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方法文章

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

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DOI：

10.3791/55507

⸱

2017年4月18日

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

本文内容

摘要

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。

摘要

斑马鱼最初被引入作为发育生物学模型，现已在许多其他领域得到广泛应用。大量饲养这种快速发育生物的便利性，以及胚胎期良好的光学通透性，是该模型最初受到青睐的主要优势。在过去的二十年中，由于其适用于大规模诱变筛选且易于进行转基因操作，该模型的应用进一步取得成功。近年来，基因编辑技术的出现进一步拓展了这一模型的应用潜力。

在神经发育研究中，斑马鱼胚胎和幼鱼是一种可应用多种方法的模型。本文重点介绍可用于研究神经元基本特性——电兴奋性的方法。我们用于斑马鱼脊髓神经元电生理研究的制备方法，涉及使用兽用缝合胶将样本固定在记录室中。其他记录斑马鱼胚胎和幼鱼电活动的方法则通常采用细钨针将样本固定于记录室1,2,3,4,5。钨针通常用于将样本以侧向位置固定，尽管也有将其用于背侧朝上固定幼鱼的报道4。而缝合胶则可用于两种方向的胚胎和幼鱼固定。使用胶固定的优点在于可进行最小限度的解剖，从而在无需酶处理的情况下暴露脊髓神经元，避免由此引起的组织损伤。然而，对于幼鱼而言，仍需进行短暂的酶处理以去除脊髓周围包裹的肌肉组织。本文所述方法已被用于研究多个发育阶段的运动神经元、中间神经元和感觉神经元的固有电生理特性6,7,8,9。

引言

George Streisinger 首次将 Danio rerio（通常称为斑马鱼）用作脊椎动物发育遗传学研究的模式系统10。该模型具有多项优势，包括：（1）动物饲养相对简单且成本低廉；（2）体外受精，便于从最早发育阶段起获取胚胎；（3）胚胎透明，可直接且反复观察细胞、组织和器官的形成过程。

在随后的几十年中，多项进展进一步增强了斑马鱼模型的研究能力。特别是正向遗传筛选和全基因组测序工作，在鉴定对多种发育过程至关重要的突变和基因方面发挥了关键作用11,12,13,14,15,16。Gateway克隆技术使得转基因方法得以常规应用17,18。近年来基因组编辑技术的进步，以转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶为代表，实现了对突变的靶向引入，以及基因敲除和基因敲入等策略19,20,21,22。这些方法的结合使斑马鱼成为研究特定行为及多种人类疾病遗传机制的有力模型23,24,25,26,27。

本研究聚焦于发育调控以及电活动在神经元发育中的作用，重点研究脊髓。斑马鱼模型为脊髓研究提供了多项优势。首先，斑马鱼在胚胎期和幼体期较易获取，因此可以在神经元数量较少、神经环路较简单的发育阶段研究脊髓功能28,29。此外，斑马鱼脊髓包含多种类型的神经元，与其他脊椎动物相似，这一点已通过一系列具有特征性和区分性的转录因子表达模式得到证实30,31,32,33,34,35。

在斑马鱼中，旨在揭示脊髓神经环路功能机制（尤其是与运动功能相关的环路）的大多数研究，理所当然地集中于幼体阶段36,37,38,39,40,41,42,43。然而，构成脊髓运动神经网络的许多神经元早在胚胎发育早期（受精后约9–10小时，hpf）即开始分化44,45,46,47,48,49,50,51。鉴于此，了解脊髓神经元的形态学和电生理特性在胚胎期至幼体期之间如何产生和变化，对于全面理解运动环路的形成与功能具有重要意义。

此处描述的解剖方法可用于对脊髓神经元进行膜片钳记录，并已成功应用于胚胎期（约17–48小时受精后，hpf）和幼体期（约3–7天受精后，dpf）。该方法通过最小化解剖操作，仅暴露目标神经元即可实现记录。本方案与大多数已发表的斑马鱼脊髓神经元记录方法不同之处在于，使用兽用缝合胶而非细钨针将胚胎或幼体固定于记录槽中。两种不同方法的可选性（即， 缝合胶与钨针在斑马鱼胚胎或幼鱼固定用于电生理分析方面提供了不同的选择，使研究人员能够根据特定实验目标选用合适的方法。

首先，描述了获取并记录初级感觉神经元——罗氏-比尔德细胞（Rohon-Beard cells）群体活动的操作步骤。这些神经元的胞体位于脊髓背侧。罗氏-比尔德细胞存在于多种脊椎动物中，于发育早期即发生分化，并介导胚胎期的触觉反应6,44,47,48。

其次，详细描述了获取和记录脊髓运动神经元的实验方法。斑马鱼脊髓运动神经元在两波神经发生过程中产生。较早产生的初级运动神经元出现在原肠胚形成末期（约9–16 hpf），每个半节段仅存在3–4个初级运动神经元45,46,49。相比之下，较晚产生的次级运动神经元数量更多，其发生过程持续较长时间，始于约14 hpf45,50。在躯干中段节段，次级运动神经元的生成大多在51 hpf时完成50。次级运动神经元被认为是羊膜动物运动神经元的对应物46。有趣的是，上脊髓神经元通过多巴胺调节幼虫的运动行为，以及胚胎和幼龄幼虫时期次级运动神经元的生成过程50,51。初级和次级运动神经元各自包含多种不同的亚型。每种初级运动神经元亚型均发出一条周围轴突，支配特定的肌群，从而形成典型且可识别的轴突投射路径。通常情况下，次级运动神经元沿初级运动神经元先前建立的轴突通路延伸。因此，在轴突投射路径方面，初级与次级运动神经元相似，唯一的区别在于初级运动神经元的轴突更粗、胞体更大45。

第三，讨论了记录几种类型中间神经元的方法。然而，在这些情况下，需要有限地去除其他脊髓细胞，因此相较于记录Rohon-Beard细胞或运动神经元，脊髓的完整性较低。

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方案

所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会（IACUC；科罗拉多大学安舒茨医学校区实验动物资源办公室）批准。

1. 斑马鱼养殖

  1. 在28.5 °C条件下，以10小时黑暗/14小时光照的循环周期饲养并维持成年斑马鱼（Danio rerio），并进行适当的水处理和换水52。
  2. 将斑马鱼胚胎/幼鱼在胚胎培养基中于28.5 °C条件下培养，直至达到所需发育阶段（例如，2 dpf）。

2. 解剖材料的准备

  1. 斑马鱼解剖用胶水分配器
    注意：本方案涉及使用兽用缝合胶将制备样品固定于记录室中。成功使用缝合胶的关键在于以受控方式施加少量胶水。胶水一旦接触水性环境即开始硬化。因此，需先用微量移液器吸取胶水，再通过自制的“胶水分配器”以口控负压或正压方式递送少量胶水。胶水分配器的核心部件为玻璃内管，该部件包含在硼硅酸盐薄壁玻璃毛细管的包装中（图1A）。内管一端通过一段柔性管连接至吹嘴，另一端则安装玻璃微量移液器（图1）。
    1. 取一个玻璃内管，移除其黑色胶头，并用另一个玻璃内管上的白色橡胶接头替换（图1B 和 图1C）。
      注意：这种两端均带接头的玻璃内管可在一端连接玻璃微量移液器，另一端则通过小型直型聚丙烯接头连接柔性管（图1B，插图）。
    2. 截取一段长约38 cm的柔性管。将吹嘴（例如，一个黄色的200 µL移液器吸头）连接至柔性管未连接玻璃内管的一端。
      注意：柔性管的长度应足以在操作者口中含着移液器黄色吸头的同时，仍可在解剖显微镜下自如操控玻璃微量移液器（图1D）。

带标尺的采血管组件示意图，用于显示装置结构和各部件。
图1：胶水分配器。（A-C）玻璃内孔一端连接柔性管路，另一端连接玻璃微移液管。橡胶接头可通过小型聚丙烯接头（B，插图）与管路连接，并最终在另一端连接玻璃微移液管。（D）最终的胶水分配器在管路一端配有吹嘴（例如，由塑料移液枪头制成），另一端为带连接微移液管的玻璃内孔（箭头）。

  1. 解剖/记录室
    注意：解剖室同时也用作电生理记录室。该室通过在载玻片上使用预先切割好的固化硅橡胶弹性体片构成图 2A).
    1. 准备硅胶弹性体时，将基础剂和固化剂按4:1的比例加入塑料锥形管中。
    2. 将弹性体基质与固化剂充分混合，然后将混合物倒入两个100 mm的培养皿中。倒入弹性体的厚度为 <一个培养皿中为1 mm，另一个中约为2.5 mm。
    3. 让硅酮弹性体在空气中固化约4-5天。若需更快获得固化后的弹性体，可将其置于 60 °C.
    4. 将固化后的硅胶弹性体裁剪成以下尺寸：
      1. 从约1 mm厚的固化弹性体上裁剪出一块约3.8 × 6.3 cm的矩形；该片材用作腔室的底部图2A）。从约 2.5 mm 厚的固化硅胶上裁剪出一个约 3.8 × 6.3 cm 的矩形。从该矩形中再切割出一个内部矩形，尺寸约为 2.5 × 5 cm；所得框架用作腔室的顶部图2A).
    5. 制作分离/记录室时，将薄硅胶矩形片直接放置在载玻片（5 × 7.6 cm）上，确保硅胶与玻璃之间无任何气泡图 2A将从较厚的弹性体上裁剪出的硅胶矩形框架放置在薄的底层硅胶之上。
    6. 验证硅胶层之间是否粘附良好，且两层之间无气泡图2A).
    7. 使用后，通过从附着在载玻片上的底层硅胶上取下厚的矩形硅胶框来拆卸小室。用ddH₂O冲洗硅胶表面2使用前及每次记录后将O用低绒擦拭布擦干。
    8. 将腔室干燥保存，以防止硅胶片之间滋生真菌。
      注意：若使用可能难以从硅胶中冲洗干净的毒素或药理学试剂，应专门指定用于此类用途的腔室。

用于细胞分析的显微注射装置；包含显微镜、注射器和毛细管。
图 2：电生理记录室及解剖工具。 （A）用于解剖和电生理记录的记录室由一块载玻片构成，其上叠加放置两片固化的硅橡胶，形成一个井状结构的框架和底部。该井的尺寸约为 2.5 × 5 cm，可使用少量细胞外记录液（2–2.5 mL）。底部的硅橡胶层可利用不粘附玻璃的组织胶水牢固固定斑马鱼胚胎。（B）玻璃微量移液管 （上） 用于在解剖过程中输送胶水。该薄壁玻璃管经拉制形成细长的锥形末端，随后将其截断，制成直径约为 75 µm 的尖端。锥形玻璃移液管连接至胶水分配器的自由端（图 1D，箭头），并通过施加负压从前端填充胶水。另一根移液管（下），其拉制方式与用于膜片钳记录的移液管相同，用于切断后脑并去除皮肤。（C）在直立显微镜下，使用显微操作器操控移液管完成最终的解剖步骤。一根如 B 中 底部 所示的玻璃移液管连接至电极夹持器（箭头）。通过连接至气出口（箭头）的管路施加负压来实现肌肉组织的移除。该管路的另一端连接一个三通阀（黑色箭头），其另一侧（星号）连接有通向吹嘴的管路。

3. 胚胎和幼虫解剖以进行脊髓神经元的膜片钳记录

神经研究中显微注射毛细管使用的显微镜示意图；细胞靶向，斑马鱼视神经。
图3：斑马鱼脊髓的背侧解剖 (A-A') 小脑延髓池横断后（a2天大的胚胎中，在胚胎左右两侧的皮肤上进行切割（b）。然后进行第二次切割，与第一次切割垂直（c接着，使用微量移液器提起皮肤，以便用镊子夹住并撕除皮肤。B) 去除皮肤后暴露出背部脊髓。在黑线的头侧，皮肤已被清除，脊髓表面（星号），位于脑膜内，已暴露。黑线尾侧的皮肤保持完整（箭头). (C-C') 将玻璃微电极尖端压在脑膜上，进行快速、横向的短促移动以刺穿脑膜。 (D-D' 和 E-E') 一旦刺破脑膜（D-D'），将微量移液器推进并（E-E'向头侧移动以将脑膜撕裂成两段。去除脑膜后，罗恩-贝尔德神经元的胞体通常会显露出来。箭头). (F-G'在7天龄幼鱼中，肌肉层覆盖于脊髓背侧，阻碍了对Rohon-Beard神经元的接触。去除皮肤后，将幼鱼用0.05%胶原酶处理。F) 用 0.05% 胶原酶孵育 5 分钟过于剧烈，会导致肌肉组织过度损伤，表现为肌肉纤维松散 fray箭头 和 插图). (F'过度的胶原酶处理也可能损伤 Rohon-Beard 神经元箭头），在此通过其表达的gfp揭示 Tg(islet2b:gfp) 线。 在Tg(islet2b:gfp) 细胞系，背根神经节神经元也表达 GFP（箭头）。用0.05%胶原酶孵育1分钟即可充分松解肌肉（G) 同时保持体节肌的形态（箭头 和 插图). (G'色素细胞位于最背侧肌层的上方（箭头). (H 和 I) 在 Tg(islet2b:gfp) 线，Rohon-Beard神经元（箭头) 和背根神经节（箭头）在7 dpf时仍持续表达gfp。背侧视图 Tg(islet2b:gfp) 2 日龄斑马鱼胚胎（2 dpf）H）以及7 dpf（I）。图A中的比例尺 = 500 µm；B-E（见图B）标尺 = 80 µm；F' 和 G'（见图 F）比例尺 = 200 µm；H 和 I（见图 H）标尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 用于记录Rohon-Beard细胞的胚胎解剖
    1. 将一个胚胎置于含有约2–3 mL任氏液的解剖室中（图2A）。向解剖室中加入约100 µL的0.4%三卡因溶液，以固定胚胎。
    2. 使用盒状灯丝在拉针仪上拉制薄壁玻璃微电极，获得类似注射微电极的细长尖端（图2B，顶部）53。
    3. 将拉制好的玻璃微电极连接至胶水分配器的玻璃接口。在解剖显微镜下，使用镊子轻折玻璃微电极尖端，使其直径约为75 µm（图2B，顶部）。
      注意：尖端尺寸应足够大，以便通过施加负压（口吸）高效地将胶水从前端装入微电极；但又需足够小，以便通过正压精确施加胶水。
    4. 通过吹嘴施加负压，将约3–5 µL胶水吸入玻璃微电极中。将装有胶水的微电极尖端移至解剖室。
      注意：填充胶水需要较强的吸力。若微弱吸力即可快速充满微电极，则说明尖端过大。
    5. 将胚胎放入记录室（图3A 和 3A'）；对于胚胎及幼龄幼虫（≤72 hpf）的记录，无需去除肌肉组织。
    6. 在保持微电极内轻微正压（通过吹管施加，以防止水溶液进入）的同时，将装有胶水的微电极尖端移近胚胎/幼虫头部。当尖端接近胚胎头部时，施加足够的正压，在记录室底部挤出一小滴胶水。
      注意：胶水一旦接触水溶液即迅速固化，因此在将其置于解剖液中时，必须施加并维持轻微正压。
    7. 使用解剖针工具将胚胎/幼虫向胶水滴移动，使其头部接触胶水。将胚胎背侧朝上放置，并轻压头部，确保其与胶水充分接触。
    8. 当胶水缓慢固化时，使用解剖针调整胚胎/幼虫位置，使其腹侧向下、背侧向上。将解剖针浸入胶水滴中，并在胚胎头部上方及横跨其表面拉出胶水细丝，以进一步固定其位置。
      注意：三卡因会加快胶水的固化速度。为延长操作时间，应使用能固定胚胎/幼虫所需的最小剂量三卡因。此外，不同批次胶水的固化速度可能不同。因此，在使用新批次胶水前，应先测试其固化速率再用于解剖。
    9. 当头部牢固粘附于硅胶且胶水完全固化后，使用另一根玻璃微电极在后脑水平横切胚胎/幼虫以实施安乐死（图3A-a 和 4A-a）。
      注意：后脑横切是本实验中用于人道处死动物的方法。然而，根据实验目的（例如，研究拟态游泳），可能需要采用其他方法。
    10. 在将尾部固定于记录室之前，需去除躯干皮肤。
      1. 使用一根新的玻璃微电极（图2B，底部），在后脑后方位置多次浅表切割皮肤（图3A-b 和 4A-b）。对于背侧固定的标本（图3A-b），沿躯干两侧垂直于头尾轴方向浅刺皮肤；对于侧向固定的标本（图4A-b），则在暴露的一侧进行穿刺。
    11. 为便于镊子夹持皮肤，使用微电极在步骤3.1.10.1的初始切口处及其水平方向多次刮擦皮肤（图3A-c 和 4A-c）。
    12. 使用镊子逐渐提起皮肤瓣，并向尾部方向拉扯皮肤。
      注意：此操作通常可完全去除躯干皮肤。但有时需通过反复刮擦和拉扯，分段去除皮肤。对于某些实验，部分去除皮肤即可充分暴露目标脊髓节段（图3B 和 4B）。
    13. 在胚胎/幼虫尾部附近施加一小滴胶水，利用该胶水将尾部固定在解剖室底部。在此过程中，随着胶水固化，使用解剖针工具调整躯干位置，确保其背侧朝上并牢固粘附于记录室。
    14. 完成初步解剖后，用任氏液充分冲洗标本，以去除三卡因和碎片。让标本静置约5分钟。
    15. 用细胞外记录液替换解剖液。如有需要，可在标本中添加固定剂（例如，α-银环蛇毒素[终浓度1 µM]）。
      注意：1 µM α-银环蛇毒素可在约30分钟内使1至2 dpf胚胎完全固定。对于更年长的幼虫，可能需要更高浓度的α-银环蛇毒素。在记录期间，α-银环蛇毒素需持续保留在灌流液中，记录通常在1小时内完成。含有二价阳离子（如钴离子）的记录液无需添加固定剂。对于需要长时间记录（超过1小时）的实验，应以0.5–1 mL/min的流速持续灌注浴液。
    16. 将固定好胚胎的解剖室移至直立复合显微镜的载物台上，配备40倍长工作距离水浸物镜。
      注意：该显微镜为记录装置的一部分。整套装置还应包括前置放大器、膜片钳放大器、微操纵器以及数据采集/计算机系统（图2C）。
    17. 将一根空的硼硅酸盐厚壁玻璃微电极安装至前置放大器的电极夹持器上（图2B，底部 和 2C，箭头）。将一段管路（内径：0.16 cm，外径：0.32 cm，长度：约90 cm）一端连接至电极夹持器的气出口（箭头），另一端连接至三通旋塞阀（图2C，黑色箭头）。
      1. 将另一段长约60–70 cm的管路一端接上吹嘴，另一端连接至三通旋塞阀（图2C，黑色星号）。
        注意：该管路系统可在形成封接过程中向记录电极内部施加正压或负压。
    18. 将微电极尖端移至脊髓最背侧区域，轻轻穿破脑脊膜。随后进行快速、短距离的横向移动，以松解脑脊膜（图3C 和 3C'）。
    19. 当微电极尖端穿过脑脊膜后，向前推进并略微抬高微电极，将脑脊膜从脊髓上拉开（图3D 和 3D'）。
    20. 将微电极向头端移动，跨越1至2个半节段，以暴露Rohon-Beard细胞（图3E 和 3E'）。
      注意：仅需解剖暴露少数Rohon-Beard细胞所需的最小范围脑脊膜。每次记录后，可进一步解剖以暴露更多Rohon-Beard细胞。在胚胎和幼虫中，Rohon-Beard神经元偶尔会在接触膜片钳微电极时发生爆发性放电。其他脊髓神经元无此现象，提示这可能是Rohon-Beard细胞特有的性质，例如其机械敏感性。支持这一观点的是，已测试多种溶液成分（例如，离子组成和渗透压），均未能阻止Rohon-Beard细胞的这种行为。
  2. 用于记录Rohon-Beard细胞的幼虫解剖
    注意：在7 dpf幼虫中，必须去除背侧脊髓周围的肌肉组织。在酶处理前，请先执行步骤3.1.1至3.1.15（以幼虫替代胚胎）。
    1. 为去除肌肉，将幼虫在0.05%胶原酶中孵育1分钟。
    2. 用任氏液冲洗标本约5次以去除胶原酶，随后再用细胞外液冲洗约5次，彻底清除残留胶原酶。
    3. 将记录室安装至记录装置的显微镜载物台后，继续完成后续解剖步骤。将一根硼硅酸盐厚壁膜片钳微电极（图2B，底部）连接至电极夹持器，并通过轻轻摩擦硅胶室底部的方式轻折微电极尖端。
    4. 使用轻微破损的微电极剥离肌肉，暴露背侧脊髓。为从标本中移除肌纤维，通过连接至电极夹持器出口的管路施加负压。在施加负压的同时，使用微操纵器沿肌纤维长度方向移动微电极。
      注意：目标是先用微电极机械性松解肌肉，再通过负压吸除单个肌纤维。在去除肌肉过程中，微电极偶尔会被吸入的组织堵塞。
      1. 为清除堵塞，将微电极轻轻摩擦记录室底部，略微破坏尖端，同时通过管路吹气以排出内容物。
        注意：若微电极尖端变得过大，可能需要更换新的微电极。在去除靠近脊髓周围膜层（即脑脊膜）的肌肉层时，微电极尖端尺寸尤为关键（较小的尖端可实现更精确的操作）。
    5. 使用新的微电极（图2B，底部），按照步骤3.1.18–3.1.20所述方法去除脑脊膜。

胚胎发育阶段的显微图像与示意图，突出显示结构特征。
图4：斑马鱼脊髓的侧向解剖。 以侧向固定斑马鱼胚胎有助于接触运动神经元。在直立显微镜下进行肌肉去除及脑膜解剖以暴露运动神经元，显微镜配备40X水浸物镜（参见 图2). (A) 运动神经元的胞体位于脊髓的腹侧和外侧。将胚胎固定在记录 chamber 中，使其背侧朝向电极架。注意缝合胶硬化后呈白色（星号）。一旦后脑被横切（a），在某一位置对皮肤进行数次浅表切割b) 使用玻璃微量移液管在后脑尾侧进行。额外的浅层切口（c），垂直于第一组（b），形成一个皮肤瓣，便于用镊子夹住以去除皮肤。B-G) 一支空的玻璃微电极，拉制成短而尖细的尖端（图2B, 底部），并固定在电极夹持器上。使用显微操作器移动微移液管，以进行后续精细解剖并去除肌肉组织。B) 通过轻轻将玻璃微量移液管尖端刷过腔室底部，使其尖端轻微断裂，形成锯齿状末端并增大管口直径。在施加负压的同时，将微量移液管沿肌纤维长轴方向移动。每次仅去除一层肌纤维，以防止破坏下方的脑膜结构。在胚胎样本中，应首先去除最背侧的肌层，因为这些肌层通常较薄。尾部更靠后的半节段皮肤不予去除（箭头). (C一个半体节中背部的一半肌肉已被移除（箭头). (D黑色线条标示出一个无肌纤维的半节段，其脊髓表面由完整的脑膜覆盖（*). (E-E'使用微量移液器，在运动神经元胞体背侧稍偏的位置对脑膜施加压力。快速、短促的横向移动微量移液器，可刺穿脑膜。F-F'将微移液管向前腹侧推进，朝向半节段的腹侧区域，并轻轻上提，以分离脑膜与神经组织。G-G') 沿半脊髓节段向头侧移动微移液管以横切脑膜。神经元随即从暴露的脊髓中露出，此时可被膜片钳电极接触。箭头). 比例尺 = 500 µm 在（A）中；比例尺 = 100 µm 在B-G中（如图B所示）。

  1. 用于运动神经元和中间神经元记录的胚胎解剖
    1. 将胚胎置于含有任氏液的解剖皿中，并用三卡因固定胚胎，操作同步骤 3.1.1。
    2. 将胚胎侧向固定，使其背侧朝向对操作者最方便的一侧（通常取决于利手性）。执行步骤 3.1.2–3.1.17，并确保胚胎始终紧贴硅胶基底（图 4A 和 4A'）。
    3. 使用管壁较厚的硼硅酸盐玻璃微电极，将其尖端折断至约 25 µm，用于刮除并吸除肌肉组织，暴露脑脊膜，操作方法如步骤 3.2.4–3.2.4.1 所述（图 4B–4D）。
    4. 当目标半节段的肌肉层被清除后（图 4D），更换为尖端完整的新玻璃微电极（图 2B，底部）。在目标神经元背侧位置刺破脑脊膜。通过显微操作器将微电极压向脑脊膜，然后迅速横向移动，以撕裂并穿透脑脊膜（图 4E 和 4E'）。
    5. 脑脊膜破裂后，推进并上提微电极，将脑脊膜从脊髓上掀起（图 4F 和 4F'）。将微电极向头端移动，沿半节段长度方向撕开脑脊膜（图 4G 和 4G'）。
      注意：对 Rohon-Beard 细胞和初级运动神经元进行记录时，解剖仅需清除目标区域周围的脑脊膜。相反，若需记录中间神经元和次级运动神经元，则必须移除脊髓内阻碍接近目标细胞的其他神经元。后一种情况下，由于脊髓环路受到广泛破坏，研究仅限于分析细胞固有的膜电学特性。

4. 脊髓神经元的电生理记录

  1. 记录Rohon-Beard细胞和运动神经元时，使用硼硅酸盐厚壁玻璃毛细管，将其拉制成充满电极内液后电阻约为3 MΩ的微电极（图2B，底部）。
    1. 在将微电极浸入浴液前，通过连接电极夹持器的管路轻轻吹气，施加正压。
      注意：正压可防止碎屑堵塞微电极尖端，通过将三通旋塞阀转至关闭位置来维持正压。当微电极接近目标神经元时，正压会在细胞膜上产生明显的压痕，这一现象可作为微电极已接近到位、可开始形成封接的有用提示。
    2. 将旋塞阀转至开放位置以释放正压，同时通过吹嘴施加轻微的负压吸引。
    3. 当细胞膜与微电极尖端之间形成吉欧姆（GΩ）级封接后，施加短暂的吸力脉冲以破裂膜片，实现全细胞记录构型。
    4. 建立稳定的全细胞记录构型后，若输入电阻为500 MΩ且串联电阻为10 MΩ，即可在电压钳或电流钳模式下进行记录。

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结果

我们已成功从17 hpf胚胎至7 dpf幼鱼的Rohon-Beard神经元中记录到电生理信号（图5A 和 5B）。记录Rohon-Beard细胞时，样本以背侧朝上方式固定。此种固定方式可根据其浅表的背侧位置和较大的胞体尺寸明确识别Rohon-Beard细胞。此外，这些神经元典型的超极化静息膜电位也可进一步确认其身份（图5，插图表）6,54。同时，作为初级感觉神经元，Rohon-Beard神经元缺乏突触输入，因此在无电刺激的情况下，采用电流钳模式记录时不应出现膜电位的变化（图5B'）。自首次在斑马鱼中对Rohon-Beard细胞进行电生理记录以来6，已构建多种转基因品系（例如，Tg(islet2b:gfp)、Tg(ngn:gfp) 和

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讨论

本文所述方法可在对斑马鱼胚胎脊髓进行最小程度解剖后，实现对其感觉神经元和运动神经元的电生理及形态学表征。神经元在至少1小时内保持健康状态，该时间为本记录实验的时间限制。实验中采用标准的全细胞记录模式以及核膜片记录模式对神经元进行记录；后一种方法可最大程度减少空间钳制问题，从而避免离子电流生物物理特性详细研究的受限9。

一个重要的挑战是实现胚胎或幼体在记录室中的牢固附着，以便去除皮肤并进行有限的解剖，从而暴露目标神经元。此外，样本还需在整个全细胞膜片钳记录过程中稳定固定于记录室中。本文介绍了一种利用兽用缝合胶将胚胎或幼体粘附于解剖/记录室的方法，该方法此前已被用于其他模式生物（例如，果蝇）的解剖63。根据我们培训他人的经验，最关键的步骤是精确控制微量胶水的施加。本文还讨论了一种胶水分配装置，该装置可通过施加负压或正压，将胶水吸入或推出微移液管尖端。使用缝合胶可将胚胎和幼体牢固地固定在记录室中，并可根据需要以背侧朝上或侧向的方式进行定位，从而为多种神经元提供不同的操作通路。...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（RLM 获 F32 NS059120，ABR 获 R01NS25217 和 P30NS048154）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
真空滤器/储存瓶，0.22 mm 孔径Corning431096
注射器滤器，0.2 mmWhatman6780-2502
TricaineSigmaA-5040氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 
α-bungarotoxinTocris11032-79-4
河豚毒素Tocris4368-28-9
Alexa-549 肼盐Molecular ProbesA-10438荧光染料
Spin-X 离心管滤器Corning8161
玻璃显微镜载玻片Fisher12-550C
Sylgard 硅橡胶弹性体试剂盒Dow Corning184硅橡胶弹性体
培养皿Falcon351029
硼硅酸盐玻璃毛细管Harvard Apparatus30-0038内径和外径分别为 0.78 和 1.0 mm（薄壁玻璃毛细管）
硼硅酸盐玻璃毛细管Drummond Scientific1-000-1000-100内径和外径分别为 1.13 和 1.55 mm（厚壁玻璃毛细管）
微型带倒钩聚丙烯接头 Cole-Palmer6365-90
Vetbond 组织粘合剂 3M1469SB
胶原酶 XISigmaC7657
微电极拉制仪Sutter Instruments Model P-97 
放大器Molecular DevicesAxopatch 200B
前置放大器Molecular DevicesCV203BU
电动显微操作器  Sutter InstrumentsMP-285
Tygon 软管Fisher14-169-1B内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸，壁厚 1/32 英寸（柔性实验室软管）
电极夹持器Molecular Devices1-HC-U
Pharmaseal 三通旋塞阀 BaxterK75
数据采集卡Axon InstrumentsDigidata 1440A
倒置显微镜 ZeissAxioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan 物镜Zeiss
数据采集与分析软件 Axon InstrumentsPClamp 10 - Clampex 和 Clampfit 
微移液管拉制仪Sutter InstrumentsModel P-97
名称公司目录编号备注
解剖与记录溶液（单位：mM）
除细胞内溶液外，所有溶液经滤膜（0.22 mm 滤杯）过滤后，室温（RT）保存可稳定约 2–3 个月。
细胞内溶液经（0.2 mm 注射器滤器）过滤后，分装成小份，于 -20 °C 冻存，使用当天单独解冻。 
解剖/Ringer’s 溶液145 NaCl，3 KCl，1.8 CaCl2·2H2O，10 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节）
移液管（细胞内）记录溶液135 KCl，10 EGTA-酸，10 HEPES；pH 7.4（用 KOH 调节）。
浴液（细胞外）记录溶液/电压钳与电流钳125 NaCl，2 KCl，10 CaCl2·2H2O，5 HEPES；pH 7.4（用 NaOH 调节）。
Alexa-594 肼盐储备液。 用 ddH2O 配制 13.2 mM 储备液，分装（约 100 µl），-20 °C 保存。使用时，用移液管溶液将储备液稀释 132 倍，终浓度为 100 mM。稀释后，用离心管滤器过滤含 Alexa-594 的移液管溶液 。
名称公司目录编号备注
固定剂
0.4% 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）用 0.2 M Tris（pH 9）配制 0.4% 储备液（0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris）
用 NaOH 调节 pH 至 7，-20 °C 保存。
使用时，用胚胎培养基将储备液稀释约 25 倍。
250 mM α-bungarotoxin用 ddH2O 配制 250 mM 储备液（1 mg/500 mL），分装成 100 µL 份，-20 °C 保存。
使用时，用细胞外溶液稀释 2,500 倍，终浓度为 100 nM。
1 mM 河豚毒素用 ddH2O 配制 1 mM 储备液（1 mg/3 mL），分装成 100 µL 份，-20 °C 保存。
使用时，用细胞外溶液稀释 2,000 倍，终浓度为 500 nM。

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斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备
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