本文介绍了一种用于在自由活动的新生癫痫幼犬中记录脑电图（EEG）的新技术，并详细描述了该技术的操作步骤、特点及其应用。该方法可实现持续超过1周的脑电图记录。
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方法文章
使用一种新方法在自由活动的新生大鼠中记录脑电图
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脑电图（EEG）是一种用于检测大脑电活动的有效方法，同时也是多种神经系统疾病（如癫痫和神经退行性疾病）的常用诊断工具。然而，由于需要特殊操作和高度谨慎，获取新生儿脑电图记录在技术上较为困难。本文介绍一种用于记录新生大鼠幼崽（P8-P15）脑电图的创新方法。我们设计了一种基于计算机针脚接口的简单且可靠的电极，可轻松植入大鼠幼崽颅骨，用于记录正常脑和癫痫脑中的高质量脑电信号。通过腹腔（i.p.）注射神经毒素红藻氨酸（KA）诱导幼崽发生癫痫发作。本方法所采用的手术植入方式相比其他新生儿脑电图记录技术成本更低。该方法可实现持续超过一周的高质量、稳定的脑电信号记录。此外，该技术也可应用于成年大鼠和小鼠，用于研究癫痫或其他神经系统疾病。
引言
已有充分证据表明，神经元之间持续的通信对于实现正常的大脑功能至关重要。神经元间的通信主要发生在突触部位，其中一个神经元的信息传递给另一个神经元。这种突触传递由两种特化的结构方式介导：电突触和化学突触1。电生理学是研究神经元间通信过程中产生的电信号的学科，这些电信号调控着机体的整体功能和行为2。在众多电生理技术中，脑电图（EEG）是最常用的方法。
脑电图（EEG）是一种用于检测由内部或外部刺激引发的电信号变化的技术。此外，它也是临床诊断和预测多种神经系统疾病（如癫痫、帕金森病和阿尔茨海默病）以及药理学和毒理学因素影响的重要检测手段3。通常，癫痫患者的大脑表现出过度兴奋性和功能连接受损，这些特征可概括为痫样间歇期放电（IEDs），并通过脑电图记录为尖锐的瞬时尖波、慢波、尖慢复合波或多棘波4。癫痫脑的主要特征是自发性癫痫发作，这些发作可通过头皮或脑实质记录，以定位引发发作的脑区5。此外，脑电图在阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病中也具有重要意义。研究表明，AD患者的脑电图记录常出现异常，振荡网络功能受损。然而，目前对神经退行性疾病中网络振荡病理生理机制的认识仍出人意料地不足，亟需进一步研究6。
在本实验方案中，我们设计了一种简单的电极，可用于记录脑电图（EEG），以研究正常和病理状态下大脑中的电活动通信。该方法的手术植入成本低于其他现有技术7。此外，该方法可用于长时间段内高质量、稳定的脑电图信号记录（即 每天记录2-4小时，持续1周）。另外，我们采用了更轻的电极（重量约为26 mg），使动物行为更加自然8。该方法广泛适用于新生大鼠幼崽的脑电图研究，仅需电生理实验室中常用的放大器和数字化仪，无需额外设备。
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方案
动物护理、手术操作和记录程序均遵循华南师范大学动物护理与使用委员会的指导方针。
1. 电极制备（图1A-C）
注意：计算机针脚接口是通信设备中信号接口的一部分，仅为带插针的触点。它由一个插入雌性连接器的雄性连接器组成。
- 借助镊子小心地从计算机针脚位置分离出公针和母针（图1A）。将公针和母针连接在一起形成电极，并使用氰基丙烯酸酯 粘合以形成牢固的结合（图1C）。
- 将电极放入盛有蒸馏水的烧杯中，并置于超声波清洗器中清洗 10 分钟。随后转移至 45 °C 的干燥烘箱中干燥 30 分钟。使用紫外光对电极灭菌 30 分钟。
2. 手术步骤（图1D-F）
- 准备灭菌的手术器械和立体定位仪。使用异氟烷麻醉剂（2.5%）与空气混合对新生大鼠幼崽进行麻醉。当幼崽进入深度麻醉状态后，将异氟烷浓度调整至1.0%。手术前实施尾部或足趾夹捏，以确认麻醉深度适当。
- 将幼鼠的耳棒插入耳道并轻轻固定，以立体定位仪固定幼鼠头部。
注意：不要过度拧紧耳杆，因为新生小鼠的颅骨非常柔软。 - 使用70%乙醇喷洒所有器械以维持无菌手术区域。使用手术刀在头部做一处15 mm的切口。用镊子轻轻从切口四角将头皮从中线处拉开。在皮下放置一些浸有生理盐水的棉球，以保持切口充分敞开图1D).
- 在颅骨上找到前囟和人字缝点，并用铅笔标记。使用注射器针头（26 G）在前额叶皮层（PFC）和海马区各钻两个颅骨孔。
注意：前额叶皮层（PFC）位于颅骨缝合点（bregma）后方 +1.8 mm 处，中线外侧 -0.5 mm 处；而海马位于颅骨缝合点前方 -2.0 mm 处，中线两侧 ±0.5 mm 处。图1D 和 E电极插入深度不应超过皮层表面以下2 mm，以尽量减少脑组织损伤。 - 使用镊子夹持电极，将参考电极和记录电极分别插入前额叶皮层（PFC）和海马。在电极周围涂抹红霉素软膏，以预防可能的感染。使用氰基丙烯酸酯将电极固定。
- 制备牙科丙烯酸树脂水泥，使其呈现黏稠胶状质地。将牙科水泥涂抹于电极及颅骨其余部位，完全覆盖。
注意：在涂抹牙科水泥前，务必彻底干燥颅骨。 - 将5%的苦味酸应用于电极上以保护电极。
注意：整个操作过程应在生物安全柜中进行，以保持无菌条件。 - 将动物从立体定位仪中取出，皮下注射 300 µL 10% 葡萄糖。将其置于加热垫上以恢复。确保动物体温维持在 37 °C 并能够自主活动即， 完全恢复）。术后镇痛给予腹腔注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。
注意：在动物未恢复足够意识（即正常行为和活动能力）之前，不得使其无人看管。 - 将幼崽恢复意识后放回其母鼠所在的笼中。等待两天，直至动物完全恢复。
3. 脑电图记录
- 完全恢复后，将幼鼠颅骨上植入的电极连接至其笼内的放大器。将放大器连接至模数转换器，并将转换器连接至计算机；连接线应小心处理，避免缠绕。
- 在数据采集单元上选择至少 10,000 Hz 的采样率进行记录（发射器带宽为 1–100 Hz）。确保数据被正确采样。
- 获得基线记录后，通过腹腔注射给予幼鼠红藻氨酸（KA）（2 mg/kg）以诱导癫痫发作。KA 注射后 15 分钟，观察并记录癫痫样放电。 通过 KA 诱导的发作通常表现为躯体性发作。
注意： 强直性发作持续时间约为 15.2 ± 0.9 秒，癫痫发作总持续时间约为 62 ± 5 秒。通过腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）可预防 新生大鼠的癫痫发作。 - 保存数字化数据，并使用信号处理软件包（如 spike2）进行分析。通过功率谱分析揭示新生鼠脑电图信号中不同频率成分的功率水平。通过计算 1 至 100 Hz（脑电图频带）范围内的均方根振幅，得出 1 分钟时间窗内的功率值9。
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结果
如果上述手术操作正确实施，即可成功完成单通道大鼠新生幼崽的脑电图（EEG）记录。在注射KA后10分钟，出现规律的行为学表现，表现为不规则运动、抓挠、震颤以及平衡丧失。图2展示了典型的原始脑电图轨迹，以及间歇期、发作强直期和发作阵挛期的扩展轨迹。反复出现的间歇期和发作期脑电图放电模式在注射KA后15–60分钟（30 ± 5.2分钟；均值 ± 标准误）开始出现（图2A 和 2B）。图2D 和 2E 代表最常见类型的强直-阵挛性发作。发作强直期持续时间为15.2 ± 0.9秒（图2D）。代表性结果表明，强直性放电之后紧接着出现阵挛性爆发（图2B、2D 和 2E）。
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讨论
本文报道了通过有线方法在自由活动的新生大鼠幼崽中获取脑电图（EEG）的手术及记录步骤（图3）。研究表明，出生后7至12天（P7-P12）的大鼠幼崽所处的发育阶段相当于足月人类新生儿10,11。在此年龄段的大鼠幼崽中获取高质量的脑电图记录数据在技术上具有较大挑战性。此外，该操作需要特殊的处理技巧和极为细致的操作8。
以往针对新生大鼠 体内 脑电图（EEG）记录的研究通常采用有线记录系统，并在出生后第12天（P12）或更年长的动物中进行12，但这些方法成本非常高。通过使用简单的电极，我们已成功制备出一种电极（图1），可将实验成本降低至仅1美元，同时仍能获得高密度的脑电图记录。该方法的手术植入时间最短可至10分钟，具体时长取决于手术的复杂程度。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（31171355）和广东省自然科学基金（S2011010003403，2014A030313440）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机引脚 | |||
| 镊子 | 得力集团有限公司 | ||
| 502 瞬干胶 | 得力集团有限公司 | 7144 | |
| 干燥箱 | 博迅 | GZX-9140MBE | |
| 异氟烷 | RWD 生命科学 | 902-0000-522 | |
| 立体定位仪 | RWD 生命科学 | 900-0068-507 | |
| 麻醉机 | RWD 生命科学 | 902-0000-510 | |
| 恒温加热装置 | 哈佛仪器 | K 024509 | |
| 放大器型号 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 模数转换器 | 剑桥电子设计有限公司 | 4383 | 数据采集单元 |
| Spike2 | 剑桥电子设计有限公司 |
参考文献
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重印与许可
