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方法文章

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

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DOI：

10.3791/55456

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2017年3月22日

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。

摘要

一种细胞类型直接重编程为另一种细胞类型的技术近年来已成为再生医学、疾病建模和细胞谱系定向的重要研究范式。特别是利用Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5（GHMT）将成纤维细胞转化为诱导性心肌样细胞（iCLMs），为生成心肌样细胞提供了一条重要途径 从头合成 心肌细胞 体外 和 体内最近的证据表明，GHMT 诱导产生的心肌细胞亚型比以往所认知的更为多样，因此凸显了系统性开展进一步研究的必要性。然而，在直接重编程能够作为治疗策略应用之前，必须深入理解谱系转换的分子机制，以生成特定的心肌细胞亚型。本文中，我们提供了一种通过 GHMT 介导重编程小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）生成诱导性心肌样细胞（iCLMs）的详细实验方案。

我们概述了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离、逆转录病毒的制备以及MEF感染的方法，以实现高效的重编程。为了确定重编程细胞的亚型身份，我们详细描述了使用一组特定的兼容性抗体对诱导型心肌样细胞（iCLMs）进行免疫细胞化学染色的逐步操作流程。本文还介绍了共聚焦显微镜的使用方法，以及对iCLMs和各个心房亚型（iAM）、心室亚型（iVM）和起搏细胞亚型（iPM）进行识别与定量分析的技术。最后，我们展示了典型直接重编程实验的代表性结果，并强调了本实验方案中确保高效谱系转换的关键技术要点。综上所述，我们优化后的实验流程可为研究人员提供一个系统的分步指南，用于开展需要鉴定单个心肌细胞亚型的有意义的心脏重编程实验。

引言

心脏是胚胎中第一个发育的功能性器官1,2。它与循环系统协同作用，在发育过程中提供氧气、营养物质，并实现废物清除。受精后三周，人类心脏首次跳动，其正常功能的维持依赖于心肌细胞（CMs）。因此，这些特化细胞的不可逆丢失是导致进行性心力衰竭的根本问题。尽管某些生物（如斑马鱼和非洲爪蟾）具有心脏再生的潜力，但成年哺乳动物的心脏再生能力较为有限3,5,6。鉴于心脏的重要功能，心脏病成为全球首要的死亡原因也就不足为奇，仅在美国每年就导致约60万例死亡7。因此，基于细胞的疗法在有效修复或替代受损心肌方面具有重要的临床研究价值。

山中伸弥及其同事的开创性研究8 研究表明，强制表达四种转录因子足以将完全分化的成纤维细胞转化为多能干细胞。然而，所有多能干细胞策略的致瘤性一直是其在治疗应用中的关键担忧。这促使科学界寻求替代方法，以实现细胞的直接转分化，同时避免经过多能性阶段。近期，多个研究团队已证实该策略的可行性，通过异位表达转录因子Gata4、Mef2c、Tbx5，以及后续加入的Hand2（分别称为G....

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方案

所有涉及动物实验的操作均经由德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会批准。

1. Hcn4-GFP 胚胎小鼠成纤维细胞（MEFs）的分离（E12.5）

  1. 将纯合 Hcn4-GFP 雄性小鼠与 CD-1 雌性小鼠进行定时交配。
  2. 在 E12.5 时通过二氧化碳安乐死法处死怀孕雌鼠，随后行颈椎脱位。
    1. 用解剖镊取出子宫角，方法如前所述22,23，并将其置于含冰上 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，不含 Ca2+ 或 Mg2+）的培养皿中。
  3. 所有后续操作均在组织培养罩内以无菌技术进行。
    1. 用剪刀和解剖镊从子宫和羊膜囊中取出胚胎，保留胎盘以利于操作。通常，怀孕的 CD-1 雌鼠每胎产仔 10 至 14 只。
    2. 用解剖镊夹取分离的胚胎，并在 70%（v/v）乙醇中快速冲洗两次。
      注意：冲洗应迅速，以尽量减少细胞死亡。
    3. 去除胚胎的头部、四肢、尾部及包括心脏在内的内脏器官。
    4. 将剩余组织置于含 1 mL 1× PBS 的 10 cm 培养皿中，用无菌剃刀片精细切割成约 1 mm3 大小的组织块。

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结果

利用PM特异性报告小鼠，我们开发了一种多重免疫染色策略，用于鉴定多种内源性心肌细胞，如图1所示。按照图2所示的重编程步骤，可在第4天起检测到亚型特异性心肌细胞的诱导生成21，尽管效率较低。到第14天，可终止实验并评估肌节结构组织（图3）及细胞亚型特异性（图4）。图5总结了用于免疫细胞化学染色的载玻片制备流程（图5 面板A），以及iCLM亚型特异性细胞的定量分析方法（图5 面板B/C）。

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讨论

本研究提供了一种直接重编程策略，通过逆转录病毒介导的心脏转录因子Gata4、Mef2c、Tbx5和Hand2（GHMT）的表达，将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）转化为多种心脏亚型。结合使用多重免疫染色方法与心肌特异性报告小鼠模型，我们能够在单细胞水平上鉴定出诱导性心房心肌细胞（iAM）、诱导性心室心肌细胞（iVMs）和诱导性起搏细胞（iPMs）。该实验方法为后续研究提供了可行的技术平台。 体外 能够分离单个转录因子在亚型多样性及肌节发育中的作用的系统。同时，该系统可为发现促使诱导型心肌样细胞（iCLMs）偏向特定谱系的新转录因子或小分子提供见解。然而，该检测的成功实施包含若干关键步骤。以下将针对一般iCLM实验中病毒滴度、成纤维细胞质量以及成像分析的影响进行阐述。

在本研究中，我们采用嗜小鼠逆转录病毒对E12.5代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行重编程。我们注意到，逆转录病毒的滴度与细胞质量直接相关。高传代次数（> 35）以及不良的培养技术会显著影响逆转录病毒颗粒的质量；因此，有若干注意事项需加以考虑。Plat-E细胞不产生VSV-G假型病毒，因而无法耐.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

A.F.-P. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：2015165336）的支持。N.V.M. 获得了美国国立卫生研究院（NIH，HL094699）、伯勒斯威康基金（Burroughs Wellcome Fund，1009838）以及出生缺陷基金会（March of Dimes，#5-FY14-203）的资助。我们感谢 Young-Jae Nam、Christina Lubczyk 和 Minoti Bhakta 在实验方案开发和数据分析方面的重要贡献。我们还感谢 John Shelton 提供宝贵的技术建议，以及 Munshi 实验室成员参与科学讨论。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMSigmaD5796iCLM 培养基、Plat-E 培养基、成纤维细胞培养基和转染培养基的组分
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059iCLM 培养基的组分
胎牛血清 (FBS)SigmaF2442iCLM 培养基、Plat-E 培养基、成纤维细胞培养基和转染培养基的组分
胰岛素-转铁蛋白-硒 GThermo Fisher Scientific41400-045iCLM 培养基的组分
MEM 维生素溶液Thermo Fisher Scientific11120-052iCLM 培养基的组分
MEM 氨基酸Thermo Fisher Scientific1601149iCLM 培养基的组分
非必需氨基酸Thermo Fisher Scientific11140-050iCLM 培养基的组分
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher Scientific15240062iCLM 培养基的组分
B-27 添加剂Thermo Fisher Scientific17504044iCLM 培养基的组分
热灭活马血清Thermo Fisher Scientific26050-088iCLM 培养基的组分
丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific11360-70iCLM 培养基的组分
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific1514022Plat-E 培养基和成纤维细胞培养基的组分
嘌呤霉素 Thermo Fisher ScientificA11139-03Plat-E 培养基的组分
杀稻瘟菌素  Gemini Bio-Products400-128PPlat-E 培养基的组分
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061成纤维细胞培养基的组分
共聚焦激光扫描显微镜 LSM700Zeiss用于共聚焦分析
FuGENE 6 转染试剂PromegaE2692转染试剂 
Opti-MEM 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985-070转染试剂 
聚凝胺MilliporeTR-1003-G诱导试剂。使用终浓度为 8 μM/mL
Platinium-E (PE) 逆转录病毒包装细胞系，嗜同种型CellBiolabsRV-101逆转录病毒包装细胞系
0.25% EDTA 胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific用于 MEFs 和 Plat-E 细胞的解离
小鼠抗 α-肌动蛋白抗体（克隆 EA-53）SigmaA7811用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200
鸡抗 GFP IgY 抗体Thermo Fisher ScientificA10262用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200
兔多克隆抗 NPPA 抗体 AbgentAP8534A用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:400
兔多克隆抗 Myl2 IgG 抗体 ProteinTech10906-1-AP用于共聚焦分析的抗体。使用稀释比例为 1:200
含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）的 Vectashield 溶液Vector LabsH-1500用于共聚焦分析的染料
Superfrost Plus 显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat 纤连蛋白 12 mm 盖玻片NeuVitro CorpGG-12-1.5用于共聚焦分析的盖玻片
100 μm 细胞筛Thermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μm SFCA 25MM 注射器滤器Thermo Fisher Scientific09-740-106用于病毒过滤
6 mL 注射器Covidien8881516937用于病毒过滤
山羊抗鸡 IgY（H&L）A488AbcamAB150169用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400
驴抗兔 A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400
山羊抗小鼠 IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422用于共聚焦分析的二抗。使用稀释比例为 1:400
Triton X-100Sigma93443-100ml用于细胞通透化 
不含 CaCl2 和 MgCl2 的杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x 通用封闭试剂Thermo Fisher ScientificNC9495720用 H2O 稀释至 1x
16% 甲醛水溶液 (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710使用时用 dH2O 稀释至 4%
6 cm  培养皿Olympus25-260
6 孔板Genesee Scientific25-105
24 孔板Genesee Scientific25-107
10 cm 组织培养皿Corning4239
15 cm  组织培养皿Thermo Fisher Scientific5442
15 mL 圆锥形离心管Corning4308
50 mL 圆锥形离心管Corning4249
0.4% 台盼蓝溶液SigmaT8154用于细胞活力检测
200 证明乙醇Thermo Fisher Scientific7005
漂白剂Thermo Fisher Scientific6009

参考文献

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6

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