全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

摘要

本文介绍了如何利用HEK293细胞进行电生理全细胞膜片钳记录，以测定通道视紫红质的离子选择性。此处演示了研究一种阴离子选择性通道视紫红质对氯离子选择性的实验步骤。然而，该方法同样适用于其他具有不同选择性的通道视紫红质。

摘要

在过去的十年中，通道视紫红质已成为神经科学研究中不可或缺的工具，可用于非侵入性地调控靶细胞中的电学过程。在这一背景下，通道视紫红质的离子选择性尤为重要。本文描述了通过在HEK293细胞上进行电生理膜片钳记录，研究最近发现的源自Proteomonas sulcata的阴离子传导型通道视紫红质的氯离子选择性。测量光门控光电流的实验过程需要一个可快速切换——理想情况下为单色光——的光源，并将其耦合至常规膜片钳装置的显微镜中。实验前的准备工作包括缓冲溶液的配制、液接电位的考虑、细胞的接种与转染，以及膜片电极的拉制。实际记录不同氯离子浓度下的电流-电压关系以确定其反转电位，通常在转染后24至48小时内进行。最后，将电生理数据结合氯离子传导的理论模型进行分析。

引言

通道视紫红质（Channelrhodopsins，ChR）是一类存在于运动性绿藻眼点中的光控离子通道，作为趋光性和避光反应的主要光感受器。¹自2002年首次被描述以来²，光敏通道蛋白为新兴的光遗传学领域奠定了基础，并可应用于多种可兴奋细胞 例如 在骨骼肌、心脏或大脑中^3,4,5. ChRs 在靶细胞中的表达可使相应细胞的离子通透性受到光的控制。在神经元环境中，这能够实现细胞的光控激活^6,7,8 或抑制^9,10 动作电位（AP）发放的特性——取决于所传导的离子——可通过光实现空间和时间上的精确控制，这突显了视蛋白变体的离子选择性如何决定其在光遗传学中的应用。

最早发现的ChRs来自 莱茵衣藻 和 衣藻属卡特里种 对质子具有通透性，同时也允许钠、钾等单价阳离子通过，对钙和镁等二价阳离子也有一定程度的通透性^11,12,13如今，已有超过70种天然的阳离子通道视紫红质（CCRs）^14,15,16,17 以及若干工程化变体^18,19,20 具有不同性质，例如 光电流大小、光谱敏感性、动力学特性及阳离子选择性等方面均已得到表征。在神经科学领域，通道型视紫红质（CCRs）被用于激活细胞并触发动作电位（APs）；而在多年中，光驱动的微生物泵是沉默神经元所仅有的可用拮抗工具。2014年，两个研究团队同时证明，通过分子工程手段改变假定离子传导孔道内的极性，可将CCRs转化为阴离子传导型通道视紫红质（ACRs）。^9,21随后，在多种隐藻藻类中鉴定了天然的ACRs^22,23,24最重要的是，光激活 ACRs 可介导成年神经元中的氯离子电流，从而在远低于微生物泵所需的光强度下实现神经元活动的抑制，因为微生物泵每吸收一个光子仅转运单个电荷。

通过膜片钳电生理记录技术检测HEK293细胞中光诱导电流，可直接评估ChR的活性。膜片钳技术最初于20世纪70年代末开发²⁵，后由Hamill et al. 进一步改进，能够以高电流分辨率记录单个小细胞的总电流（全细胞模式），并直接控制膜电压²⁶。在细胞培养体系中应用该技术，可精确控制离子环境及电生理记录条件，从而研究离子选择性以及不同离子对总电流的相对贡献。本文以Proteomonas sulcata的阴离子通道视紫红质（PsACR1）^22,23为例，通过在不同细胞外氯离子浓度下记录电流-电压关系，验证其对氯离子的高通透性。

方案

图1：膜片钳装置。 （1）光源，（2）光纤，（3）可编程快门，（4）数字化仪，（5）快门驱动器，（6）放大器，（7）灌流系统，（8）个人计算机，（9）显示器，（10）法拉第屏蔽笼，（11）显微镜载物台，（12）灌流入口，（13）灌流出口，（14）记录室，（15）液面传感器，（16）带琼脂桥的浴槽电极，（17）移液管固定器，（18）前置放大器头级，（19）显微操作器，（20）倒置显微镜，（21）显微镜灯箱，（22）显微镜灯电源，（23）注水U型管，（24）三通阀，（25）防震台，（26）CCD相机。（A）装置的照片，（B）装置的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 录制前的准备工作

	胞内液	胞外液1	胞外液2
	高氯溶液	高氯溶液	低氯溶液
	c  [mM]	c  [mM]	c  [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	2	2	2
MgCl2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
pH	7.2	7.2	7.2
渗透压	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

表1：缓冲溶液的离子组成。 HEK细胞中用于氯离子选择性实验的细胞内（胞内）和细胞外（胞外）缓冲液组成。所用缩写：乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、4-(2-羟乙基)哌嗪乙磺酸（HEPES）和天冬氨酸（ASP）。所有浓度单位均为 mM。

1. 根据表1所示的离子浓度配制记录溶液。
   1. 在超纯水中配制 15 mL 2 M 的 MgCl 储备溶液₂，CaCl₂KCl 和 CsCl。
   2. 根据表1，将细胞内液100 mL和细胞外液500 mL所需的固体成分分别称量至不同的烧杯中，随后加入相应体积的预配母液。例如，配制细胞内液缓冲液时，加入0.3803 g（10 mM）EGTA、0.2383 g（10 mM）HEPES和0.6428 g（110 mM）NaCl，并加入100 µL的2 M MgCl₂母液。₂ 和 CaCl₂ 以及50 µL的2 M KCl和CsCl储备溶液。
   3. 加入超纯水，并使用不会干扰测量的酸和碱小心调节pH值。 即 不由ChR介导，例如柠檬酸和N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG）⁺).
   4. 使用葡萄糖将细胞内液的渗透压调节至290 mOsm，将细胞外液的渗透压调节至320 mOsm。
      注意：轻微低渗的细胞内溶液可提高膜片钳制的成功率²⁶.
   5. 所有溶液均需通过 0.22 µm 滤膜进行无菌过滤。溶液可在 4 °C 保存两周，或于 -20 °C 冻存以长期保存。
2. 计算液接电位并准备记录程序。
   注意：在建立全细胞记录构型后，改变细胞外氯离子浓度会引起显著的液接电位（LJP），必须进行校正^27,28液接电位（LJPs）可直接测量或计算，本文采用后者。本实验方案中将使用在线校正，要求每种外部缓冲液对应一个记录方案。然而，当涉及较多外部溶液时，建议进行液接电位的后期校正，以避免校正错误。
   1. 打开液接电位计算器（JPC）²⁷ 打开“新建实验”对话框，然后选择“膜片钳测量”。接着选择“全细胞测量”和“标准盐溶液电极”，并输入温度为 25 °C。每完成一步后，点击“下一步”按钮确认选择，继续进入下一环节。
      注意：实验在空调实验室中于25 °C室温下进行。实验开始前，确保缓冲液已达到室温。如需改变样品温度，可使用孵育台或孵育腔。浴槽温度可频繁使用温度计测量。
   2. 根据所列浓度，将移液溶液和高氯酸盐缓冲液中所有单独的阴离子和阳离子浓度相加 表1.
      注意：JPC 将根据起始条件计算出 -0.5 mV 的液接电位（LJP）。
   3. 点击“新建浴液”以输入低氯缓冲液的阴离子和阳离子成分。
      注意：根据更改后的细胞外记录液，JPC 现在将计算出 +12.6 mV 的新液接电位（LJP）。
   4. 通过从施加的钳制电位中减去计算得到的液接电位（LJP），为两种测量条件分别准备经LJP校正的实验方案：高氯外部溶液校正值为-0.5 mV，低氯外部溶液为+12.6 mV。因此，两种方案的起始钳制电位分别为-79.5 mV（高氯溶液）和-92.6 mV（低氯溶液），以确保在两种情况下均获得-80 mV的LJP校正后起始钳制电位。
      注意：以下步骤适用于材料清单中提到的数据采集软件。
   5. 在采集软件中打开协议编辑器。切换到“模式”菜单，选择“ episodic stimulation”（ episodic 刺激），并包含 7 次扫描。
   6. 切换到编辑器中的“波形”菜单，添加一个持续200 ms、保持电位为0 mV的时段，随后添加一个持续2 s、起始保持电位为-79.5 mV（高氯条件）并逐步变化的时段。在第二个时段中设置“增量电平”为20 mV，使每次扫描的保持电位增加20 mV。
   7. 在波形编辑器的电压步进期间，施加540 nm光（3.10 mW/mm²）照射，持续500 ms。具体操作为：更改连接的快门所控制光源的“数字位模式”，使其在上述第二个周期开始后500 ms启动（参见1.2.6）。
      注意：光照强度可能影响通道电流的生物物理特性，如电流幅度或失活程度。因此，应始终报告光功率密度。为测量光束经所有光学元件和盖玻片后的光功率，需使用经校准的光度计。为计算光功率密度，应使用物镜测微尺确定物镜的照明视野面积，再将测得的光功率除以该照明视野面积。
   8. 保存高氯化物细胞外溶液的实验方案。修改该方案，将第一级钳制电位替换为 -92.6 mV（低氯化物外部环境）。保存此第二个方案，用于测量低氯化物细胞外条件。
3. 玻璃盖玻片的赖氨酸包被（根据改良方案）²⁹.
   1. 将若干个100个盖玻片放入玻璃培养皿中，加入250 mL盐酸（1 N）。
   2. 将带有盖玻片的培养皿置于线性摇床，120 rpm 振荡 72 小时以清洗盖玻片，随后用超纯水冲洗以中和 pH。
   3. 用少量95%乙醇浸泡以进一步清洁。
      注意：清洁的盖玻片可在后续操作前保存于70%乙醇中。以下步骤需在超净工作台内进行。
   4. 使用本生灯和镊子将每张盖玻片灼烧灭菌，然后转移至新的培养皿中。
   5. 将玻璃盖玻片与无菌的50 µg/mL多聚-D-赖氨酸溶液在室温下于线性摇床（150 rpm）中孵育至少1小时（或过夜）。
   6. 用超纯水清洗盖玻片，以去除多余的聚-D-赖氨酸。
   7. 将盖玻片平铺于无菌纸上干燥10分钟，并用紫外光照射至少20分钟以进行消毒。
   8. 将盖玻片收集至一个用铝箔覆盖的无菌培养皿中，待用。
4. 准备DNA的 Ps使用标准的分子生物学技术将 ACR1 基因与 mCherry 融合。
   1. 克隆编码人源密码子优化基因的序列 Ps将ACR1通过限制性内切酶或其他成熟的克隆方法，插入至peGFP-C1质粒（CMV启动子，卡那霉素抗性）中，使其与mCherry荧光蛋白阅读框保持一致。
      注意：也可使用其他荧光染料，但需确保实验装置中备有相应的滤光片组，以便在显微镜下观察其荧光信号。
   2. 将质粒DNA转化至化学感受态XL1Blue中 E. coli 按照标准方案通过热激转化细胞，并将细胞涂布于含卡那霉素（30 µg/mL）的琼脂平板上³⁰在37 °C下过夜培养平板上的细菌。
   3. 第二天，从单菌落中挑取细胞接种于4 mL含有30 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37 °C、180 rpm条件下在摇床中过夜培养。
   4. 过夜培养后，使用市售试剂盒从菌液中纯化质粒DNA（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
5. 接种细胞
   注意：所有步骤均需在层流罩内进行。
   1. 在35毫米培养皿中并排放置最多三片经赖氨酸包被的玻璃盖玻片。
      注意：轻轻按压使其紧贴培养皿底部，以防止相互滑动。
   2. 种子 1.5 × 10⁵ 每个培养皿中加入2 mL标准DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养HEK细胞。
   3. 补充全部转 以终浓度1 µM的视黄醛处理细胞，继续培养至少一天后再进行步骤1.6。
6. 通过脂质体转染法瞬时转染细胞³¹.
   1. 对于每皿细胞，配制含有2 µg质粒DNA（按步骤1.4制备）的溶液，溶于250 µL不含FBS的DMEM中，并加入6 µL转染试剂（参见 材料表).
   2. 孵育15分钟后，将溶液轻轻逐滴加入细胞中。
7. 制备琼脂盐桥
   1. 将0.75 g琼脂糖加入50 mL无菌氯化钠溶液（140 mM）中，通过微波加热溶解。
      注意：用于制备琼脂桥的 2 - 3 M KCl 因浓度更高，可进一步降低液接电位（LJP）例如 恒定扩散（来自盐桥）以及 K 的迁移率相等⁺ 和 Cl^- 离子，但为尽量减少离子（尤其是 Cl⁻）^-) 渗漏至灌流液中³².
   2. 使用注射器将液体琼脂糖溶液吸入10 µL吸头（或小直径软管）中。
      注意：避免桥接中产生气泡。
   3. 琼脂桥冷却凝固后，将其储存在无菌的 140 mM 氯化钠溶液中。
8. 准备记录电极和浴槽电极。
   1. 移除浴液和膜片钳装置记录电极的银丝。
   2. 用砂纸打磨导线，以去除先前实验残留的氯化银。将洁净的银丝浸入3 M KCl溶液中，并连接至1.5 V电池的正极，进行电解镀氯化银处理。
      注意：可以使用实验室电源代替电池。
9. 使用微电极拉制仪从玻璃毛细管中拉制低电阻膜片钳电极（1.5–3.0 MΩ），并按Brown所述方法进行火焰抛光 等³³将移液器防尘保存至测量当天。
10. 在记录前30分钟开启所有装置组件，使其升温至工作温度。确保缓冲液处于室温。

2. 选择性测量

1. 在完成1.6中所述细胞的瞬时转染后24至48小时开始记录。
2. 将一张盖玻片放入测量室中，并用硅胶密封以防止外部缓冲液泄漏。将装有其余盖玻片的培养皿置于孵育箱中，用于下一轮实验。
3. 小心地用细胞外缓冲液（高[Cl⁻]）填充 chamber^-]) 以防止细胞脱落，然后将其置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。
4. 将琼脂桥置于浴槽电极上方，并与液面传感器及灌流出口一同放入记录室。
5. 用 1 mL 新鲜的外部溶液（高 [Cl⁻]）更换细胞外溶液两次^-]) 以去除残留的培养基和脱落的细胞。
6. 将细胞调至清晰对焦，寻找已转染（带荧光）的细胞，并确保该细胞与其他细胞分离。使用三通道滤光片组和橙色光（590 nm；带宽15 nm；100% 强度）激发并观察 mCherry。
   注意：HEK 细胞可通过间隙连接与邻近细胞形成电耦合³⁴ 导致全细胞构型下膜电阻较低。
7. 用细胞内液填充一支拉制好的移液管，并通过多次翻转移液管以去除气泡。
8. 将移液器安装在移液器架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。
9. 在显微镜下定位膜片钳电极尖端，并使用显微操作器将其移至细胞附近。
   注意：以下步骤适用于材料清单中提到的放大器、数据采集和评估软件。
10. 在数据采集软件中启动“膜测试”，并施加一个电压阶跃（测试脉冲； 例如 5 mV，持续10 ms，基线为0 mV），可通过指定软件在数据采集软件中运行“膜测试”时使用“浴槽模式”手动或自动完成。
11. 检查移液管电阻是否在理想范围内（1.5–3.0 MΩ）。
12. 通过在“膜测试”的“浴液模式”下调节放大器上的移液电极偏移旋钮，调整移液电极电位以校正零偏移电流。
13. 建立全细胞记录模式的膜片钳²⁶.
    注意：以下步骤需要向所用移液器持具的侧端口施加正压和负压。可通过注射器、吹嘴或电子控制的压力调节器实现压力施加。本方案中采用正压和负压 通过 一个吹嘴。
    1. 从上方缓慢将膜片电极移向细胞，并在即将接触细胞时解除正压。
       注意：当电极尖端接近细胞时，电阻会略有上升；这表现为测试脉冲的幅度减小。
    2. 将“膜测试”从“浴槽模式”更改为“膜片模式”，从而使细胞的保持电位达到预期的静息电位（-30 至 -40 mV）。
    3. 在某些情况下，撤去正压后（2.13.1）会自动形成细胞贴附构型；若未形成，可轻轻施加负压以促进吉欧封接的形成。
       注意：当测试脉冲减小为脉冲起始和结束时的两个微小电容峰，且膜电阻达到 GΩ 范围时，即形成细胞贴附式构型；施加最高至 -60 mV 的负电压可能有助于吉格封接的形成。
    4. 通过调节“移液管电容补偿”旋钮，使测试脉冲的响应呈平坦状态，以补偿移液管电容。
    5. 通过施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，使膜片破裂但不破坏封接，以获得全细胞构型。
       注意：细胞贴附式记录成功转变为全细胞记录的标志是电容性峰的增大。
    6. 通过设置所用放大器的全细胞参数和补偿调节，应用串联电阻补偿，以准确将膜电位钳制在目标钳制电压。
       1. 将“膜测试”切换至“全细胞”模式，在“串联电阻补偿”面板中开启“预测”和“校正”功能，最高可达90%，避免电容反应出现过冲和振荡；打开全细胞补偿开关，并通过放大器前面板上的相应旋钮（“全细胞电容”和“串联电阻”）以迭代方式调节全细胞参数，以获得理想平坦的封接测试响应。
          注意：有关串联电阻补偿和校正的详细说明，请参见放大器使用手册或操作指南，因为不同制造商的操作流程可能有所不同。
    7. 建立全细胞记录模式后，需等待至少2分钟再开始记录，以确保通过膜片钳电极充分置换细胞内液。³⁵.
14. 使用先前建立的方案（1.2 节中设置）在不同钳制电位下记录光诱导电流。
15. 将细胞外缓冲液更换为低[Cl⁻]缓冲液^-] 在不破坏封接的情况下，至少在舱室内重复五次，并记录另一条电流-电压关系曲线（参见 步骤1.2）在新的氯化物浓度下。
    注意：使用自动化缓冲液置换灌注系统可促进该过程，但并非必需。
16. 针对每种待测的离子条件，重复步骤 2.15，但在各次测量之间需反复通过上述“膜测试”检查封接质量。
    注意：为确保膜电位准确且细胞内离子成分稳定，膜电阻应高于 500 MΩ，而接入电阻不应超过 10 MΩ，参见. 2.12.6）进行膜电容测试时，切记关闭全细胞参数补偿。
17. 重复步骤 2.2 至 2.15，对多个细胞进行操作，但每次测试系列需使用新的盖玻片，以确保细胞的健康状态。

3. 数据评估

1. 通过减去光照前的平均电流，调整每条电流轨迹的基线。
2. 通过取光照最后 40 ms 内电流的平均值，计算稳态光电流 I_s（图 2A）。
   注意：根据实验方案或科学问题，可分析峰值光电流或调整平均时间长度以确定稳态光电流。
3. 对所有测试条件和不同细胞重复步骤 3.1）和 3.2）。
4. 将测定的光电流对相应的钳制电位作图。
   注意：若对多个测量值进行平均，可将单个记录归一化至某一特定条件或细胞电容。
5. 电流-电压关系曲线与电压轴的交点即为反转电位（净电流为零）。通过相邻两个数据点之间的线性插值确定该值。
   注意：若光电流未发生极性反转，可从最接近零的最后两个点进行线性外推，以估算交点位置。
6. 对相同条件下的测定反转电位取平均，并将其对细胞外缓冲液的氯离子浓度作图（参见 图 2B）。

结果

图2展示了按照所述方案进行测量后获得的代表性结果。在绿光照射期间，PsACR1表现出一个快速的瞬时电流，随后迅速衰减至稳态电流水平。光照关闭后，光电流在数毫秒内衰减至零（图2A）。改变细胞外氯离子浓度会导致反转电位发生偏移，这一现象可直接在记录的光电流轨迹中观察到。对多次测量得到的反转电位进行分析，可量化因外部氯离子浓度变化所引起的显著反转电位偏移（图2B）。值得注意的是，实测的反转电位与氯离子的计算能斯特电位完全一致（图2C），证实了PsACR1具有高度的氯离子选择性。

讨论

在特定的离子和电学条件下测定反转电位，可提供光激活通道视紫红质（ChRs）后转运离子种类的信息。若在复杂的生理介质中仅改变一种离子种类，且测得的反转电位按理论能斯特电位发生偏移，则表明该离子种类是唯一被转运的离子。

然而，对于通道视紫红质（ChRs），由于对不同离子种类的通透性以及传导离子之间的竞争，其反转电位的偏移通常比根据能斯特方程预期的要小。在这种情况下，情况变得更加复杂，必须分别交换所有可能被传导的离子，因而需要多种测量溶液。此外，大多数CCR以及首批人工ACR^9,10,21对质子具有通透性，而质子浓度的变化需要特别细致的分析，因为质子浓度不仅可能改变反转电位，还可能通过影响氢键网络、个别残基的质子化状态以及二级结构的变化，进而影响离子电导⁹、光流动力学^21,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293细胞	Sigma Aldrich	85120602	人胚胎肾细胞
视黄醛	Sigma Aldrich	R2500	全反式视黄醛
FuGENE HD	Promega	E2312	转染试剂
DMEM	Biochrome	FG 0445	杜尔贝科改良伊格尔培养基
琼脂糖	Roth	3810	琼脂桥
CaCl2	Roth	5239	CaCl2·2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	细胞培养
葡萄糖	Roth	HN06	D(+)-葡萄糖
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2·6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-甲基-D-葡糖胺
Na-天冬氨酸	Sigma Aldrich	A6683	L-天冬氨酸钠盐一水合物
柠檬酸	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	限制性内切酶
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	限制性内切酶
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	限制性内切酶
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	化学感受态E. coli
卡那霉素	Roth	T832
LB培养基	Roth	X964
琼脂粉	Roth	6494	琼脂平板
质粒提取试剂盒	Marchery-Nagel	740727.25
青霉素/链霉素	Biochrome	A 2213	细胞培养
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P6407-5MG	盖玻片包被
微电极拉制仪	定制		火焰抛光
血清移液管	TPP		不同规格
超净工作台	Kojair	Biowizard SL130
搅拌器	IKA	RCT classic
银丝	Science Products	AG-T25; AG-T10	电极，0.64 mm（浴槽）；0.25 mm（电极）
pH计	Knick	765 Calimetric
渗透压计	Vogel	OM 815
显微镜	Carl Zeiss	ID03	火焰抛光
CO2培养箱	Binder	CB150
细胞培养皿	TPP	93040	内径34 mm
盖玻片	Roth	P232	直径15 mm
温度计	Rössel Messtechnik	MTM12
分光镜	Chroma	21011	90/10透射
移液器支架	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
前置放大器	Molecular Devices	CV203BU
放大器	Molecular Devices	AxoPatch200B
数模转换器	Molecular Devices	DigiData1400	数字模拟转换器
光源	TILL Photonics	Polychrome V	设定为540 nm全强度
显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 100
快门	Vincent Associates	VS25
快门驱动器	Vincent Associates	VCM-D1
玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	硼硅酸盐毛细管，末端火焰抛光，外径1.5 mm，内径 0.86 mm
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P1000
灌流系统	Lorenz Messgerätebau	MPCU
三通道滤光片组	Chroma	69008	荧光滤光片  ECFP/EYFP/mCherry
CCD相机	Watec	Wat-221SCCD
光度计	Gigahertz Optik	P9710	测量光强
物镜	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
显微操作器	Scientifica	PatchStar
记录室	定制
电源	Manson	HCS-3202	避免显微镜内置电源产生的电噪声
防震台	Newport	M-VW-3636-OPT-01
法拉第笼	定制或任何匹配的商用台
管路	任意商用，例如Roth		不同尺寸和材质，用于灌流系统和微电极压力施加；琼脂桥
线性摇床	Sunlab Instruments	SU 1000
液接电位计算器	Molecular Devices 或直接来自 Peter H. Barry		程序包含在Clampex采集软件中，或可从  p.barry@unsw.edu.au 获取
数据采集软件	Molecular Devices	Clampex 10.X
数据分析软件	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank 或 Addgene	KF992074.1 或 Addgene 质粒 #85465	编码PsACR1 蛋白的基因
放大器使用指南	Molecular Devices	The Axon Guide