本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼最初被引入作为发育生物学模型，现已在许多其他领域得到广泛应用。大量饲养这种快速发育生物的便利性，以及胚胎期良好的光学通透性，是该模型最初受到青睐的主要优势。在过去的二十年中，由于其适用于大规模诱变筛选且易于进行转基因操作，该模型的应用进一步取得成功。近年来，基因编辑技术的出现进一步拓展了这一模型的应用潜力。
在神经发育研究中，斑马鱼胚胎和幼鱼是一种可应用多种方法的模型。本文重点介绍可用于研究神经元基本特性——电兴奋性的方法。我们用于斑马鱼脊髓神经元电生理研究的制备方法，涉及使用兽用缝合胶将样本固定在记录室中。其他记录斑马鱼胚胎和幼鱼电活动的方法则通常采用细钨针将样本固定于记录室1,2,3,4,5。钨针通常用于将样本以侧向位置固定，尽管也有将其用于背侧朝上固定幼鱼的报道4。而缝合胶则可用于两种方向的胚胎和幼鱼固定。使用胶固定的优点在于可进行最小限度的解剖，从而在无需酶处理的情况下暴露脊髓神经元，避免由此引起的组织损伤。然而，对于幼鱼而言，仍需进行短暂的酶处理以去除脊髓周围包裹的肌肉组织。本文所述方法已被用于研究多个发育阶段的运动神经元、中间神经元和感觉神经元的固有电生理特性6,7,8,9。
引言
George Streisinger 首次将 Danio rerio（通常称为斑马鱼）用作脊椎动物发育遗传学研究的模式系统10。该模型具有多项优势，包括：（1）动物饲养相对简单且成本低廉；（2）体外受精，便于从最早发育阶段起获取胚胎；（3）胚胎透明，可直接且反复观察细胞、组织和器官的形成过程。
在随后的几十年中，多项进展进一步增强了斑马鱼模型的研究能力。特别是正向遗传筛选和全基因组测序工作，在鉴定对多种发育过程至关重要的突变和基因方面发挥了关键作用11,12,13,14,15,16。Gateway克隆技术使得转基因方法得以常规应用17,18。近年来基因组编辑技术的进步，以转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶为代表，实现了对突变的靶向引入，以及....
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方案
所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会（IACUC；科罗拉多大学安舒茨医学校区实验动物资源办公室）批准。
1. 斑马鱼养殖
- 在28.5 °C条件下，以10小时黑暗/14小时光照的循环周期饲养并维持成年斑马鱼（Danio rerio），并进行适当的水处理和换水52。
- 将斑马鱼胚胎/幼鱼在胚胎培养基中于28.5 °C条件下培养，直至达到所需发育阶段（例如，2 dpf）。
2. 解剖材料的准备
- 斑马鱼解剖用胶水分配器
注意：本方案涉及使用兽用缝合胶将制备样品固定于记录室中。成功使用缝合胶的关键在于以受控方式施加少量胶水。胶水一旦接触水性环境即开始硬化。因此，需先用微量移液器吸取胶水，再通过自制的“胶水分配器”以口控负压或正压方式递送少量胶水。胶水分配器的核心部件为玻璃内管，该部件包含在硼硅酸盐薄壁玻璃毛细管的包装中（图1A）。内管一端通过一段柔性管连接至吹嘴，另一端则安装玻璃微量移液器（图1）。- 取一个玻璃内管，移除其黑色胶头，并用另一个玻璃内管上的白色橡胶接头替换（图1B 和
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结果
我们已成功从17小时受精龄胚胎至7天龄幼鱼的Rohon-Beard神经元记录到信号（图 5A 和 5B）。当记录罗恩-贝尔德细胞时，将标本背侧朝上固定。这种固定方式可根据这些细胞表浅的背侧位置和较大的胞体尺寸对其进行明确识别。此外，通过这些神经元典型的超极化静息膜电位可进一步确认其身份图5, 插图表格)6,54此外，由于罗恩-贝尔德神经元是初级感觉神经元，缺乏突触输入。因此，在无电刺激的情况下，采用电流钳模式记录时，膜电位不应发生任何变化图 5B'）。自从首次在斑马鱼中对Rohon-Beard细胞进行记录以来6，多种转基因品系（例如，Tg(islet2b:gfp)、Tg(ngn:gfp)，以及 Tg(isletss:gfp)
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讨论
本文所述方法可在对斑马鱼胚胎脊髓进行最小程度解剖后，实现对其感觉神经元和运动神经元的电生理及形态学表征。神经元在至少1小时内保持健康状态，该时间为本记录实验的时间限制。实验中采用标准的全细胞记录模式以及核膜片记录模式对神经元进行记录；后一种方法可最大程度减少空间钳制问题，从而避免离子电流生物物理特性详细研究的受限9。
一个重要的挑战是实现胚胎或幼体在记录室中的牢固附着，以便去除皮肤并进行有限的解剖，从而暴露目标神经元。此外，样本还需在整个全细胞膜片钳记录过程中稳定固定于记录室中。本文介绍了一种利用兽用缝合胶将胚胎或幼体粘附于解剖/记录室的方法，该方法此前已被用于其他模式生物（例如，果蝇）的解剖63。根据我们培训他人的经验，最关键的步骤是精确控制微量胶水的施加。本文还讨论了一种胶水分配装置，该装置可通过施加负压或正压，将胶水吸入或推出微移液管尖端。使用缝合胶可将胚胎和幼体牢固地固定在记录室中，并可根据需要以背侧朝上或侧向的方式进行定位，从而为多种神经元提供不同的操作通路。.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（RLM 获 F32 NS059120，ABR 获 R01NS25217 和 P30NS048154）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真空滤器/储存瓶，0.22 mm 孔径 | Corning | 431096 | |
| 注射器滤器，0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 |
| α-bungarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| 河豚毒素 | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 肼盐 | Molecular Probes | A-10438 | 荧光染料 |
| Spin-X 离心管滤器 | Corning | 8161 | |
| 玻璃显微镜载玻片 | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 184 | 硅橡胶弹性体 |
| 培养皿 | Falcon | 351029 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | 30-0038 | 内径和外径分别为 0.78 和 1.0 mm（薄壁玻璃毛细管） |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | 内径和外径分别为 1.13 和 1.55 mm（厚壁玻璃毛细管） |
| 微型带倒钩聚丙烯接头 | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB | |
| 胶原酶 XI | Sigma | C7657 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| 放大器 | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| 前置放大器 | Molecular Devices | CV203BU | |
| 电动显微操作器 | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon 软管 | Fisher | 14-169-1B | 内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸，壁厚 1/32 英寸（柔性实验室软管） |
| 电极夹持器 | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal 三通旋塞阀 | Baxter | K75 | |
| 数据采集卡 | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| 倒置显微镜 | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan 物镜 | Zeiss | ||
| 数据采集与分析软件 | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex 和 Clampfit | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 解剖与记录溶液（单位：mM） | |||
| 除细胞内溶液外，所有溶液经滤膜（0.22 mm 滤杯）过滤后，室温（RT）保存可稳定约 2–3 个月。 | |||
| 细胞内溶液经（0.2 mm 注射器滤器）过滤后，分装成小份，于 -20 °C 冻存，使用当天单独解冻。 | |||
| 解剖/Ringer’s 溶液 | 145 NaCl，3 KCl，1.8 CaCl2·2H2O，10 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节） | ||
| 移液管（细胞内）记录溶液 | 135 KCl，10 EGTA-酸，10 HEPES；pH 7.4（用 KOH 调节）。 | ||
| 浴液（细胞外）记录溶液/电压钳与电流钳 | 125 NaCl，2 KCl，10 CaCl2·2H2O，5 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节）。 | ||
| Alexa-594 肼盐储备液。 | 用 ddH2O 配制 13.2 mM 储备液，分装（约 100 µl），-20 °C 保存。使用时，用移液管溶液将储备液稀释 132 倍，终浓度为 100 mM。稀释后，用离心管滤器过滤含 Alexa-594 的移液管溶液 。 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 固定剂 | |||
| 0.4% 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine） | 用 0.2 M Tris（pH 9）配制 0.4% 储备液（0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris） | ||
| 用 NaOH 调节 pH 至 7，-20 °C 保存。 | |||
| 使用时，用胚胎培养基将储备液稀释约 25 倍。 | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | 用 ddH2O 配制 250 mM 储备液（1 mg/500 mL），分装成 100 µL 份，-20 °C 保存。 | ||
| 使用时，用细胞外溶液稀释 2,500 倍，终浓度为 100 nM。 | |||
| 1 mM 河豚毒素 | 用 ddH2O 配制 1 mM 储备液（1 mg/3 mL），分装成 100 µL 份，-20 °C 保存。 | ||
| 使用时，用细胞外溶液稀释 2,000 倍，终浓度为 500 nM。 |
参考文献
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol.
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