一种适用于高通量筛选的药物疗效评估方法，用于检测药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌

摘要

开发能够改进下一代抗结核药物早期药物研发流程的新模型和新检测方法具有重要意义。本文介绍了一种快速、经济且符合生物安全二级（BSL-2）标准的检测方法，可用于评估药物对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的疗效，并可轻松适用于高通量筛选。

摘要

抗结核药物的早期药物开发过程因化合物转化效率低下而受到阻碍 体外 从活性到临床效果的转化。这可能是由于未充分考虑感染宿主体内存在的生理相关细胞穿透屏障。我们近期建立了一种替代性感染模型，可形成包含紧密堆积的大型巨噬细胞聚集体结构 M. tuberculosis (Mtb其核心适用于药物敏感性测试。该感染模型成本低、速度快，且最重要的是符合生物安全二级（BSL-2）标准。本文描述了构建该模型的实验操作步骤 Mtb/巨噬细胞聚集结构，可产生经巨噬细胞传代的 Mtb 用于药物敏感性测试。特别是，我们展示了该感染系统可直接适配于96孔板格式，具备高通量能力，可用于化合物库的筛选 Mtb总体而言，该检测方法是对现有可用方法的重要补充 Mtb 因其简便性、成本效益和可扩展性，已成为药物发现工具箱中的重要组成部分。

引言

尽管抗结核化疗方案已问世40多年，结核病（TB）仍然是一个严重的全球健康威胁¹。部分原因在于需要使用多种药物联合治疗，疗程长达6个月以上，导致患者依从性差²。近年来耐药结核病的出现进一步加剧了这一问题，而在该领域中，成功研发并获得临床批准的新药几乎为空白³。事实上，尽管已广泛开展抗结核药物的研发，但在过去40年中，仅有单一药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床⁴。因此，迫切需要新一代抗结核药物来应对这一挑战。

结核病药物发现中的一个关键问题是从具有抗菌活性的化合物到成功临床应用的转化不足 体外 从活性到临床疗效^5,6,7最初，采用基于靶点的方法来筛选抗Mtb 药物⁵，未能成功翻译成完整的细菌细胞。即使在 Mtb 使用细胞时，通常采用液体培养物进行实验，但这种方法无法准确预测药物疗效 体内^8,

方案

注意：由于M. tuberculosis mc²6206 是一种无毒力菌株^17,18，本方案中的所有操作均可在生物安全二级实验室（BSL-2）中进行。

1. 表达绿色荧光蛋白的M. tuberculosis mc²6206（Mtb-GFP）培养条件

注意： M. tuberculosis H37Rv衍生的营养缺陷型菌株mc²6206 (ΔpanCD，ΔleuCD 转化了的 gfp 表达质粒pMN437在本方案中全程使用¹⁶可以替换 Mtb-GFP 菌株，具有非-gfp 表达野生型菌株，以便研究人员更便捷地获取该菌株。然而 gfp 表达是可取的，以实现对吞噬作用及吞噬体形成的直观确认 Mtb/巨噬细胞聚集体。用于长期储存时， Mtb-GFP 样品在添加了20%甘油的完全7H9培养基（见步骤1.1）中于-80 °C冷冻保存。

1. 通过在7H9培养基中添加10% Mi....

结果

为了验证将该感染模型适配于96孔板格式的稳健性，我们在此根据图1A提供的模板，检测了来源于96孔板适配感染模型的Mtb对利福平（RIF）和莫西沙星（MOXI）的药物敏感性。我们证明，该检测所依赖的Mtb/巨噬细胞聚集体结构可在96孔板格式中稳定生成（图2），从而实现高通量兼容性（图1B）。以此方式经巨噬细胞传代获得的Mtb可直接用于药物疗效检测，方法为成熟的刃天青微孔板检测法（图3）。

由于刃天青检测依赖于代谢活跃的结核分枝杆菌（Mtb）产生的氧化性物质，将蓝色的刃天青转化为荧光粉红色的试卤灵，因此颜色和荧光的变化可作为替代指标，用于判断细菌的生长量。在图3A中，我们显示刃天青检测具有足够的灵敏度，仅需3天培养即可.......

讨论

在此，我们详细描述了一种替代方法 Mtb 适用于药物疗效测试的感染模型。该模型在早期结核病药物研发过程中考虑了两个应给予更多重视的关键因素：药物渗透的生理相关屏障的存在，以及代谢变化 Mtb 在感染过程中。我们此前已证实了该感染模型的优势，并提出了将其扩大规模以适应高通量需求的可能性¹⁶，这里我们通过将系统直接适配到96孔板格式，证明了这一点确实可以实现。该方法能够生成 Mtb/巨噬细胞聚集体直接在96孔板中培养具有优势，因为它避免了将聚集体从大培养瓶通过移液分配至各个孔中的步骤，而这一操作本身存在困难，因为聚集体的尺寸可能达到较大程度 >500 µm。感染的巨噬细胞聚集体体积较大，会阻碍通量检测中必需的P200多通道移液器的使用，因为这可能导致吸头堵塞，或反复移液会破坏聚集体结构。将该感染系统改良至96孔板可减少操作步骤，生成均匀且含有相似数量细胞的孔板 Mtb/巨噬细胞聚集体。因此，该检测系统不仅在早期研发过程中用于预测候选先导化合物的疗效方面具有重要价值 体内，但在药物文库的高通量筛选中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7H9	BD Difco	271310	遵循制造商的建议
Middlebrook OADC	BD 生物科学	212351
Tyloxapol	Sigma	T8761	配制20%的H储备液2O；滤膜除菌
D-泛酸半钙盐	Sigma	P5710	制备 24 mg/mL 储存液于 H2O；滤膜除菌
L-亮氨酸	MP Biomedicals	194694	配制50 mg/mL的储存液于H2O；经滤膜除菌
潮霉素B	EMD Millipore	400051	配制 200 mg/mL 储存液于 H2O
Nalgene 方形 PETG 培养基瓶	赛默飞世尔科技	2019-0030
RPMI 1640 培养基	Hyclone	SH30027.01
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S12450H
L-谷氨酰胺	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Cytation 3 酶标仪	Biotek		可与任何荧光酶标仪和显微镜互换使用
Gen5 软件	Biotek		记录与分析刃天青的转化
利福平	Fisher Scientific	BP2679250	配制 10 mg/mL 储存液于 H2O
盐酸莫西沙星	Acros Organics	457960010	在 H 中配制 10 mg/mL 储存液2O
刃天青钠盐	Sigma	R7017	准备 800 μg/mL 储存液于 H2O；滤膜除菌
Tween-80	Fisher Scientific	T164500	配制20%的H储备液2O；经滤膜除菌