全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

摘要

本文介绍了如何利用HEK293细胞进行电生理全细胞膜片钳记录，以测定通道视紫红质的离子选择性。此处演示了研究一种阴离子选择性通道视紫红质对氯离子选择性的实验步骤。然而，该方法同样适用于其他具有不同选择性的通道视紫红质。

摘要

在过去的十年中，通道视紫红质已成为神经科学研究中不可或缺的工具，可用于非侵入性地调控靶细胞中的电学过程。在这一背景下，通道视紫红质的离子选择性尤为重要。本文描述了通过在HEK293细胞上进行电生理膜片钳记录，研究最近发现的源自Proteomonas sulcata的阴离子传导型通道视紫红质的氯离子选择性。测量光门控光电流的实验过程需要一个可快速切换——理想情况下为单色光——的光源，并将其耦合至常规膜片钳装置的显微镜中。实验前的准备工作包括缓冲溶液的配制、液接电位的考虑、细胞的接种与转染，以及膜片电极的拉制。实际记录不同氯离子浓度下的电流-电压关系以确定其反转电位，通常在转染后24至48小时内进行。最后，将电生理数据结合氯离子传导的理论模型进行分析。

引言

通道视紫红质（Channelrhodopsins，ChR）是一类存在于运动性绿藻眼点中的光控离子通道，作为趋光性和避光反应的主要光感受器。¹自2002年首次被描述以来²，光敏通道蛋白为新兴的光遗传学领域奠定了基础，并可应用于多种可兴奋细胞 例如 在骨骼肌、心脏或大脑中^3,4,5. ChRs 在靶细胞中的表达可使相应细胞的离子通透性受到光的控制。在神经元环境中，这能够实现细胞的光控激活^6,7,8 或抑制^9,10 动作电位（AP）发放的特性——取决于所传导的离子——可通过光实现空间和时间上的精确控制，这突显了视蛋白变体的离子选择性如何决定其在光遗传学中的应用。

最早发现的ChRs来自 莱茵衣藻 和 衣藻属卡特里种 对质子具有通透性，同时也允许钠、钾....

方案

图1：膜片钳装置。 （1）光源，（2）光纤，（3）可编程快门，（4）数字转换器，（5）快门驱动器，（6）放大器，（7）灌流系统，（8）个人计算机，（9）显示器，（10）法拉第屏蔽笼，（11）显微镜载物台，（12）灌流入口，（13）灌流出口，（14）记录室，（15）液位传感器，（16）带琼脂桥的浴槽电极，（17）移液管固定器，（18）探头端，（19）显微操作器，（20）倒置显微镜，（21）显微镜灯外壳，（22）显微镜灯电源，（23）注水U形管，（24）三通阀，（25）防震台，（26）CCD相机。（A）装置的照片和（B）示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 录制前的准备工作

结果

图2展示了按照所述方案进行测量所获得的代表性结果。在绿光照射期间，PsACR1表现出一个快速的瞬时电流，随后迅速衰减至一个稳定的电流水平。光照关闭后，光电流在数毫秒内衰减至零（图2A）。改变细胞外氯离子浓度会引起反转电位的偏移，该偏移可直接在记录的光电流轨迹中观察到。通过对多次测量的反转电位进行分析，可量化因外部氯离子浓度变化所引起的显著反转电位偏移（图2B）。值得注意的是，实测的反转电位与氯离子的计算能斯特电位完全一致（图2C），证实了PsACR1具有高度的氯离子选择性。

图 2：Ps

讨论

在特定的离子和电学条件下测定反转电位，可提供光激活通道视紫红质（ChRs）后转运离子种类的信息。若在复杂的生理介质中仅改变一种离子种类，且测得的反转电位按理论能斯特电位发生偏移，则表明该离子种类是唯一被转运的离子。

然而，对于通道视紫红质（ChRs），由于对不同离子种类的通透性以及传导离子之间的竞争，其反转电位的偏移通常比根据能斯特方程预期的要小。在这种情况下，情况变得更加复杂，必须分别交换所有可能被传导的离子，因而需要多种测量溶液。此外，大多数CCR以及首批人工ACR^9,10,21对质子具有通透性，而质子浓度的变化需要特别细致的分析，因为质子浓度不仅可能改变反转电位，还可能通过影响氢键网络、个别残基的质子化状态以及二级结构的变化，进而影响离子电导⁹、光流动力学^21,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293细胞	Sigma Aldrich	85120602	人胚胎肾细胞
视黄醛	Sigma Aldrich	R2500	全反式视黄醛
FuGENE HD	Promega	E2312	转染试剂
DMEM	Biochrome	FG 0445	杜尔贝科改良伊格尔培养基
琼脂糖	Roth	3810	琼脂桥
CaCl2	Roth	5239	CaCl2·2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	细胞培养
葡萄糖	Roth	HN06	D(+)-葡萄糖
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2·6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-甲基-D-葡糖胺
Na-天冬氨酸	Sigma Aldrich	A6683	L-天冬氨酸钠盐一水合物
柠檬酸	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	限制性内切酶
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	限制性内切酶
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	限制性内切酶
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	化学感受态E. coli
卡那霉素	Roth	T832
LB培养基	Roth	X964
琼脂粉	Roth	6494	琼脂平板
质粒提取试剂盒	Marchery-Nagel	740727.25
青霉素/链霉素	Biochrome	A 2213	细胞培养
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407-5MG	盖玻片包被
微电极拉制仪	定制		火焰抛光
血清移液管	TPP		不同规格
超净工作台	Kojair	Biowizard SL130
搅拌器	IKA	RCT classic
银丝	Science Products	AG-T25; AG-T10	电极，0.64 mm（浴槽）；0.25 mm（电极）
pH计	Knick	765 Calimetric
渗透压计	Vogel	OM 815
显微镜	Carl Zeiss	ID03	火焰抛光
CO2培养箱	Binder	CB150
细胞培养皿	TPP	93040	内径34 mm
盖玻片	Roth	P232	直径15 mm
温度计	Rössel Messtechnik	MTM12
分光镜	Chroma	21011	90/10透射
移液器支架	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
前置放大器	Molecular Devices	CV203BU
放大器	Molecular Devices	AxoPatch200B
数模转换器	Molecular Devices	DigiData1400	数字模拟转换器
光源	TILL Photonics	Polychrome V	设定为540 nm全强度
显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 100
快门	Vincent Associates	VS25
快门驱动器	Vincent Associates	VCM-D1
玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	硼硅酸盐毛细管，末端火焰抛光，外径1.5 mm，内径 0.86 mm
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P1000
灌流系统	Lorenz Messgerätebau	MPCU
三通道滤光片组	Chroma	69008	荧光滤光片  ECFP/EYFP/mCherry
CCD相机	Watec	Wat-221SCCD
光度计	Gigahertz Optik	P9710	测量光强
物镜	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
显微操作器	Scientifica	PatchStar
记录室	定制
电源	Manson	HCS-3202	避免显微镜内置电源产生的电噪声
防震台	Newport	M-VW-3636-OPT-01
法拉第笼	定制或任何匹配的商用台
管路	任意商用，例如Roth		不同尺寸和材质，用于灌流系统和微电极压力施加；琼脂桥
线性摇床	Sunlab Instruments	SU 1000
液接电位计算器	Molecular Devices 或直接来自 Peter H. Barry		程序包含在Clampex采集软件中，或可从  p.barry@unsw.edu.au 获取
数据采集软件	Molecular Devices	Clampex 10.X
数据分析软件	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank 或 Addgene	KF992074.1 或 Addgene 质粒 #85465	编码PsACR1 蛋白的基因
放大器使用指南	Molecular Devices	The Axon Guide