一种定制的高效液相色谱纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42与淀粉样蛋白β40多肽，并支持寡聚体形成

摘要

本文报道了一种定制的高效液相色谱（HPLC）纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42（Aβ42）和淀粉样蛋白β40（Aβ40）肽段，这些肽段具有形成寡聚体的能力。淀粉样蛋白β是一种极易聚集的疏水性肽段，与阿尔茨海默病密切相关。由于该肽段具有淀粉样蛋白生成特性，其纯化过程具有挑战性。

摘要

淀粉样蛋白原性肽（如与阿尔茨海默病相关的淀粉样蛋白β（Aβ））在获取高纯度材料时可能面临重大挑战。本文介绍了一种定制的高效液相色谱（HPLC）纯化方案，用于制备高纯度的淀粉样蛋白β42（Aβ42）和淀粉样蛋白β40（Aβ40）肽。我们发现，在高pH条件下，使用市售的疏水性聚（苯乙烯/二乙烯基苯）固定相——聚合物实验室反相-苯乙烯-二乙烯基苯（PLRP-S），可在单次色谱运行中获得高纯度（>95%）的Aβ42。该纯化方法具有高度可重复性，并可根据所需纯化的样品量调整为半制备或分析条件。该方案同样适用于Aβ40肽的纯化，效果相同，且无需修改方法。

引言

阿尔茨海默病是一种影响全球超过3500万人的神经退行性疾病。¹ 在该病的发病和发展过程中起关键作用的是一种极易聚集的疏水性多肽——淀粉样蛋白β（Aβ）。² Aβ的长度介于36至43个氨基酸之间，但普遍认为，由42个氨基酸组成的变体——淀粉样蛋白β42（Aβ42）——是该蛋白最具毒性的形式。³ 这主要归因于Aβ42易于形成可扩散的寡聚体物种，这些寡聚体被认为具有特别强的神经毒性。⁴ 为了进一步加深对Aβ多肽的理解，常规获得高纯度的样品至关重要。已有研究表明，痕量杂质的存在会显著改变该多肽的聚集倾向性。⁵

传统上，疏水性多肽（如 Aβ）的高效液相色谱（HPLC）分离通常采用基于硅胶的 C₄ 或 C₈ 固定相与酸性流动相相结合的方法⁶。然而，此类条件可能给多肽的纯化带来挑战。Aβ 多肽的等电点较低（pI 约为 5.5）⁷，意味着在酸性条件下，多肽更容易发生聚集，从而产生宽而未分离的 HPLC 峰，这类峰通常难以分离（图 2A）。此外，这些宽峰中常含有杂质，可能影响多肽的聚集特性，通常需要进行后续多轮纯化，这会显著降低最终获得的多肽产量。

聚（苯乙烯/二乙烯基苯）固定相PLRP-S为纯化疏水性肽段提供了一种替代方法。该固定相已被用于多种不同蛋白质和信使核糖核酸（mRNA）的纯化^8,9。PLRP-S固定相在反相分离过程中无需额外的烷基配体，更重要的是，其在高pH条件下具有化学稳定性，有助于肽段的去聚集⁷。本文中，我们报道了一种定制的高效液相色谱（HPLC）纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42（Aβ42）和淀粉样蛋白β40（Aβ40）肽段。

方案

1. Aβ40 或 Aβ42 肽的制备型高效液相色谱纯化

1. 准备用于高效液相色谱纯化的以下缓冲液。
   1. 通过将1.3 mL NH₄OH（28% 溶液）加入1,000 mL超纯水中，配制缓冲液A（20 mM NH₄OH）。
   2. 通过将1.3 mL NH₄OH（28% 溶液）加入800 mL HPLC级乙腈和200 mL超纯水的混合溶液中，配制缓冲液B（含20 mM NH₄OH的80%乙腈）。
   3. 通过将100 µL NH₄OH（28% 溶液）加入100 mL超纯水中，配制样品溶解缓冲液（0.1% NH₄OH）。
2. 按照图1所示设置高效液相色谱仪。
   1. 使用聚合物管路将装有缓冲液A和缓冲液B的溶剂瓶连接至高效液相色谱泵的入口。使用一体式接头将聚合物管路固定在高效液相色谱泵上。确保每种缓冲液的聚合物管路正确连接至仪器对应的入口阀。为高效液相色谱泵配备脱气装置。
   2. 使用聚合物管路将高效液相色谱泵与制备柱（300 Å 8 µm 25 mm × 300 mm）的入口连接（图1B，最左侧柱子，参见材料清单）。
      1. 使用一体式手紧接头将聚合物管路连接至制备柱。确保制备柱方向正确。
         注：制备柱的固定相由聚（苯乙烯-二乙烯基苯）颗粒组成。制备柱的正确方向在外壳上以单个方向箭头标示。
   3. 使用聚合物管路将柱子出口连接至双波长检测器，并将检测器波长设置为214 nm和280 nm。
      1. 通过更改内置高效液相色谱软件中“设置仪器方法”选项内的检测波长参数来调节波长。
   4. 使用一体式手紧接头将聚合物管路连接至波长检测器的入口。将聚合物管路连接至波长检测器的输出阀。使用一体式手紧接头将聚合物管路连接至高效液相色谱检测器的出口阀。此管路将用于样品收集。
      注：由于Aβ肽缺乏强发色团，因此应将214 nm作为峰收集的主要紫外（UV）波长。

图1：用于纯化淀粉样β肽的高效液相色谱仪实验装置。（A）配备脱气装置和设定在214 nm与280 nm的可变波长检测器的四元高效液相色谱泵；（B）用于纯化淀粉样β肽的高效液相色谱柱，从左至右分别为25 × 300 mm² 制备柱、7.5 × 300 mm² 半制备柱和4.6 × 250 mm² 分析柱；（C）用于分析型高效液相色谱的20 µL不锈钢手动进样环；（D）用于制备型和半制备型纯化的10 mL不锈钢手动进样环。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 按照表1所示设置HPLC软件运行纯化方法。通过更改HPLC软件中“设置仪器方法”选项内的溶剂时间表参数来输入纯化方法。点击HPLC软件上的“开启”按钮，启动HPLC泵。
   注意：泵将开始通过制备柱和HPLC仪器输送缓冲液A和缓冲液B的初始比例。
   1. 让系统平衡30分钟，以确保充分平衡。

时间 / min	缓冲液 A 的比例a（%）	缓冲液 B 的比例b（%）	流速d / mL min-1
0	80	20	6
45	75.5	24.5	6
45.01	80	20	6
52.01	80	20	6
52.02	73	27	6
85	73	27	6
92	5	95c	6

表1：使用25 × 300 mm聚合物柱纯化Aβ42和Aβ40肽的时间表。 ^a缓冲液A - 含20 mM NH₄OH的H₂O；^b80% MeCN / 20% H₂O，含20 mM NH₄OH；^c运行15分钟，用于在下一次样品进样前清洗色谱柱；^d为了在HPLC仪器上实现6 mL/min的流速，需将压力上限降低至200 bar。

4. Aβ 肽样品的纯化
   注意：粗肽通过自动固相肽合成获得。¹⁰
   1. 将 3 mg 粗 Aβ 肽溶解于 4 mL 样品溶解缓冲液中。在室温下以 40 kHz 频率超声处理样品 30–60 秒以促进溶解。
   2. 使用配有 16 号不锈钢针头的 5 mL 塑料注射器将整个样品注入 HPLC 柱。按照步骤 1.3 中所述运行纯化方法。
      注意：该系统可通过配备 10 mL 不锈钢进样环的手动进样器实现样品进样（图 1D）。目标 Aβ 肽将在 72 至 74 分钟之间以尖锐且分离良好的峰洗脱出来（图 2C）。
   3. 将洗脱液收集至 50 mL 锥形离心管中。通过直接进样质谱法分析收集的洗脱液，确认 Aβ 峰的身份。¹¹ 洗脱液可在 -20 °C 下保存最多 12 小时。
      注意：由于肽可能发生氧化，不建议将溶液保存超过 12 小时。
   4. 通过液氮快速冷冻收集的 Aβ 肽分装样品，并进行冻干以分离纯化后的肽。在 -60 °C 温度和 20 mTorr 压力下冷冻干燥 24 小时完成冻干过程。
   5. 按照下述分析型 HPLC 方案检测 Aβ 肽的纯度。将肽以冻干粉形式储存于 -20 °C，可保存长达 6 个月。

2. 纯化Aβ蛋白的分析型HPLC分析

1. 按照上述方案第1.1节所述配制高效液相色谱（HPLC）缓冲液。
2. 根据步骤1.2.1设置分析型HPLC系统，如图1所示，安装4.6 × 250 mm分析柱（图1B，最右侧色谱柱），并在仪器上装配带有20 µL不锈钢进样环的手动进样器（图1C）。
3. 按照步骤1.3中的类似说明，在HPLC软件中编程，运行如表2所示的分析方法。

时间 / min	% 缓冲液 Aa	% 缓冲液 Bb	流速 / mL min-1
0	95	5	1
30	50	50	1

表2：Aβ肽的HPLC纯度分析时间表。^a缓冲液A - 含20 mM NH₄OH的H₂O；^b80% MeCN / 20% H₂O，含20 mM NH₄OH。

4. Aβ多肽纯度分析
   1. 将纯化后的多肽溶于样品缓冲液中，配制浓度为1 mg/mL的溶液。
      注：缓冲液配方见第1.1小节。通过测定280 nm波长处的蛋白吸光度（A_280nm）确定蛋白浓度。¹² 计算浓度时所用的摩尔消光系数（ε）为 ε = 1,490 dm³ mol^-1 cm^-1。¹³
   2. 取20 µL的1 mg/mL（222 µM）溶液注入HPLC色谱柱，运行步骤2.3中设定的分析方法。
      注：未用于分析的剩余溶液可用液氮速冻后进行冻干以回收Aβ多肽。冻干操作细节见第1.4.4小节。Aβ多肽在分析柱上的洗脱时间通常在16至18分钟之间（图2D）。使用HPLC仪器配套的内置积分分析软件确定Aβ多肽的纯度。纯度通过积分图谱中各个独立峰并计算多肽主峰所占峰面积百分比来确定。通常，纯度应达到>95%。

图 2：Aβ42 的代表性 HPLC 色谱图。（A）传统的 C₄ 硅胶纯化，条件：缓冲液 A：含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的 H₂O，缓冲液 B：含 0.1% TFA 的 MeCN（乙腈），梯度：在 40 分钟内从 20% 缓冲液 B 升至 27%，随后等度洗脱 27% 缓冲液 B；（B）使用 25 × 300 mm² 聚合物柱进行的制备型纯化，条件：缓冲液 A：含 20 mM NH₄OH 的 H₂O，缓冲液 B：含 20 mM NH₄OH 的 80% MeCN / 20% H₂O，梯度：在 70 分钟内从 20% 缓冲液 B 升至 27%，随后等度洗脱 27% 缓冲液 B；（C）使用 25 × 300 mm² 聚合物柱优化的制备型纯化，条件详见方案描述文本第 1.3 小节中的表 1；（D）使用 4.6 × 250 mm² 聚合物柱进行的分析型 HPLC，条件：缓冲液 A：含 20 mM NH₄OH 的 H₂O，缓冲液 B：含 20 mM NH₄OH 的 80% MeCN / 20% H₂O，梯度：在 30 分钟内从 5% 升至 50% 缓冲液 B。在 A、B 和 C 部分中，对应于 Aβ42 的峰用星号标记。在 C 部分中标记的 Aβ42 峰经收集后，其纯度如 D 部分所示达到 >95%。采用质谱法确认 Aβ42 峰的身份。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

采用PLRP-S固定相与高pH流动相相结合的方法纯化Aβ42肽，可在72至74分钟的保留时间内获得一个尖锐且分离良好的Aβ肽峰（图2C）。通过直接进样质谱法对收集的洗脱液进行分析，可确认该峰的身份。洗脱液可在溶液中于-20 °C保存最多12小时；更长时间的储存可能导致蛋白质氧化。为分离纯化后的肽段，需将洗脱液在液氮中快速冷冻并冻干。纯化后肽段的分析型HPLC结果显示其纯度达>95%（图2D）。相同程序亦可用于纯化Aβ40肽（图3A），无需对方法进行任何修改。分析型HPLC表明Aβ40的纯度大于95%（图3B）。

讨论

Aβ 肽的高效液相色谱纯化在很大程度上取决于所采用的固定相和用于洗脱肽段的流动相的选择。由于该肽段的等电点较低且极易发生聚集，使用传统的疏水蛋白分离色谱条件（如 C4 或 C8 固定相结合酸性流动相洗脱剂）具有挑战性，此时 Aβ 肽通常以一个宽而拖尾、未完全分离的峰形式洗脱（图 2A）。

为解决这一问题，发现PLRP-S固定相在高pH条件下化学性质稳定，适用于Aβ肽的纯化（图2B和2C）。使用高pH流动相可最大程度减少聚集程度，经优化后可获得尖锐且分离良好的峰。在优化后的方案中，缓冲液B的比例在52分钟时迅速从20%升至27%，从而得到清晰界定的Aβ峰（图2C）。该优化方案的前提是所有疏水性杂质在缓冲液B浓度初始从20%升至24.5%的过程中已从色谱柱中洗脱。若存在与Aβ肽疏水性相近的杂质，则可能需要进一步优化HPLC方案。该优化方法在不同批次合成的Aβ肽之间具有高度可重复性，并且无需调整优化程序即可用于纯化肽的40和42两种变体（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安捷伦 1260 Infinity II 四元泵	安捷伦	G7111B	http://www.agilent.com/zh-cn/products/液相色谱/液相色谱泵和真空脱气机/1260-infinity-ii-四元泵
安捷伦 1260 Infinity II 双通道可变波长检测器	安捷伦	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
配备10 mL不锈钢进样环的Agilent 1260 Infinity II手动进样器	安捷伦	0101-1232	http://www.agilent.com/zh-cn/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
配备20 µL进样环的Agilent 1260 Infinity II手动进样器 µL型不锈钢样品环	安捷伦	G1328C	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
环形支架安装支架	安捷伦	1400-3166
安捷伦 PLRP-S 300 Å 5 µ4.6 × 250 mm（分析柱）	安捷伦	PL1512-5501	http://www.agilent.com/zh-cn/products/液相色谱/液相色谱柱/生物分子分离/plrp-s-生物分子柱#特点
Aβ42 或 Aβ40肽			使用CEM liberty全自动多肽合成仪在实验室内部合成。
氨水（NH4OH，28% 溶液	Fisher Scientific	A669-500
乙腈	Fisher Scientific	A998-4
HPLC级水	Fisher Scientific	W5-4
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-954-49A
Supelco PEEK 螺帽 一体式指旋接头，每包5个	Sigma-Aldrich	Z227250
Normject 5 无菌注射器	Fisher Scientific	1481729
16 号不锈钢针头	Rheodyne	3725-086