蛋白激酶是一类高度进化的信号传导酶和支架蛋白，在细胞间和细胞内信号转导中起关键作用。本文介绍一种利用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ-32P] ATP）检测激酶活性的实验方案，该方法可靠，有助于阐明细胞信号调控机制。
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摘要
摘要
蛋白激酶能够响应复杂的刺激信号，调控大规模的细胞变化，因此大量研究致力于揭示其变构调节的详细机制。激酶构成了信号转导网络，其功能异常通常是多种癌症及相关疾病的显著特征。因此，在寻找更优治疗策略的过程中，建立一种可对上游调控因子进行操控并验证反应条件的检测平台显得至关重要。本文介绍一种基础的激酶活性检测方法，该方法易于调整以适应特定的实验需求，包括但不限于测试生化与药理学试剂的作用、基因操作（如突变与缺失）、以及细胞培养条件和处理方式，以探究细胞信号传导机制。该检测方法利用放射性标记的[γ-32P] ATP，可实现结果的定量比较与清晰可视化，并可根据需要进行修改，适用于免疫沉淀或重组激酶、特异性或代表性底物，在多种反应条件下均可使用。
引言
蛋白激酶是一类复杂的酶，在将细胞信号转导为适当生物学反应的过程中起着关键作用1。鉴于其在维持机体稳态以及疾病发生或发展中的重要作用2，用于评估激酶活性的生化方法仍是解析真核细胞信号通路细节的有力工具3。尽管利用磷酸化特异性抗体的策略在测定不同处理条件下细胞信号状态的变化方面已提供了大量信息4，但激酶活性检测技术能够直接以目标激酶的酶活性为指标，评估不同处理条件的影响。虽然目前已有多种非放射性材料的类似检测方法可供选择5，我们仍依赖本方法实现结果的可靠定量。该检测技术通常有两种典型应用，各自具有不同的价值：免疫沉淀（IP）激酶检测（图1）和重组蛋白激酶检测（图2）。
免疫沉淀激酶活性检测在鉴定能够激活特定蛋白激酶的因素以及评估抑制性处理条件方面具有重要价值。简言之，将带有表位标签的目的激酶转染至培养的真核细胞中，经不同处理后进行免疫沉淀，并检测其将放射性标记的磷酸基团掺入模式底物的能力例如 髓鞘碱性蛋白（MBP）。免疫沉淀激酶活性检测也可在不进行过表达的情况下实施，可通过免疫沉淀内源性蛋白或采用多种基因组编辑技术实现。由于处理是在细胞培养中进行的，该方法能够检测通过多个上游因子或平行通路传递的刺激信号 体外 读出结果。该方法的一个主要优势在于，无需预先了解激酶的直接上游或下游因子及其磷酸化位点。此外，一旦鉴定出目标激酶的特异性底物，便可采用相同的激酶活性检测方案，结合重组组分来测定其对天然底物的特异性活性，并通过质谱分析鉴定特异的磷酸化位点。通过该方法鉴定出的位点可进一步利用底物突变体进行激酶活性检测加以验证。最后，该方法还可用于检测和定量自磷酸化。
本方案假设已具备优化的蛋白质纯化流程或转染方法，用于在培养细胞中表达带有亲和标签的目的激酶。有关转染、裂解、免疫沉淀和蛋白质纯化方案的更详细说明，建议参考《冷泉港实验方案》6。关于检测方法的开发与优化的更多信息，请参阅《蛋白质磷酸化：酶学方法选编》7。
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方案
1. 激酶纯化资源与常规免疫沉淀流程
注意：本实验所用的激酶可通过培养细胞的免疫沉淀物获得，或通过重组方式获得，例如带亲和标签的纯化6。以下为Flag标签免疫沉淀的一般性实验方案，具体操作可能需根据目标激酶的特性进行调整。所有步骤应尽可能在冰上操作。
- 向200 µL细胞裂解液（通常总蛋白浓度约为1 mg/mL）中加入2 µL浓度为1 mg/mL的抗体，在4 °C下轻轻振荡孵育1小时。
- 用裂解缓冲液（见下文）将蛋白A Sepharose珠子洗涤2–3次：在4 °C下以5,000 × g短暂离心30秒至1分钟（"轻离心"），用移液器吸除上清液，并将珠子重新悬浮于缓冲液中。
- 配制裂解缓冲液：50 mM HEPES（pH 7.7）、150 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、10%甘油、0.2 mM正钒酸钠、100 mM氟化钠、50 mM β-甘油磷酸钠、0.1% Triton X-100 或 0.1% NP-40。
- 向裂解液中加入30 µL用裂解缓冲液配制的50%蛋白A Sepharose珠子悬液，在4 °C下轻轻振荡孵育1小时。
- 在4 °C下进行轻离心，使珠子沉淀，并吸除上清液。
- 用1 mL珠子洗涤缓冲液（1 M NaCl、20 mM Tris（pH 7.4））洗涤3次。
- 用1×激酶反应缓冲液（10 mM HEPES（pH 8.0）、10 mM MgCl2）洗涤1次。尽可能吸除缓冲液，但不要移走珠子。
2. 启动激酶反应
注意：进行免疫沉淀激酶实验时，通常以约15 µL未悬浮的磁珠作为起始样品。对于重组蛋白激酶实验，通常起始用量为0.1–1.0 µg，反应终体积为25–50 µL。在启动实验前，需用蛋白储存所用的缓冲液调整重组蛋白样品的体积，使其保持一致。当使用较大量的激酶时，应加入牛血清白蛋白（BSA）等载体蛋白，以帮助在整个实验过程中维持蛋白的稳定性。
- 配制如下5倍激酶反应缓冲液：
50 mM HEPES，pH 8.0
50 mM MgCl2
50 mM 苄脒（蛋白酶抑制剂）
50 mM DTT（还原剂）
250 µM ATP（未标记，或"冷"） - 将激酶样品置于冰上，置于1.5 mL离心管中。在另外的预冷1.5 mL离心管中配制如下反应混合液：
21 µL H2O
6 µL 5倍激酶反应缓冲液
1 µL 放射性标记ATP（"热"）
2 µL 底物（约5 mg/mL）
注意：对于重组激酶检测，可根据纯化蛋白量调整体积，使最终反应体积为30 µL。可按此配方配制总反应混合液（master mix）。收到标记ATP后，在加入反应体系前，用H2O将其稀释至比活性为0.01 mCi/µL。 - 开始检测时，将全部反应混合液加入激酶样品中，根据待测激酶的活性，在30 °C下孵育5分钟至1小时。
注意：当检测此前未测定过活性的激酶时，应进行激酶活性的时间进程实验，各时间点之间间隔5分钟。
3. 反应终止与SDS-PAGE
- 将反应管置于冰上，并加入 7.5 µL 5x Laemmli 样品缓冲液以终止反应6。
- 在加热块中于 100 °C 加热 30 秒至 2 分钟。
- 短暂离心后，每孔上样 20 µL，加载至 10–15% SDS-PAGE 胶中。电泳运行时间应足够长，以实现激酶与底物的分离（通常在恒定功率 5 W 下运行约 1 小时）。务必对凝胶装置进行屏蔽，以尽量减少接触 32P。
- 此处使用自制凝胶装置，但标准商用小型凝胶系统同样适用。具体尺寸如下：
凝胶：宽 8 cm，分离胶长度 5.5 cm，厚度 1.5 mm。
梳子：15 孔，厚度 1.5 mm，宽度 2.9 mm，深度 16 mm
- 此处使用自制凝胶装置，但标准商用小型凝胶系统同样适用。具体尺寸如下：
4. 凝胶染色与干燥
注意：所有步骤中，必须使用放射性屏蔽装置并穿戴个人防护装备，以减少对32P的个人暴露。有关具体步骤的更多信息，文中已包含一些有益的参考文献。
- 将凝胶从玻璃/氧化铝板上取下，放入50 mL考马斯亮蓝染色液（10%冰醋酸，50%甲醇，0.25% R-250染料）中，在50 rpm的摇床中染色1小时。此步骤应使用略大于凝胶本身的容器。8
- 将凝胶从染色液转移至固定液（10%冰醋酸，20%甲醇）中进行脱色。在600–700 mL固定液中，于50 rpm摇床上振荡过夜。在容器中放入泡沫块或打结的实验室擦拭纸，以吸收考马斯亮蓝染料。8,9
- 将凝胶从固定液中取出，用200 mL甲醇浸泡1–2分钟，并轻轻振荡，直至凝胶变为乳白色。此步骤有助于防止干燥过程中凝胶开裂。
- 用甲醇润湿一张14 cm × 14 cm的定性滤纸，将其铺在凝胶真空干燥板上。将凝胶正面朝上放置于滤纸上。
- 小心用保鲜膜覆盖凝胶，避免产生皱褶和气泡。在80 °C下运行干燥仪1.5小时。达到真空后，打开盖子，如有需要，用软橡胶滚筒滚压排除气泡。
5. 自显影图像与闪烁计数
- 取下干燥的凝胶，并在凝胶一侧的滤纸上贴上自显影标记物、磷光尺或点状标记。若使用点状标记，需确保其呈不对称排列，以便曝光和显影后将凝胶与胶片对齐。
- 使用盖革计数器检测信号强度。对于较弱的信号，可在-70 °C至-80 °C条件下使用增感屏进行曝光，以提高胶片上条带的密度。
- 在暗室中，将干燥的凝胶放入胶片暗盒内，按从上到下的顺序依次放置：凝胶、胶片、增感屏。
- 可将增感屏固定在暗盒盖内侧，并用胶带将凝胶固定到位，以便于操作。增感屏在受到32P释放的β粒子辐照时会发光，这些光信号比β粒子更有效地穿透胶片。
- 确保增感屏发射的波长与胶片最敏感的波长范围相匹配。
- 使用盖革计数器确定曝光时间：若每分钟计数（cpm）约为100或更低，可尝试在-70 °C下过夜曝光；若计数约为10,000，则可先进行1小时曝光，并据此优化后续条件。
- 曝光结束后，取出胶片并在医用/X光胶片处理器中显影。若曝光是在-70 °C至-80 °C条件下进行的，应让暗盒恢复至室温以减少胶片上的冷凝水，或在冷凝形成前迅速取出胶片10。
- 将胶片覆盖在干燥的凝胶/滤纸上，使标记物或点状标记的影像与凝胶上的标记对齐。在胶片上标出对应于蛋白质标准品的条带位置，并标注蛋白质标准品及各泳道反应信息，以供后续参考。
- 从凝胶中切下与胶片上目标条带相对应的部分，放入7 mL闪烁瓶中。加入4 mL闪烁液，使用液体闪烁计数器进行计数。请确认计数器已设置为监测32P的正确能量谱窗。
注意：务必同时切下无激酶对照泳道中对应于底物的条带，用于计算背景辐射值，该值将从所有样品的闪烁计数中扣除。
6. 结果分析
注意：放射自显影提供结果的定性可视化。为了准确定量，可用液体闪烁计数器测量32P的掺入量。数据通常以相对活性表示，如图1B所示。只要所有样品保持一致的实验条件，特异性活性的相对测量值足以用于比较不同处理组。
- 在计算绝对比活性值时，应对所有反应条件（包括激酶、底物和冷ATP浓度）进行严格的优化，以确保在时间过程中活性处于线性范围内。例如 2 × [激酶] = 2 × 特异性活性。对于特异性活性较高的激酶，若激酶活性受底物量限制，应使用更高的底物浓度进行检测。
- 以每分钟每毫克激酶转移的磷酸基团的纳摩尔数（nmol/min/mg）为单位，计算目标激酶的比活性。
- 从计数条带的cpm值中减去空白值。
- 计算热ATP的衰变：[(1/2)^(t/t1/2)] × 0.95，其中 t 是自参考日期以来的天数（应由供应商提供）， t1/2 半衰期是 32P 为 14.3 天，0.95 反映了闪烁计数器的效率。示例：若使用存放了 28 天的热 ATP，衰变值应为 0.245。
- 计算检测中总ATP的皮摩尔数（pmol）（通常等于反应中冷ATP的量）：检测体积（µL）× [冷ATP]浓度（µM）= 总ATP（pmol）。示例：30 µL × 50 µM = 1500 pmol
- 计算 ATP 的 cpm/pmol：[热 ATP 的 µL 数 × (2.2 × 107) × 衰减因子] / pmol 冷ATP。
注意：2.2 x 10 的值7 将0.01 mCi/µL的ATP转换为cpm。 - 计算测定中激酶的含量（单位：mg）。对于重组激酶和免疫沉淀的激酶，可采用BCA法等标准方法测定初始浓度。示例：在50 µL激酶反应体系中，wtERK2浓度为0.0002 µg/µL，总量为0.01 µg，即1 × 10⁻⁸ mg。-5 mg
- 计算检测中的总cpm。配制30 µL反应体系，并将每个反应中的20 µL上样至凝胶电泳。将计数得到的cpm值（扣除空白后）乘以总反应体积与上样体积之比的校正因子。以上述示例为例，即将所有计数值乘以1.5（即30/20）。
- 计算被检测激酶的比活性：
（检测中的总cpm）/（每pmol ATP的cpm值）/（反应时间，单位为分钟）/（激酶用量，单位为mg）
注意：将上述数值除以 1,000 可得到以纳摩尔/分钟/毫克为单位的比活性
- 根据底物的分子量（已知）计算其掺入的磷酸基团的摩尔数。该方法用于在反应完全进行后，确定特定蛋白质上的磷酸化位点数量。
[检测中的总cpm / (ATP的cpm/pmol)] / (底物的pmol量)
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结果
WNK1 免疫沉淀激酶活性检测
将 Myc 标签标记的 WNK1 转染至 HEK293 细胞中，并使用抗 Myc 抗体进行免疫沉淀11。免疫沉淀物对模型底物 MBP 以及其自身均表现出激酶活性（图 1A）。随后采用相同方法检测 WNK1 突变体对 MBP 的激酶活性，此次使用 GST 标签标记的构建体（图 1B）。通过分析突变体激酶行为与野生型的差异，鉴定出对 WNK1 最佳活性至关重要的残基。
将HEK293细胞暴露于一系列药理学和生物化学处理条件下。使用针对WNK1 N端肽段产生的抗体，对免疫沉淀的内源性WNK1激酶活性进行检测，以MBP作为底物。表皮生长因子（EGF，已知的ERK1/2信号通路激活剂）、诺考达唑（noc...
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讨论
激酶是一类功能多样的蛋白质，在多种生物学环境中发挥着重要作用。激酶活性检测方法在研究多种信号转导蛋白方面极为有用，极大地促进了我们对细胞间通讯机制的理解。值得注意的是，尽管两种激酶在结构和活性上存在显著差异，但均采用了相同的基本检测方法对其进行表征。WNK1激酶具有一个非典型的催化口袋，其关键的赖氨酸残基位于一个独特的位置，已知其通过激酶活性和支架功能在调控阳离子-氯离子共转运蛋白中发挥作用。WNK1激酶的催化转换数较低，即使在其最明确的底物——氧化应激反应蛋白激酶1（OSR1）和SPS/STE20相关富含脯氨酸与丙氨酸的激酶（SPAK）上也是如此。相比之下，ERK2与其高度同源的激酶ERK1在激活后表现出强烈的激酶活性。 体外 已知可在细胞内磷酸化超过一百种底物13,14.
实验中最关键的环节是反应体系的组装。为了准确测量各个时间点，必须特别注意激酶反应的起始。激酶反应的进行需要满足四个基本条件：激酶、底物、ATP 和金属离子。在本方案中（主要用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Cobb实验室所有现任和前任成员所做的宝贵工作和讨论，以及Dionne Ware提供的行政协助。本研究得到了美国国立卫生研究院资助R37 DK34128和Welch基金会资助I1243（授予M.H.C.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| 放射性标记[γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli缓冲液 | 伯乐（Bio-Rad） | #1610737 | |
| 放射性屏蔽 | 研究产品国际公司 | BR-006 | |
| R-250染料（考马斯亮蓝） | 赛默飞世尔科技 | 20278 | |
| Whatman Grade 3 定性滤纸 | Whatman | 1003-917 | |
| 平板凝胶真空干燥器 | 伯乐（Bio-Rad） | Model 583 凝胶干燥仪 #1651745 | |
| 自显影标记物 | 安捷伦科技 | 420201 | |
| 磷光标尺 | Sigma Aldrich | R8133 | |
| 磷光点 | Sigma Aldrich | L5149 | |
| 盖革计数器 | Ludlum | 配备44-9型探测器的3号模型 | |
| BioMax 暗盒 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS 胶片 8" ×10" | 锐珂医疗 | 829 4985 | |
| BioMax MS 增强屏 8" × 10" | 锐珂医疗 | 851 8706 | |
| 医用X光胶片冲洗机 | 柯尼卡美能达 | SRX-101A | |
| 闪烁瓶 | 研究产品国际公司 | 125500 | |
| 闪烁液 | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 液体闪烁计数器 | 贝克曼 | LS 6500 |
参考文献
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