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方法文章

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

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DOI：

10.3791/55490

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2017年3月22日

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

本文内容

摘要

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内 采用延时共聚焦成像技术实现此目的。

摘要

遗传学和实验技术上的优势使斑马鱼成为研究基因操作后果的关键模式脊椎动物 体内 在快速发育期间，可研究多种过程，包括细胞增殖、基因表达、细胞迁移和形态发生。重要的是，通过移植技术可轻松生成嵌合体，从而实现对单个细胞在宿主环境影响下的嵌合标记与追踪。例如，通过结合对宿主胚胎的功能性基因操作例如， 通过吗啉寡聚核苷酸显微注射和活体成像，可评估外源性、非细胞自主信号（由遗传修饰的环境提供）对单个移植供体细胞的影响。本文展示了如何利用该方法比较不同遗传背景宿主环境中荧光报告基因表达的起始时间，以此作为细胞命运决定时机的间接指标。

本文中，我们提供了对斑马鱼胚胎进行显微注射以标记供体细胞并在宿主胚胎中实现基因敲降的实验方案，描述了用于制备嵌合胚胎的移植技术，以及制备和运行相关实验的步骤 在体 多胚胎延时共聚焦成像。特别是，在比较基因表达起始等事件的时间进程时，多位置成像至关重要。这需要同时对多个对照组和实验组胚胎进行数据采集。只要能够根据已建立的胚胎命运图谱准确定位移植位置，该方法可轻松拓展应用于任何适合活体成像的器官或组织中外源性影响因素的研究。

引言

可视化重要发育过程的能力在一种 体内 脊椎动物的特性使得斑马鱼成为研究正常生理和疾病状态的关键模型（综述见 1,2特别是神经视网膜作为中枢神经系统中易于获取的部分，因其结构高度有序且相对简单，以及在脊椎动物物种间高度保守的神经元类型，适合用于神经发生研究。 3细胞行为的动态过程，如增殖、细胞周期退出、不对称细胞分裂、命运决定、分化以及神经环路形成，可在整个视网膜发生过程中进行追踪，斑马鱼中央视网膜的这一过程在受精后3天（dpf）即已完成 4,5,6,7.

此外，可以在斑马鱼视网膜中同时评估上述各个阶段中不同基因的功能需求，这一优势优于其他脊椎动物模型——在那些模型中，基因敲除技术所导致的表型只能通过固定组织的死后检查进行评估。特别是利用转基因品系，我们可以在视网膜中可视化并监测荧光蛋白作为报告基因的表达，从而获得与特定神经元细胞类型发生相关的基因表达时间分辨率。由于斑马鱼发育迅速，这些事件可在整个发育期间被实时观察，从而更深入地揭示基因表达在神经元细胞身份获得及细胞行为中的时间重要性。

最后，这些方法可与斑马鱼中的嵌合体制备技术（通过移植实现）高效结合，从而深入揭示基因功能的两个关键方面。首先，通过观察来自供体胚胎的移植细胞（在该胚胎中特定基因被敲低），当这些细胞在未标记的野生型环境中发育时，可使我们以细胞自主性的方式获得有关基因功能的重要信息。这有助于深入理解视网膜命运决定因子在正常表达这些因子的前体细胞中的功能。例如，通过分析那些无法从这些基因产生功能性蛋白的前体细胞的发育命运结局，即可阐明上述机制4,6,8,9。利用该方法，我们已证明许多命运决定因子（例如，Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）以细胞自主性方式发挥作用，驱动特定视网膜神经元命运的建立；基因表达缺失主要导致细胞命运转换，即基因敲低的细胞通过采用替代的命运路径而保持存活4,6,7,10。其次，此类嵌合体实验可用于评估野生型前体细胞在不同遗传环境中发育时的行为变化。例如，通过比较通常表达目标基因（及报告转基因）的野生型细胞在野生型与经遗传操作的宿主环境（例如，基因敲除/敲低）中的发育过程，可评估宿主环境对基因表达和细胞命运的影响。已有研究表明，宿主环境中某些神经元类型的缺失会以非细胞自主性方式影响野生型前体细胞的行为，使其倾向于分化为数量不足或缺失的神经元类型4,7,11,12。鉴于视网膜神经元通过特定神经元命运决定基因（命运基因）的时序性表达，以保守的组织发生顺序产生（命运基因表达）（综述见13），我们利用这些方法证明了当野生型前体细胞在细胞组成异常的视网膜宿主环境中发育时，其命运基因表达的时序如何受到影响。本文中，我们概述了这些方法，以证明相对标准且广泛应用的技术组合如何实现对发育中视网膜前体细胞命运基因表达时序的深入研究8,9。

本方案描述了一种将延时成像与胚胎移植操作简便性相结合的实验方法 离体 利用斑马鱼胚胎发育过程，追踪整个发育性视网膜发生期间单个马赛克标记细胞的动态变化。通过在宿主胚胎、供体胚胎中单独或联合进行功能基因操作，或两者均不操作，可评估基因功能的细胞自主性。该方法可广泛适用于其他研究体系中类似科学问题，前提是这些体系适用于本文所述各项技术组分。

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方案

所有操作均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物护理和使用的实践准则进行，并经机构伦理委员会批准。

1. 斑马鱼的准备

  1. 成年鱼配对
    1. 在使用前一晚，将成年鱼以单对（或两对）的形式放入适当大小的繁殖缸中。
    2. 为防止雌鱼与雄鱼接触，使用隔板将其分隔开，但允许彼此可见。
    3. 次日早晨开灯后，移除隔板，让鱼自由交配，期间避免干扰。
    4. 成功交配后，将成年鱼放回其原始饲养缸中。
      注：宿主与供体品系可以相同，例如，任意野生型（WT）品系。本研究中，供体胚胎来源于转基因品系 Tg(atoh7:gapRFP)、Tg(atoh7:gapGFP) 或 Tg(vsx1:GFP)，这些品系中命运决定因子的表达可分别用于可视化早期或晚期神经命运 14,15,16。为比较不同遗传环境的影响，宿主胚胎可采用特定的突变体或形态发生抑制子（morphant），如下文所述。
  2. 胚胎收集
    1. 使用茶筛从繁殖盒中收集卵子。每15分钟检查一次卵子，以确定产卵时间，并确保收集到单细胞期胚胎用于后续步骤。
    2. 用E3培养基（5 mM NaCl、0.2 mM KCl、0.4 mM CaCl2、0.9 mM MgCl2 和2%亚甲蓝溶于蒸馏水中）冲洗胚胎，并将其置于含有约40 mL E3培养基的培养皿中，每90 mm直径培养皿中最多放置50枚卵 17。
    3. 在培养皿上标注品系名称、日期和产卵时间。使用巴斯德移液管在解剖显微镜下观察时清除任何碎片。
    4. 将胚胎在28.5 °C条件下培养至受精后约3小时（hpf），用于移植，或继续进行显微注射。
      注：进行移植时，应确保供体与宿主胚胎处于相近发育阶段。因此，可根据Kimmel 等 18 的方法，在25–32 °C之间调节不同组胚胎的培养温度，以减缓或加速某一窝胚胎的发育，使其与另一窝同步。
    5. 从收集时起，将约20枚转基因供体胚胎在32 °C下不进行注射处理，直至进行延时成像（24–28小时后）。
      注：这些胚胎的发育速度将快于实验组，荧光标记物表达更早，因此可用于设定成像参数（激光功率、增益）。在此特定示例中，实验组的成像在转基因表达之前即开始，以评估该事件发生的精确时间点。

2. 显微注射的准备

  1. 显微注射针的制备
    1. 使用拉针仪从每根硼硅酸盐玻璃毛细管（1.0 mm 外径 / 0.78 mm 内径 / 100 mm 长玻璃毛细管）中心处拉制针头，获得两根长度相等的针。目标是制备出具有长锥形杆部的针头。
      注意：此处所用拉针仪的示例设置参数见 材料列表。
    2. 将拉制好的针头存放于培养皿中，并用可塑性橡皮泥或胶带将其固定。
    3. 在注射前，将针尖置于解剖显微镜下对焦，使用镊子轻轻折断针尖以打开开口。目标是获得尖锐、锥形且开口较小的针尖（图1C）。
  2. 宿主胚胎的吗啉代寡核苷酸制备
    1. 订购针对目标基因特异性设计的吗啉代寡核苷酸，以及标准对照吗啉代或适当的5个碱基对错配对照，以排除操作和处理过程带来的影响。
      注意：本实验中使用了序列5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3'的Ptf1a翻译阻断型吗啉代，该吗啉代可抑制中间出生的水平细胞和无长突细胞的发育；同时使用了靶向人类β-珠蛋白内含子突变的标准对照斑马鱼吗啉代（5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'）7,19。
    2. 配制1 mM的吗啉代储存液（约8 - 8.5 ng/nL），室温保存。
    3. 在注射当天，将一份吗啉代样品（10 µL）于65 °C加热10分钟，短暂离心后置于冰上冷却至65 °C以下（之后可在使用期间保持室温）。此步骤可逆转吗啉代溶液中可能形成的聚集，从而提高基因敲低效率。
      1. 对于Ptf1a吗啉代及其相应的标准对照吗啉代，用去离子水稀释储存液，配制浓度为6 ng/nL 的工作液，室温保存。
        注意：每个胚胎注射2 nL 吗啉代，因Ptf1a吗啉代需达到每个胚胎12 ng的相对较高工作剂量，此前已有研究确定7。对于大多数吗啉代，每个胚胎2 - 5 ng即可有效，因此可将储存液稀释至2 - 5 ng/nL ，每胚胎注射1 nL 。
  3. 制备荧光组蛋白融合报告基因构建体以标记供体胚胎
    注意：为了在宿主胚胎中区分和可视化供体细胞，有多种方法可用于标记供体胚胎，包括在单细胞期供体胚胎的卵黄中显微注射H2A-GFP（若使用表达红色荧光报告基因的转基因供体）或H2B-RFP（若使用表达绿色荧光报告基因的转基因供体）的mRNA。
    1. 线性化至少1 µg含有报告基因DNA的质粒。
      注意：本实验中使用NotI限制性内切酶消化，对含有H2A-GFP或H2B-RFP（由伦敦大学皇家霍洛威学院Christopher Wilkinson博士构建）的pCS2+质粒（由密歇根大学David Turner教授和慕尼黑生物医学中心Ralph Rupp教授构建并惠赠）进行线性化处理。
    2. 按照制造商说明，使用市售试剂盒纯化DNA。
    3. 根据制造商说明，使用适当的RNA聚合酶和市售试剂盒进行体外转录生成mRNA。对于pCS2+质粒，使用SP6聚合酶试剂盒。
    4. 使用商业试剂盒或苯酚-氯仿抽提结合异丙醇沉淀法纯化mRNA，具体操作按制造商说明进行。将mRNA溶于超纯水中（20 - 30 µL），用分光光度计测定浓度后，于-80 °C保存。
    5. 在注射当天，用无菌水配制终浓度为100 ng/µL 的mRNA工作液，并置于冰上保存。未使用的mRNA储存液应立即放回-80 °C保存。

3. 在单细胞期胚胎中显微注射 Morpholino 和/或 mRNA

注意：显微注射用于标记所有供体细胞，并制备不同的宿主环境（对照和基因敲低），涉及注射 mRNA 或反义吗啉代寡核苷酸20,21。

  1. 注射针的装载与校准
    1. 使用微载样吸头通过反向加样法将 3 μL 吗啉代寡核苷酸和/或组蛋白-荧光融合 mRNA 溶液装入注射针中。
    2. 轻摇溶液，使其流向注射针尖端，直至无气泡残留。使用带有内置玻璃插芯的注射针，以便溶液主要依靠毛细作用被吸引至针尖。
    3. 将注射针安装至固定在显微操作器（三维手动显微操作器）上的针夹中，并确保其在管状外壳内密封良好。
    4. 打开压力调节式显微注射仪的电源和气体供应。
    5. 将针尖浸入培养皿中的矿物油液滴中（若使用目镜测微尺），或使针尖悬于千分尺载玻片上方，以校准液滴体积。踩下脚踏开关进行注射，测量注射体积，并调节气体压力和/或注射时间，直至注射体积达到 1 nL （直径约 125 μm）。
      注：使用千分尺载玻片的优势在于测量结果不受显微镜放大倍数影响；而使用目镜测微尺时，注射液滴与刻度可同时聚焦，便于观察。
  2. 胚胎显微注射
    1. 将载玻片放入培养皿中，用移液器将单细胞期胚胎沿载玻片边缘排列。使用剪去一半细尖端的微载样吸头将胚胎排列成单列。用精细移液器尽可能吸除多余液体，以防止注射过程中胚胎移动（图 1A）。
    2. 将注射针缓慢下移至每个胚胎上方，平稳穿透绒毛膜和卵黄（图 1B）。
    3. 当针尖位于卵黄中央时，踩下脚踏开关进行显微注射。向单细胞期供体胚胎（转基因型）的卵黄中注射 1 nL 的 H2A-GFP 或 H2B-RFP mRNA。向单细胞期野生型宿主胚胎的卵黄中踩下脚踏开关两次，共注射 2 nL 标准吗啉代寡核苷酸（MO）或 Ptf1a MO。成功的注射可通过卵黄局部轻微形变进行判断。
    4. 抽出注射针，移动培养皿使下一个胚胎进入注射位置，继续注射，直至整列胚胎（50–60 个）全部完成注射。
    5. 完成全部胚胎注射后，将培养皿倾斜抬高至 30–45° 角，用 E3 培养基（挤压瓶）形成缓流，将注射后的胚胎转移至新的洁净培养皿中。
    6. 将胚胎培养皿置于培养箱中（温度设为 28.5 °C 或其他适宜温度），确保供体与宿主胚胎发育阶段一致。
    7. 根据需要重复步骤 3.2.1–3.2.6，以获得约 100 个供体胚胎或约 200–250 个宿主胚胎。
    8. 在受精后 1–2 小时（1–2 hpf），在解剖显微镜下检查胚胎，用巴斯德移液器移除未受精且未发育至 2-或 4-细胞期的卵子。

4. 移植前准备

注意：移植技术用于生成嵌合胚胎，从而可在相同的野生型供体前体细胞中评估不同遗传宿主环境的影响9,22,23。

  1. 供体胚胎筛选
    1. 在3 hpf时，在2-5倍镜下检查供体胚胎 在荧光显微镜下选择标记信号的放大倍数。使用GFP plus滤光片（460-500 nm激发，510 nm长通发射）或Texas Red滤光片（540-580 nm激发，610 nm长通发射），挑选发育良好（细胞团对称且细胞大小均匀）且荧光信号强的胚胎。图1D）。转基因报告基因尚未表达。
  2. 琼脂糖注射平板与培养皿制备
    1. 将用E3培养基稀释的2%熔融琼脂糖倒入直径90 mm的培养皿中，静置冷却至培养皿可安全触碰。否则，高温琼脂糖可能导致模具变形。
    2. 将带有楔形突起的塑料模具（6 × 25/模具）漂浮于琼脂糖上图2D、E). 通过将模具的一侧先接触琼脂糖，再缓慢放下另一侧，以避免产生气泡。确保模具位于培养皿中央，或朝向楔形突起最深点的一侧，以便为移植针留出足够的操作空间。
    3. 在室温下让琼脂糖完全凝固。
    4. 将琼脂糖培养皿置于 4 °C 下 30 分钟，然后从一角轻轻抬起，移除模具（例如， 用镊子操作）。在实验前一天制备琼脂糖注射板，加入少量E3培养基并用石蜡膜密封，置于4 °C保存，以防干燥。
    5. 移植前，将E3培养基加入琼脂糖注射板中，并置于28.5 °C培养箱内至少30分钟。
    6. 由于去壳胚胎容易粘附塑料表面，需使用玻璃培养皿，或用含2%琼脂糖的E3溶液在塑料培养皿（直径90 mm）内壁均匀涂覆一层薄层。准备一个用于盛放去壳宿主胚胎的培养皿，一个用于盛放去壳供体胚胎的培养皿，以及每40个移植胚胎配备一个培养皿。储存方法同注射用培养板（4.2.4）所述。
  3. 移液管准备
    1. 剪断细长拉制玻璃尖端巴斯德吸管（2 mL）的尖端 体积，230 mm 长度，100 mm 长尖端）裁剪至便于操作的长度（可选），方法是使用金刚石刀在旋转的同时刻划，直至尖端脱落（图1F).
    2. 确保切口平直。将玻璃移液管的切割面在本生灯上旋转灼烧，进行火焰抛光，以形成光滑的末端，避免损伤去壳胚胎。图1F).
      注意：移液器吸头在火焰中停留过久会导致管口封闭或变得过小，无法适用于胚胎。
  4. 脱膜囊胚期供体与受体胚胎
    1. 手动去壳：使用两把精细镊子逐个撕开卵壳，注意勿触碰胚胎；或采用蛋白酶进行酶解法去壳，以实现大量胚胎的快速同步去壳 9.
      1. 配制 50 mg/mL 的 100 倍浓缩贮存液 蛋白酶混合液，配制100 μL 分装并储存在 -20 °C。
      2. 加入 100 μL 将储备蛋白酶加至10 mL E3 培养基（终浓度为 0.5 mg/mL） 蛋白酶
      3. 将发育良好的宿主胚胎和供体胚胎分别置于两个小型锥形玻璃烧杯（10 mL）中，并尽可能吸除液体。
      4. 加入 5 mL 0.5 mg/mL 的 向每个烧杯中加入蛋白酶溶液，并在解剖显微镜下轻轻摇晃胚胎，观察绒毛膜是否有任何变形迹象。
      5. 继续轻轻搅动。一旦第一个胚胎脱离绒毛膜（chorion），图1D，星号），用E3培养基快速冲洗三次以去除蛋白酶溶液，操作时倒出大部分液体，然后沿瓶壁轻轻加入E3培养基重新填充。在后续所有步骤中，直至移植结束（第5节），均不得使去壳胚胎接触空气，否则胚胎会破裂。每次冲洗之间需在瓶中保留足够的溶液。
      6. 使用火焰抛光的玻璃移液管，将胚胎从锥形烧杯转移至玻璃培养皿或涂有琼脂糖（2% E3 培养基）的塑料培养皿中。转移过程中应轻柔吹打，以去除任何残留的退化卵膜。
  5. 移植针准备
    1. 使用拉针仪，采用与拉制显微注射玻璃针相同的参数，从每根硼硅酸盐薄壁玻璃管（外径1.0 mm / 内径0.78 mm / 长度100 mm）中拉制两根针。
      注意：此处所用的拉针仪示例设置详见材料列表。移植针不带有玻璃内插件，因为后者会损伤被吸入针内的细胞。
    2. 提前制备拉制好的针头，存放于培养皿中，并用可塑性橡皮泥条或胶带固定。
    3. 移植前，在解剖显微镜下将针尖调至焦点，并用镊子将针尖端折开。使用精细镊子调整针的形状，使其呈笛管状（图 2G），或使用所述的替代方法制备尖端形状 23.

5. 通过囊胚移植生成嵌合体

  1. 移植操作设置
    注意：此处使用了自行组装的移植装置（图 2A）。
    1. 将移植针安装到上述显微注射所用的同一针夹中（安装于显微操作仪上，步骤 3.1.3）（图 2A）。
    2. 断开连接显微移液器夹末端与压力调控显微注射仪的注液管路。连接与 1 mL 注射器相连的注液管路（图 2A, B），构成移植装置。
      1. 使用石蜡膜或可塑性填料确保所有连接处密封紧密。通过保持移植针内始终含有一定量 E3 培养基，防止胚胎接触空气。手动操作注射器，将细胞或液体吸入或推出移植针。
  2. 胚胎排列
    1. 用玻璃移液器将供体胚胎转移至琼脂糖模具的第一列，将受体胚胎转移至琼脂糖模具的第 2 至第 6 列（图 2F）。用移液器调整胚胎位置，使卵裂球面朝上。
  3. 移植操作
    1. 将移植针轻轻接触供体胚胎的一个卵裂球细胞，缓慢吸入约 20 - 50 个细胞至移植针中（图 2H）。避免吸入卵黄。
    2. 使用显微操作仪将移植针从供体胚胎中提起。将琼脂糖模具培养皿向左移动，将移植针尖从细胞团侧面插入第一个受体胚胎的动物极。根据命运图谱显示该区域将发育为前脑/眼区24，在表面附近植入 5 - 10 个细胞（图 2I）。整个操作过程中始终保持针尖浸没于 E3 培养基中。
  4. 移植后胚胎的培养
    1. 移除供体胚胎，将受体胚胎保留在琼脂糖模具中，在 28.5 °C 下静置 1 - 2 小时。用含 0.003% N-苯基硫脲（PTU）的 E3 培养基填充玻璃或塑料（涂有 2% 琼脂糖）培养皿，以抑制色素形成，避免干扰成像。使用火焰抛光的玻璃移液器将受体胚胎转移至这些培养皿中，并在 28.5 °C 下过夜培养。
      注意：操作 PTU 时需佩戴手套。

6. 活细胞成像设置

注意：斑马鱼体型小且具有光学透明性，加之发育迅速，使其成为活体成像研究不同细胞和器官的关键脊椎动物模型。in vivo 成像可在多种显微镜上进行，其设置和参数各不相同。以下描述适用于视网膜发育成像的共聚焦显微镜配置5,8。

  1. 嵌合胚胎筛选
    1. 在24至26小时后受精（hpf）时，于荧光体视显微镜下筛选移植胚胎，选择发育良好、健康且在眼原基发育区域可见移植供体细胞（标记为H2A-GFP或H2B-RFP）的胚胎。
    2. 预留最多40枚胚胎用于制片，用移液器将其转移至新培养皿中，并加入0.4 mg/mL 三卡因甲磺酸盐（MS222）用于麻醉胚胎。
      注意：处理 MS222 时需佩戴手套。
  2. 胚胎的固定
    注意：根据是否在倒置显微镜下进行成像，选择合适的成像培养皿 8 或正置显微镜（本文所述）。
    1. 准备几个1.5 mL离心管 含1 mL的塑料管 1% 低熔点琼脂糖，0.4 mg/mL 在E3培养基中加入MS222，并置于40 °C水浴中保持液态。
    2. 用塑料移液管吸取5个胚胎，依靠重力使胚胎沉降至管尖。将移液管轻轻接触已准备好的塑料管表面，该管内含有1%低熔点琼脂糖和0.4 mg/mL MS222 让胚胎沉入管底，同时尽量减少E3的转移量。
    3. 将胚胎置于直径为90 mm的培养皿中，用于直立显微镜成像；或置于玻璃底培养皿（任意尺寸）中，用于倒置显微镜成像。使用永久性记号笔在培养皿上直观地将其分为两半，以便在同一实验中将野生型宿主中的供体成像于一侧，而形态发生异常宿主中的供体成像于另一侧。
    4. 将五个胚胎从琼脂糖塑料管转移至任一培养皿中，加入0.5–1 mL 琼脂糖。用移液管吸除多余的琼脂糖，仅保留少量液滴（约200–300 μL）。若使用直立式显微镜成像，请避免将胚胎置于培养皿边缘1 cm范围内。由于培养皿器壁的限制，用于成像的水浸式浸入镜头可能无法在此区域中心对焦。图 3A).
    5. 使用微量移液器（枪头尖端已折断）将胚胎在侧面方向上排列整齐，直至琼脂糖凝固。对于这两种类型的培养皿，当头部两侧的两只眼睛完全重叠（在X-Y方向上对齐）时，表明胚胎的侧向角度正确。图3B）。对于倒置显微镜的使用，靠近盖玻片的眼睛必须尽可能贴近盖玻片，以便在可调焦范围的限制内实现z轴方向的成像。
    6. 继续每次将五个胚胎分别置于独立的琼脂糖液滴中进行封片。使用更多1%低熔点琼脂糖将各琼脂糖液滴彼此连接，并连接至培养皿侧壁，以防止成像过程中发生移位或侧向移动。图3A).
    7. 完全凝固后，用 E3 培养基（含 0.003% PTU、0.4 mg/mL）覆盖培养皿 MS222）预热至 28.5 °C。
    8. 采用与步骤 6.2.2 - 6.2.8 中所述相同的方法，将约 20 个在 32 °C 条件下培养的转基因胚胎（步骤 1.2.5）置于另一培养皿中进行 mounting。
  3. 成像参数
    注意：分析荧光转基因表达起始的成像无需高空间分辨率的细胞内成像。可使用 W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70-mm 物镜，在 1.5 倍放大下完成。
    1. 根据约20个发育加速的转基因胚胎中外源基因的表达强度，设定激光功率和曝光时间即 在32 °C下培养；步骤6.2.8）。
      注意：对于转基因表达起始时间的研究，实验所用胚胎在设置延时成像时无荧光信号，因此这些加速发育的胚胎对于确定成像参数至关重要。
    2. 对于实验培养皿，观察每个胚胎，并保存胚胎的位置和焦距水平。
      1. 选择具有正确安装角度的胚胎（即 使眼睛外侧尽可能水平）以及强有力的心跳（健康状况的指标）。选择移植的供体细胞（通过H2A-GFP或H2B-RFP标记识别）较少且主要位于视网膜发育的前腹侧象限的胚胎（基因表达波由此处开始）图3C).
        注意：在斑马鱼胚胎中，平均心率为 120 - 180 次/分钟 25在麻醉的胚胎中，健康的心率范围可能为60 - 120次/分钟。心率较慢可能提示活力降低，此类胚胎应排除在研究之外。
    3. 以2 μm为间隔，对最多15个胚胎的视网膜进行光学切片的z轴层扫设置。
      注意：在任何特定实验中能够成像的胚胎总数取决于各项参数（曝光时间和z轴扫描范围）。对所有选定胚胎完成一次时间点成像所需的时间必须短于各时间点之间的间隔。通过牺牲部分深度分辨率，可在时间间隔内成像更多胚胎。在正置显微镜设置中，z轴扫描范围的边界应选取为固定胚胎眼睛的外侧与内侧极限，并在外侧额外增加30 μm，因为在该设置下，胚胎过夜生长过程中其发育中眼睛在z方向会发生位移。这导致每个成像堆栈厚度为100–170 μm（每眼50–85张图像）。
    4. 在32 °C条件下，每隔24分钟（相当于0.5 hpf间隔）使用适用于该转基因的激光/通道进行成像。
      注意：在整个延时成像过程中，胚胎始终置于显微镜的加热腔室内，该腔室覆盖整个显微镜载物台。虽然实验可在28 °C下进行，但通常采用较高温度以加速胚胎发育，确保实验中关键时间点在16至24小时的延时成像期间内被成功捕获。
    5. 使用连续扫描获取代表供体标记（H2A-GFP 或 H2B-RFP，可选）和转基因（Atoh7:RFP 或 Vsx1:GFP）的图像通道。在分析时，仅使用供体标记通道选择合适的胚胎（如所述，在成像开始时采集一个z轴堆栈），随后仅对转基因表达通道进行延时成像。
      注意：或者，仅使用供体标签来筛选合适的胚胎（即 那些在前腹侧象限确认有移植细胞的样本，仅成像转基因通道，可将成像时间缩短约一半，且每次实验可成像和分析的胚胎数量几乎增加一倍（图4).

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结果

本研究提出了一种实验方案，用于评估野生型视网膜前体细胞在形态干扰宿主胚胎内发育时基因表达时序的变化。实验所用宿主胚胎为Ptf1a形态干扰体，其缺乏视网膜中晚期生成的水平细胞和无长突细胞7,26。作为对照，还设置了对照组宿主胚胎，该组胚胎注射了标准对照吗啉代寡核苷酸。

由于中枢神经系统（包括视网膜）中不同类型的神经元发生具有高度保守的组织发生顺序27,28,29,30,31，后续细胞命运的进展可能依赖于早期出生神经元...

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讨论

了解邻近细胞在多大程度上影响关键细胞命运决定因子表达的时间，对于高效指导胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化为特定的终末分化细胞类型甚至模式化组织至关重要。此外，在活体动物的发育细胞中研究这些分子事件，还能提供与这些事件相关的特定细胞环境的动态（时间和空间）信息。 体内此类研究在所有脊椎动物模型中均难以轻易实现。

在本方案中，利用易于操作的斑马鱼胚胎作为脊椎动物模型，在体内研究脊椎动物视网膜这种结构相对简单但高度有序的三维组织中的相关问题。in vivo。以验证一个假说为例：耗竭某一特定视网膜细胞类型会影响视网膜前体细胞的基因表达时序和发育命运。我们还可以利用供体细胞标记物进行逆向追踪，以评估特定细胞在转基因表达之前多久经历了最后一次分裂，或评估该细胞在不同环境中转基因表达之前各个阶段的总体行为（例如，迁移）。针对这些研究，本文介绍了一系列相对易于操作的技术组合，包括吗啉代介导的基因敲低、细胞移植和活体成像。在移植方法方面，本方案提出了一种新型、相对简便且成本较低的移植装置，并展示了该操作系统的便捷性。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了澳大利亚研究委员会发现早期职业研究员项目（ARC DECRA）对 PRJ 的资助（DE120101311）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）对 LP 的研究资助（PO 1440/1-1）。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚联邦政府资金的支持。我们感谢 Jeremy Ng Chi Kei 博士，本文所述实验由其完成，相关内容已发表于 Kei 等，2016年。我们感谢Higashijima教授提供的转基因鱼，感谢Turner教授和Rupp教授提供pCS2+质粒，感谢Wilkinson博士构建H2B-RFP和H2A-GFP载体。我们感谢莫纳什大学FishCore设施工作人员对实验动物的悉心照料。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖BiolineBIO-41025琼脂糖包被培养皿可提前数日制备，用封口膜密封以防止干燥，并于4 °C保存
低熔点琼脂糖SigmaA9414-100G可制备较大体积，微波加热溶解后置于40 °C水浴中维持液态。可分装为1 mL等份（每份用于一组胚胎的固定）
无丝硼硅酸盐玻璃毛细管SDR Scientfic30-0035可使用直径相似的替代品 
带丝硼硅酸盐玻璃毛细管SDR Scientfic30-0038可使用直径相似的替代品 
玻璃培养皿（60 mm直径）Science Supply1070506可使用任意尺寸的玻璃替代品
注射管（2 m）Eppendorf524616004在移植过程中连接针头夹持器与注射器
显微注射模具（带楔形突起的塑料模具）Adaptive Science ToolsPT-1可使用形状相似的替代品
微针夹持器NarishigeM-152可使用任何适配注射针外径的替代品
显微注射仪Narishige 或 Eppendorf Femtojet使用气体压力的气动注射仪
显微操作器Coherent ScientificM330IR可使用类似替代品
微量加样吸头Eppendorf5242956003
矿物油SigmaM5904-500ML
拉针仪Sutter InstrumentsModel P-2000本实验所用拉针参数为：H 430，Fil 4，Vel 50，Del 225，Pul 75。只要能获得合适针尖尺寸，任何拉针仪均可使用
封口膜InterpathPM996任何石蜡膜均可
塑料巴斯德吸管Samco Scientific202
玻璃巴斯德吸管Hirschmann Laborgeraete9260101
蛋白酶KSigmaP5942-25MG 蛋白酶XIV型
N-苯基硫脲SigmaP7629-25GPTU具有毒性，可配制成储备液以避免频繁接触粉末，购买或使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）
Qiaquick凝胶回收试剂盒Qiagen28704可使用任何可用于纯化DNA的替代试剂盒
RNeasy Mini试剂盒Qiagen74104可使用任何可用于纯化RNA的替代试剂盒
SP6 mMessage体外转录试剂盒QiagenAM1340可使用任何可用于SP6介导DNA转录的替代试剂盒

参考文献

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体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响
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