Ti日食宽视场显微镜	尼康
完美对焦系统（PFS）	尼康		硬件自动对焦系统
CFI Plan Apo Lambda 20X 物镜	尼康
名称	公司	目录号	评论
>软件
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	尼康		该软件用于控制显微镜并编程/执行自动图像采集 prototocol
ImageJ （FIJI） 版本 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio 版本 1.0.44	Rstudio
R 版本 3.3.2